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实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延深。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
一、实验目的1. 掌握血糖测定的原理和方法。
2. 熟悉血糖测定仪器的操作流程。
3. 了解血糖在人体代谢中的重要性。
二、实验原理血糖测定是通过检测血液中的葡萄糖浓度来评估血糖水平。
常用的血糖测定方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖氧化酶-氧电极法等。
本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定。
葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖与氧气反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的催化下分解为水和氧气，氧气在电极上还原，产生电流，电流大小与葡萄糖浓度成正比。
三、实验设备与试剂1. 实验设备：血糖测定仪、微量移液器、移液管、一次性采血针、酒精棉球、消毒液等。
2. 实验试剂：葡萄糖氧化酶试剂盒、葡萄糖标准品、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）准备标准溶液：将葡萄糖标准品用蒸馏水稀释成不同浓度的标准溶液。
（2）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将标准溶液分别加入测定管中。
（3）开启血糖测定仪，依次测定各标准溶液的血糖浓度，记录数据。
（4）以葡萄糖浓度为横坐标，测定值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血糖测定（1）用酒精棉球消毒采血部位，用一次性采血针对准静脉，待血液流出后，用消毒液消毒采血针。
（2）用微量移液器吸取适量血液，加入测定管中。
（3）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将测定管放入测定仪中。
（4）开启血糖测定仪，待测定仪显示血糖浓度后，记录数据。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.0037x + 0.0035，R² = 0.9987。
2. 血糖测定本次实验测得血糖浓度为4.5 mmol/L。
六、实验讨论1. 本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定，操作简便、快速，准确性较高。
2. 在实验过程中，要注意控制操作误差，如准确配制标准溶液、正确设置测定仪等。
3. 血糖测定对于糖尿病等疾病的诊断和治疗具有重要意义，本实验有助于加深对血糖测定原理和方法的理解。
蛋白质生化实验报告生殖免疫研究所薛樱子学号：1133111003实验一溶液中蛋白质浓度的测定一光吸收法（测量范围：0.1—2mg）1实验原理：由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值OD280nm与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据。
纯蛋白的A280/A260为 1.8，纯核酸的A280/A260为2步骤：2.1）打开仪器的电源开关（接220V交流电），打开比色槽暗箱盖，选择光源，选档，选波长，用调零旋钮调暗电流至0 。
2.2）将空白对照样品和待测溶液装入石英比色杯2.3）将仪器的比色槽暗箱合上，比色槽处于蒸馏水（或校正缓冲液）校正位置，旋转光量调节器使电表指针正确处于0 。
2.4）拉出比色槽手柄拉杆使比色槽处于样品位置读数。
2. 5）在260nm和280nm分别读数（分别用缓冲液调0），根据上表查处相应蛋白浓度，根据喜事倍数计算原溶液蛋白浓度，根据体积计算总蛋白量。
3结果与分析：A280=0.571 A260=0.340根据公式：蛋白浓度=1.5 ×A280 —0.75 ×A260=1.5×0.571—0.75×0.340=0.6015也可以根据蛋白质和核算含量折算图表画出一条直线估算蛋白质的浓度。
结果说明我的蛋白样品浓度是0.6015mg/ml。
二Folin—酚法（测量范围：10-300ug/ml）1实验原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
2试剂：2.1）甲液：１，4%碳酸钠；2，0.2n氢氧化钠；3，1%硫酸铜；4,2%酒石酸钾钠。
1和2，4溶于500ml水中，然后和4以50：1混合。
高级生化技术实验报告实验目的本实验旨在探究和应用高级生化技术，进一步加深对生物体内化学过程的理解，并研究其在医学、农业等领域的应用前景。
实验材料与方法材料准备- 实验用细胞培养基- 细菌培养板- RNA提取试剂盒- 蛋白质表达载体- Plasmid DNA纯化试剂盒实验步骤1. 细胞培养：使用实验用细胞培养基培养细胞，维持合适的环境条件。
