土壤微生物的分离和观察
[适用对象] 环境科学专业。
[实验学时] 3学时
一、实验目的
1、通过对周围环境中微生物的观察，理解无菌操作原理，了解微生物的普遍存在性。
2、通过从土壤中分离纯化微生物，掌握无菌操作技术。
二、预习与参考
自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须从混杂的群体中分离得到该微生物的纯培养。也就是说培养物中说有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一种细胞的后代。稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线法是分离纯化微生物和微生物计数的常规方法。这几种方法均不需要特殊的仪器设备，一般情况下都能顺利进行，达到好的效果。
三、实验内容
1、配制肉汤蛋白胨固体培养基平板（每组15个）
（1）牛肉膏5g；
（2）蛋白胨10g；
（3）NaCl 5g； （4）琼脂20g；
（5）自来水1000mL pH 7.5，0.1MPa，121℃来菌20min。
2、无菌生理盐水
（1）250mL三角瓶中加入99mL 0.9% NaCl （加20个左右的玻璃珠）；
（2）250mL三角瓶中加入50mL 0.9% NaCl （作10倍稀释用）。
3、从土壤中分离和纯化微生物
（1）采土样
选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤数10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。
（2）制备土壤稀释液
称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。用1mL的无菌吸头从中吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，10-7各种稀释度的土壤溶液。
土壤中固氮微生物的分离与纯化
一、实验目的
1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学习微生物纯系分离、培养方法。
3、掌握划线分离纯化微生物的方法。
4、对提取的土样进行微生物的分离、纯化培养，并进行简单的形态鉴定
5、了解该菌种的生物学特征。
二、实验原理
农业生产不仅要求高产、稳产，而且要求品质优良。长期以来，为确保农产品高产丰收，人们大量使用化学农药化肥，使得生态环境每况愈下，十分不利于农业可持续发展。生物肥料由于具有增加土壤生物多样性、改善农产品品质、能自我更新增殖和永续利用的特性，其发展备受关注。
微生物肥料是指应用于植物或土壤环境中有生物活性，起肥料效用、或以肥料方法施用的，以微生物活性生物体或其代谢产物为主要作用因子的生物制剂或肥料制品[1]。固氮菌可将空气中N2还原为可被作物吸收利用的NH4+，由于共生固氮菌具有宿主专一性，所以应用范围窄，而自生固氮菌不受这些因素限制，固氮能力较强，还能产生吲哚乙酸等植物激素，刺激植物生长，促进增产，其生产和使用很方便[3]。因此，试验将从农田土壤中分离得到自生固氮菌，为研究开发新型生物氮肥提供理论依据。
通过土壤微生物的分离与计数及划线纯化，涂布分离长出的单菌落，须经划线纯化，再转斜面培养后保藏备用。涂布分离细菌的平板，温箱培养1d～2d后，然后挑取各单菌落的部分培养物，在预先制备好的平板上划线纯化。根据所得纯种菌，依次进行简单染色，革兰氏染色，芽孢染色，确定菌种的形态特征。然后根据伯杰手册确定菌种的大体范围，有针对性的进行生理生化实验，从而最终确定菌种所在的属。
三、实验材料
1．土样
浙江理工大学百果园土壤
2．培养基
阿须贝培养基：葡萄糖10g，KH2PO4 0.2g，CaSO4 0.2g，NaCl 0.2g ，CaCO3 0.2g， MgSO40.2g ，1000mL水， pH 7.2
无氮培养基：
1 实验二 从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定
土壤是微生物生活的大本营，微生物的种类和数量极其丰富，从土壤中可分离、纯化得到许多有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程即微生物的分离纯化，常用平板分离法，为获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、T、氧气等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂抑制其他菌生长，从而淘汰其他不需要的微生物，如高氏一号，加酚液为抗菌药物，抑制细菌，马丁氏加孟加拉红、氯霉素（类抗生素，还有红霉素、磺胺，抑制细菌和放线菌，不抑真菌），再用平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。
第一部分 培养基的配制
一、 实验目的和内容
目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。
内容：1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制；2、高氏一号培养基的配制；
3、马丁氏培养基的配制。
二、 实验材料和用具
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、氯霉素、1mol/L
NaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4.3H2O、MgSO4.7H2O、FeSO4.7H2O。
试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。
三、 操作步骤
（一） 牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15~20g、水1000ml、pH7.4~7.6。
1、称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速，并及时把试剂瓶盖紧.
2、加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。
- 1 - 土壤微生物的分离和纯化实验报告
土壤微生物的分离和纯化实验报告
实验目的
本次实验的目的是利用物理、化学和生物性等技术，从原始土壤样品中分离、筛选和纯化微生物株，并对分离出的微生物株进行形态学特征观察和分类鉴定。
实验材料
1. 原始土壤样品
2. 饱和淡盐水
3. 10% (v/v) 的平衡磷酸盐溶液
4. 0.85% (w/v) 的千顷盐溶液
5. 2% (w/v) 的体糖酸钠溶液
6. 氯仿
7. 板藻素
8. 无菌玻璃管
实验步骤
1. 将原始土壤样哮放入摇瓶内，加入淡盐水攪拌均匀，进行粗筛提取。
2. 将1ml混合液放入无菌玻璃管，8次补充磷酸盐溶液悬浮液进行细筛提取。
3. 将细筛提取的悬浮液转移到新的无菌容器中，加入盐溶液攪拌均匀。 - 2 - 4. 加入盐溶液之后，用氯仿消毒，然后加入体糖酸钠溶液留取微生物株悬浮液。
5. 使用板藻素进行单菌株筛选，筛选出单菌株。
6. 将筛选出的单菌株进行形态学特征观察和分类鉴定。
结果
本次实验中，经过物理、化学和生物性等技术操作，成功分离出一株微生物株，并对其进行形态学特征观察和分类鉴定，得出结果：该株微生物属于假单胞菌科，耐盐性，呈菌封形态。
结论
本次实验成功分离纯化出一株微生物株，该株微生物属于假单胞菌科，耐盐性，呈菌封形态。
