实验八、土壤微生物的分离和 纯化

微⽣物实验指导书-教材

微⽣物学实验指导书

⽬录

实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术 (3)

实验⼆培养基的配制 (8)

实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化 (11)

实验四微⽣物的接种技术 (14)

试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 (17)

实验六细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊ (20)

实验七⼤肠杆菌⽣长曲线的测定 (23)

实验⼋实验室环境和⼈体表⾯微⽣物的检查 (25)

实验九乳酸菌的检测 (28)

实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术

【⽬的要求】1. 学习并掌握棉塞制作的⽬的、原理及⽅法；

2. 学习并掌握玻璃器⽫清洗及包扎⽅法；

3.掌握⾼压蒸汽灭菌的基本原理及操作⽅法。

4.了解其它常⽤消毒灭菌技术原理及技术

【基本原理】

棉塞的作⽤有⼆：⼀是防⽌杂菌污染，⼆是保证通⽓良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较⼤的影响。

微⽣物学实验所⽤的器⽫，⼤多数要进⾏清洗、消毒、灭菌，才能⽤来培养微⽣物。玻璃器⽫的包扎⽅法正确合理，在使⽤过程中才能有效防⽌杂菌的污染。玻璃器⽫包扎好后，⼀般⽤⾼压蒸⽓灭菌法进⾏灭菌。

⾼压蒸⽓灭菌是将待灭菌的物品放在⼀个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的⽔沸腾⽽产⽣蒸⽓。待⽔蒸⽓急剧地将锅内的冷空⽓从排⽓阀中驱尽，然后关闭排⽓阀，继续加热，此时由于蒸⽓不能溢出，⽽增加了灭菌锅内的压⼒，从⽽使沸点增⾼，得到100℃以上的⾼温，导致菌体蛋⽩质凝固变性⽽达到灭菌的⽬的。此外，常见灭菌⽅法还有⼲热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。对空间灭菌常使⽤甲醛加⾼锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌⽅法。

【实验⽤品】

棉花，试管，培养⽫，纱布，三⾓瓶，棉线，量筒，⽜⽪纸（或旧报纸），LDZX-50KBS ⽴式⾼压蒸⽓灭菌锅，常⽤灭菌⽤具、药剂等等。

【⽅法步骤】

⼀、棉塞的制作

正确的棉塞要求形状，⼤⼩，松紧与试管⼝（或三⾓瓶⼝）完全适合，过紧妨碍空⽓流通，操作不便；过松则达不到滤菌的⽬的。制作过程见图1，包括取棉花、整理、折⾓、卷紧、成形、塞试管等步骤。塞上棉塞时，应使棉塞长度的1/3在试管⼝外，2/3在试管⼝内。

从土壤中分离分解纤维素的微生物

实验目的

1、利用特定的选择培养基和鉴定培养基从土壤中分离分解纤维素的微生物；

2、掌握刚果红染色的机理和操作。

实验原理

1、以纤维素喂唯一碳源的选择培养基能选择分离分解纤维素的微生物；

2、刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与水解后的纤维二塘和葡萄糖发生这种反应。

实验仪器与用具

除实验五中用到的外，还需要恒温振荡培养箱

实验材料和试剂

取自湿地或原生林地的土样（大于20g）

羧甲基纤维素钠，酵母粉，磷酸二氢钾，蛋白胨，琼脂粉，氯化钠，刚果红，硝酸钠，硫酸亚铁，硫酸镁，磷酸氢二钠，纤维素粉，蔗糖

（也可以用廉价的秸秆磨成粉末代替纤维素粉）

实验步骤

将称量好的0.1g蔗糖，0.002g硫酸亚铁，0.1g硫酸镁，0.2g磷酸氢二钠，0.2g硝酸钠，2g纤维素粉（秸秆粉） 倒入500ml锥形瓶内，再加入200ml蒸馏水，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀，得选择培养基，备用。 讲称量好的1.5g羧甲基纤维素钠，0.2g蛋白胨，0.1g酵母粉，0.25g氯化钠，0.2g磷酸二氢钾，0.1g硫酸镁，4g琼脂粉 加入另一个500ml锥形瓶内，再加入200ml蒸馏水，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀，得鉴定培养基，备用。

用5ml微量可调移液器向编号为1--5号的试管内分别加入9ml蒸馏水，塞上棉塞，备用。

讲配制好的选择培养基，鉴定培养基，5支装有蒸馏水的试管，包好的培养皿（最少9个），枪头 放入灭菌锅内在121度下灭菌20min。

灭菌后，取出灭菌锅内物品，放入超净台内，用酒精棉球擦拭超净台面和实验者的双手，点燃酒精灯，在酒精灯火焰附近将称量好的20g土样加入到选择培养基中，给锥形瓶封口，充分振荡摇匀。

将选择培养基放入恒温振荡培养箱内培养48h（震动培养箱转速为200r/min，控制温度为30度 ）。

等鉴定培养基冷却到不烫手时，在超净台内酒精灯火焰附近往每个培养皿内倒入20ml左右鉴定培养基，在超净台面轻轻摇匀，熄灭酒精灯，等培养基凝固后，将培养基平板倒置于超净台上。

微 生 物 学 实 验 报 告

（格式标准）

(生命科学专业)

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目录索引

实验一 油镜的使用和细菌的简单染色法 3

实验二 细菌的革氏染色与芽孢染色 5

实验三 常用培养基的配制 7

实验四 酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别 8

实验五、微生物大小的测定与显微计数 10

实验六 环境中微生物的检测和分离纯化 11

实验七 细菌鉴定中常用的生理生化反应 12

实验八 （综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 13

课程名称： 微生物学 实验班级：化生系生命科学本科

实验日期： 指导教师：黎勇

实验一 油镜的使用和细菌的简单染色法

〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。

〔基本原理〕

1. N·A=n·sinα

2. D=λ/2N.A

3. 目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。

4. 用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。

〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。

〔方法步骤〕：

（一） 油镜的使用

镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中 聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形 在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油 油镜转入正下方 侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触） 粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正） 仔细观察并绘图

土壤中微生物的分离与研究

一、实验目的

1.学习微生物纯系分离、培养方法。

2.掌握划线分离纯化微生物的方法。

3.掌握微生物生理生化反应的研究方法。

4.了解该菌种的生物学特征。

二、实验原理

土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。根际微生物与植物的关系特别密切，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响，而不同的根际微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物营养产生积极或消极的作用。

土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌数减少。

土壤中微生物以细菌数量最多，为几百万个/克土至几亿个/克土，有各种生理类群，营养类型多属异养型，鉴别染色多为革兰氏阳性。放线菌含量为几万个/克土至几百万个/克土，但其生物量不比细菌低，因为菌丝体积较大。土壤中真菌含量为几千个/克土至几十万个/克土，而其生物量常比细菌的大。

通过土壤微生物的分离与计数及划线纯化，涂布分离长出的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备用。涂布分离细菌的平板，温箱培养1d～2d后，然后挑取各单菌落的部分培养物，在预先制备好的平板上划线纯化。根据所得纯种菌，依次进行简单染色，革兰氏染色，芽孢染色，确定菌种的形态特征。然后根据伯杰手册确定菌种的大体范围，有针对性的进行生理生化实验，从而最终确定菌种所在的属。

三、实验材料

1.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、固体油脂培养基、固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基。

2.染液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、1%结晶紫水溶液、20%硫酸铜水溶液、95%乙醇、卢戈氏碘液、甲基红指示剂、乙醚、吲哚试剂等等。