2. 细菌培养：将细菌样品接种在细菌培养板上，并放入恒温培养箱中进行培养。
3. RNA提取：使用RNA提取试剂盒，按照说明书的指导进行细胞中RNA的提取。
4. Plasmid DNA纯化：将含有目标基因的细菌培养物收集，使用Plasmid DNA 纯化试剂盒纯化目标基因。
实验结果通过细胞培养和细菌培养，我们成功获得了足够数量的细胞和细菌样品。
通过使用RNA提取试剂盒和Plasmid DNA纯化试剂盒，我们也成功提取到了目标物质RNA和目标基因。
结果分析获得RNA和纯化目标基因为进一步的研究和应用提供了坚实的基础。
RNA的提取可以用于研究细胞基因表达水平，了解细胞内的生化过程。
而纯化的目标基因可以用于进一步的基因编辑、转基因技术等。
应用前景高级生化技术作为现代生物科学的重要组成部分，对医学、农业、环境保护等领域都具有重要意义。
本实验中所使用的技术可以应用于：- 医学研究：通过研究细胞基因表达和基因功能，探寻疾病发生的机制，找到新的药物靶点，并为疾病的防治提供新的思路。
- 农业领域：通过基因编辑和转基因技术，提高植物的抗病虫害能力、产量和品质，为粮食安全和农作物种植提供支持。
- 环境保护：通过分析细菌在自然界中的作用和生化功能，寻找利用细菌来降解有害物质、污染物的方法，提高环境保护的效率。
总结本实验成功应用了高级生化技术，通过细胞培养、细菌培养、RNA提取和Plasmid DNA纯化等步骤，获得了目标物质。
基于这些成果，我们探讨了高级生化技术在医学、农业和环境保护等领域的应用前景。
生化分离方法：离心、层析、电泳和膜分离等生化分析方法：重量法、化学法、分光光度法、酶法、色谱法生化制备方法：生物大分子制备的前处理、分离纯化、浓缩与干燥、超临界流体提取法、萃取与相分离、结晶、样品的保存生化分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术等。
1 离心技术1.1 基本原理离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。
应用：各种生物样品的分离和制备。
如分离收集细胞、细胞器及生物大分子物质；提纯、鉴定生物大分子；分离化学反应的沉淀物。
生物样品悬浮液在离心力作用下使悬浮的微小颗粒以一定速度沉降，从而与溶液分离，其沉降速度与颗粒的质量、大小和密度相关。
相对离心力离心力因离心半径不同而不同，因此用“相对离心力” （relative centrifugal force，RCF）表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。
RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。
1.2 离心分类根据离心原理，按照实际工作的需要，设计了许多离心方法，大致可分三类：差速离心法(differential velocity centrifugation)速率区带离心法（rate zonal centrifugation）等密度离心法（isopycnic centrifugation）1.2.1 差速离心法利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。
操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。
差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。
生化实验方法和技术嘿，你要是对生命的奥秘感兴趣，那生化实验方法和技术可就像一把神奇的钥匙，能打开那扇神秘的大门呢！我自己就曾经一头扎进这个奇妙的世界，和我的小伙伴们一起探索，那过程就像是一场刺激的冒险。
我记得有一次，我们要做蛋白质的提取实验。
这就好比是从一个大宝藏里，把最珍贵的宝石找出来。
我们先准备好材料，各种瓶瓶罐罐、试剂，那场面就像厨师准备做一道超级复杂的菜一样。
你看，新鲜的组织样本就像是做菜的食材，得小心翼翼地处理。
我们一边做，一边还互相打趣，“嘿，这要是搞砸了，可就像把好好的牛排煎糊了一样惨啊！”在生化实验里，电泳技术那可是相当酷的。
想象一下，那些蛋白质或者核酸分子就像一群小小的运动员，在凝胶这个跑道上赛跑。
我们给它们通上电，就像给运动员们吹起了起跑的哨子。
不同大小的分子跑得快慢不一样，这多有趣啊？我们几个眼睛都不敢眨一下，紧紧盯着那些条带，就盼着能看出点什么来。
“哇塞，你看这个条带，好清晰啊！”小伙伴兴奋地叫着，那感觉就像发现了新大陆一样。
还有PCR技术呢，这简直就是生化实验里的魔法。
它能把一小段DNA像变魔术一样复制好多好多份。
我们当时做的时候，感觉自己就像魔法师。
那些小小的引物就像是魔法咒语，能精准地找到要复制的DNA 片段。
这过程可不能有一点马虎，稍微出点差错，就像魔法失控了一样，结果可能就完全不对了。
我当时就特别紧张，一直念叨着：“可千万别出错啊，这就像走钢丝一样，一失足就完了。
”说到酶活性的测定实验，那也是很有意思的。
酶就像是一个个勤劳的小工匠，在生物体内不停地干活。
我们要测定它们的活性，就像是在考察这些小工匠的工作效率。
我们得精确地控制各种条件，温度啊，pH值啊，就像给小工匠们创造合适的工作环境一样。
有个小伙伴不小心把温度调错了一点，大家都着急了，“哎呀，这可不行啊，这就像让大冬天的建筑工人在冰天雪地里干活，效率肯定不行啊！”生化实验里的色谱技术，就像是一个超级精细的分拣机。
实验一 DNS（3,5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖一、实验目的掌握还原糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；精密pH试纸。
2．主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3．试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂四、操作步骤1．制作葡萄糖标准曲线取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
一、实验目的1. 理解凝胶过滤的原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶过滤在蛋白质分离纯化中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种基于分子大小差异的分离技术。
层析柱内填充带有小孔的凝胶颗粒，凝胶颗粒的孔径大小不同。
当含有不同大小蛋白质的混合溶液通过层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔隙中，从而在层析柱中停留时间较长；而大分子蛋白质则无法进入孔隙，在层析柱中的停留时间较短。
因此，不同大小的蛋白质得以分离。
三、实验材料1. 蛋白质混合样品（如血红蛋白、肌红蛋白等）2. 凝胶过滤柱（如Sephadex G-75）3. 缓冲液（如磷酸盐缓冲液）4. 离心机5. 分光光度计6. 移液器7. 玻璃棒8. 实验记录表格四、实验步骤1. 柱的制备：将凝胶过滤柱垂直放置，用缓冲液充分洗涤，去除凝胶颗粒表面的杂质。
2. 样品的制备：取一定量的蛋白质混合样品，用缓冲液稀释至适当的浓度。
3. 样品的加载：将样品缓慢加入层析柱的顶部，使其自然流下。
4. 洗脱：用缓冲液以恒定流速（如1 mL/min）洗脱层析柱，收集洗脱液。
5. 检测：使用分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，记录不同洗脱峰的位置和峰面积。
6. 收集：根据蛋白质含量变化，收集不同洗脱峰的蛋白质溶液。
五、实验结果与分析1. 洗脱曲线：根据洗脱曲线，可以观察到不同大小的蛋白质在层析柱中的洗脱顺序。
通常，小分子蛋白质先被洗脱，而大分子蛋白质后被洗脱。
2. 蛋白质分离效果：通过比较不同洗脱峰的峰面积，可以评估凝胶过滤的分离效果。
峰面积越大，说明蛋白质含量越高，分离效果越好。
六、实验讨论1. 凝胶过滤是一种高效、简便的蛋白质分离纯化方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
2. 凝胶过滤的分离效果受到凝胶类型、柱径、流速等因素的影响。
在实际应用中，需要根据具体实验目的和样品特性选择合适的凝胶类型和操作条件。
3. 凝胶过滤可以与其他分离技术（如SDS-PAGE、电泳等）联合使用，进一步提高蛋白质的分离纯化效果。
实验一鸡卵类黏蛋白的分离与纯化【目的要求】1、掌握从鸡蛋清中提取鸡卵类黏蛋白的原理及方法。
2、了解凝胶过滤层析、离子交换层析的工作原理，掌握基本操作技术。
3、掌握消光系数法测定蛋白质含量的原理及计算方法。
【实验原理】鸡卵类黏蛋白是由鸡蛋清中提取的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，常用于胰蛋白酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。
鸡卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂都相当稳定，而在碱性溶液中不稳定，尤其是当温度较高时会迅速失活。
它在10%三氯乙酸或50%丙酮溶液中有较好的溶解度。
选择合适的pH值及适当浓度的三氯乙酸或丙酮，可以从蛋清中除去大量的非卵类黏蛋白，或得鸡卵类黏蛋白的粗提液。
含盐或其他小分子的蛋白质混合溶液，在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙以较快的速速最先流出柱外，而相对分子量较低的盐或其他小分子物质则可以进入凝胶内部的微孔中，所以向下移动的速度较慢而最后流出柱外。
这样鸡卵类黏蛋白粗提液经过凝胶柱层析后可以除去小分子物质（盐）而得到初步纯化。
初步纯化的鸡卵类黏蛋白，经过DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白，得到鸡卵类黏蛋白的纯溶液。
本实验先将鸡蛋清先用三氯乙酸溶液处理，离心后去除沉淀物，然后由丙酮分级沉淀获得粗品，经SephadexG-25柱层析脱盐，DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化，再经透析及丙酮沉淀进一步纯化，最后真空干燥可得到鸡卵类黏蛋白合格产品。
鸡卵类黏蛋白在280nm处得消光系数A 1%1cm=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413,据此可以测定鸡卵类黏蛋白的含量。
【试剂与器材】1、试剂（1）丙酮（2）新鲜鸡蛋（3）0.5mol/L HCL溶液（4）Sephadex G-25 (5) DEAE-纤维素粉（6）10% pH 1.15三氯乙酸（TCA）：将称取的三氯乙酸置烧杯中，加入2/3体积的蒸馏水溶解，用6mol/L的NaOH调至约pH 1.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH 1.15，最后补充水到所配体积。
（7）0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液（8）0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液（9）0.3mol/L NaCl-0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液2、器材恒温水浴 752 紫外分光光度计离心机 pH酸度计核酸蛋白质检测仪真空干燥器层析柱（25×300mm, 15×200mm）贮液瓶离心管布氏漏斗（80mm）玻璃烧结漏斗（G-3）抽液瓶沸水浴【操作方法】1、鸡卵类黏蛋白的提取（1）取1个鸡蛋蛋清，加入等体积的10%，pH 1.15三氯乙酸溶液，这时出现大量白色沉淀，充分搅匀后，此时溶液的pH值应是3.5±0.2，若偏离此值，用5mol/L NaOH或5mol/L HCL调至pH值3.5。
继续搅拌10 min，室温下静置4h以上。
（2）4000r/min 离心10 min。
收集清液，再用滤纸过滤，除去上清液中脂类物质及其它不溶物。
收集滤液转入500 mL烧杯中。
检查滤液的pH值是否为3.5，否则要调到pH3.5。
然后缓慢加入3倍体积预冷的丙酮，用玻璃棒搅匀并用塑料薄膜封严，冰浴放置2～4h。
（3）待鸡卵类黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出部分上清液，剩余浑浊液转到离心管中，3500r/min 离心10 min，弃去上清液，将盛有沉淀的离心杯置于真空干燥器内，抽气，除去残留丙酮。
（4）将离心管中鸡蛋黏蛋白加20 mL蒸馏水，玻璃棒搅拌溶解，滤纸过滤除去不溶物。
将滤液用Sephadex G-25层析柱脱盐或透析袋除盐。
2、Sephadex G-25层析柱脱盐（1）凝胶的处理：量取100 mL Sephadex G-25（已溶胀好）入250 mL烧杯中，加入200mL 0.02 mol/L ，pH6.5的磷酸盐缓冲液，于沸水浴中加热1h。
冷却后用真空干燥器脱气。
（2）装柱：选用25×300mm层析柱，垂直夹与铁架台上。
关闭层析柱出水口，然后在搅拌下将浆状的凝胶缓缓地倾入柱中，使之自然沉降，打来柱出水口，调节合适流速，使凝胶继续沉集。
待沉集的胶面上升之距柱上口3～5 cm时关闭层析柱出水口。
（3）平衡：打开核酸蛋白检测仪及记录仪电源开关。
将贮液瓶中加入0.02 mol/L， pH6.5的磷酸盐缓冲液，与柱上端接口连接。
再将柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口相连。
开启柱出水口夹子，调节流速2 mL/min，用约2倍体积的缓冲液平衡。
流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线即可上样。
（4）上样：关闭柱上、下口夹子，用滴管小心吸出层析柱上层液体。
打开柱出水口，使残余液体降至与胶面相切，立即关闭出水口。
吸取蛋白提取液在距离床面1mm处沿柱内壁轻轻转动加到凝胶床表面，打开出水口夹子，调节流速15 d/min，使样品流入凝胶床内，直到与胶面相切，立即用1mL缓冲液冲洗柱壁，使其缓慢进入凝胶床内，然后在胶面上端加入3～4 cm高度洗脱液，并将上端接口与贮液瓶连接。
（5）洗脱：控制流速15 d/min，开始洗脱，在检测仪上观察到开始出峰时开始收集。
将收集的蛋白峰液体放置冰箱，准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。
3、DEAE-纤维素柱层析纯化通过上述方法得到的鸡卵类黏蛋白溶液中仍含有少量的卵清清蛋白。
由于二者的等电点不同，采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开。
（1）DEAE-纤维素的处理：称取10g DEAE-纤维素粉，置于250 mL烧杯中，加入150 mL 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡20 min。
然后用布氏漏斗抽滤，蒸馏水洗至pH 8.0左右，抽干。
再移至250 mL烧杯中，加入150 mL HCL溶液浸泡20 min，转移到布氏漏斗中，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯中，用150 mL 0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡15min，经真空干燥器脱气后装柱。
（2）装柱：选用15×200mm层析柱，垂直夹与铁架台上。
将脱气后的DEAE-纤维素装入柱内（装柱操作同上）。
用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可加样。
（3）吸附：将经Sephadex G-25脱盐后的卵类黏蛋白粗提液上样吸附，调节流速15d/min，待样品全部流入柱床后，再用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，目的是洗去未被吸附的杂质蛋白，直至基线稳定。
（4）改用含0.3mol/L NaCl的pH6.5磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰。
如果在前面的提取过程中条件控制的适宜，提取的鸡卵类黏蛋白是较纯的，洗脱时可能不出现鸡卵清蛋白峰（第I 峰）。
4、鸡卵类黏蛋白纯品的制备（1）透析除盐：将收集的卵黏蛋白装入透析袋内，对蒸馏水进行透析，隔一段时间换一次水，直至经1% AgNO 3 溶液检查无氯离子为止。
（2）调pH 值：量透析后卵黏蛋白样品体积，转移到烧杯中。
吸取1mL 透析液置小试管中（测定蛋白含量），剩余溶液小心用1 mol/L HCL 调至pH4.0。
（3）丙酮沉淀：加入3倍体积的预冷丙酮（若pH 值准确，此时应出现大量沉淀），用塑料薄膜封严，冰箱静置4h 或过夜。
（4）离心：虹吸出部分上清，将沉淀部分转移到离心管中，于3500 r/min 离心10 min ，弃去上清，收集沉淀。
（5）干燥：将盛有沉淀的离心管放入真空干燥器中干燥，即可得到透明胶状物得鸡卵类黏蛋白，保存好，以备鉴定其纯度实验用。
5、鸡卵类粘蛋白含量测定将待测透析液样片稀释5～10倍，以蒸馏水作参比，测定A 280 鸡卵类黏蛋白含量。
鸡卵类黏蛋白（mg/mL ）= ———————【结果处理】1、根据公式计算鸡卵类黏蛋白总含量（mg ）;2、鸡卵类黏蛋白的产率（%）=100 mL 鸡蛋清得到的鸡卵类黏蛋白的mg 数；3、绘制Sephadex G-25层析柱分离鸡卵类黏蛋白的层析图；4、绘制DEAE-纤维素离子交换柱层析分析鸡卵类黏蛋白的层析图。
【要点提示】1、在鸡卵类黏蛋白的制备过程中，最重要的环节是掌握好溶液的pH 值，这是实验成败的关键。
鸡卵类黏蛋白在10%，pH 3.5的三氯乙酸溶液中有很好的溶解度，只有小量得（约5%）沉淀，而鸡卵清蛋白则会大量（约95%）沉淀，因此，只要将提取液的pH 值严格控制在pH 3.5，可以将鸡卵类黏蛋白和鸡卵清蛋白基本分开，而且鸡卵类黏蛋白的产率也比较高。
2、经10%三氯乙酸提取鸡卵类黏蛋白的上清及DEAE-纤维素离子交换层析后的透析液都要用丙酮沉淀鸡卵类黏蛋白，在加丙酮之前，一定要先将溶液的pH 值精确调至所规定的范围，否则加入丙酮后不会出现沉淀或者只会出现极少的沉淀，而且事后难以弥补。
3、消光系数的定义：芳香族氨基酸在280nm 处有最大吸收峰。
蛋白质分子中含有芳香族氨基酸的数量以及分子的紧密程度有差异，在280nm 处的光吸收强弱不同。
在一定条件下，一种纯的蛋白质在280nm 处的光吸收值是一个常数。
符号A 1% 1cm 表示该蛋白质溶液在浓度为1%（W/V ），光程为1cm 条件下的吸光值。
【思考题】1、在鸡卵黏蛋白的提取分离及纯化过程中，直接影响产率的是哪几步？应注意什么？2、简述分离纯化鸡卵黏蛋白主要应用了蛋白质的什么性质及哪些生化技术？A 280×稀释倍数 0.413实验二 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子量【目的要求】1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
2、学习并掌握SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过硫酸铵（简称AP）共同作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE）。
蛋白质在PAGE时，它的迁移率取决于它所带静电荷以及分子的大小和形状等因素。
如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量而与所带电荷和形状无关。
因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
SDS是一种阴离子去污剂，能够破坏蛋白质分子内和分子间的氢键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质—SDS复合物。
强还原剂巯基乙醇可以打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。
一定量的SDS与蛋白质分子结合后，所带负电荷的量远远超过了蛋白质原有的静电荷，从而消除了不同蛋白质之间所带净电荷的差异。
