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1.2.1 微生物的基本培养技术一、选择题1.下列关于纤维素分解菌分离和鉴定的叙述，正确的是（）A.要从土壤中将纤维素分解菌分离出来，应该将它们接种在含指示剂的鉴别培养基上B.分离分解纤维素的微生物时把纤维素作为唯一氮源C.对纤维素分解菌进行选择培养时，要选用液体培养基，原因是纤维素分解菌在固体培养基上不能生长D.刚果红染色法筛选纤维素分解菌使用的培养基属于鉴别培养基2.下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是（）A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌B.接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧C.接种后的培养皿要倒置，以防培养基污染D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基3.微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是（）①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌.A.①③B.②④C.③⑤D.④⑥4.下列有关微生物实验室培养的叙述，不正确的是（）A.在熔化琼脂时，需要控制火力并不断搅拌，以免发生焦糊B.灼烧、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等都属于无菌技术C.样品中活菌数量统计时，接种方法应采用平板划线法D.用平板培养基培养微生物时，应将平板倒过来放置5.广泛用于牛奶、奶酪、啤酒等产品的消毒方法是（）A.高压蒸汽灭菌B.巴氏消毒法C.酒精消毒D.火焰灼烧6.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时（）A.葡萄糖在培养基中含量越多越好B.尿素在培养基中含量越少越好C.尿素分解菌有固氮能力，故培养基中尿素为无机氮D.尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为有机氮7.如下表所示为某微生物培养基的配方，请回答错误的是（）A.依物理性质，该培养基属于液体培养基B.依用途划分，该培养基属于选择培养基.C.根据培养基原料，所培养微生物的同化作用的类型是自养生物D.该培养基中的碳源是（CH2O）8.下列关于培养基的叙述正确的是（）A.配置培养基时要依据微生物的营养需求B.培养细菌时一般需调整pH为中性或酸性C.是碳源的物质不可能同时是氮源D.配置液体培养基的目的是为了观察菌落特征9.微生物的实验室培养过程中，培养基配制后的分装一般有两种：一种为分装至试管；一种分装至培养皿，称为倒平板。
土壤中分离纤维素分解菌的实验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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分解纤维素微生物的分离与纯化实验操作与注意事项一、引言纤维素是一种重要的天然生物质，广泛存在于植被、农业废弃物和生活垃圾中。
分解纤维素的微生物对于生物能源转化、环境修复和生物材料制备具有重要意义。
本实验旨在介绍如何进行纤维素分解微生物的分离与纯化，以便更好地研究和利用这些微生物。
二、材料与设备1. 纤维素基质（例如木材粉末、花生壳碎屑等）2. 无菌培养基（适合目标微生物的培养基）3. 纤维素分解微生物样品4. 离心管、试管、平板培养基等常用实验室器材5. 灭菌器、微量移液器、孵化箱等实验设备三、实验步骤1. 样品处理a) 收集纤维素分解微生物样品，如土壤、水体或植物材料。
b) 将样品进行悬浮液处理，使用适当的稀释液（如生理盐水）或培养基进行悬浮液的制备。
c) 通过过滤或离心等操作，去除悬浮液中的大颗粒物质，得到较为均匀的样品。
2. 分离与纯化a) 取一定数量的样品悬液，分别均匀涂布在含有纤维素的固体培养基表面（例如含有纤维素的琼脂平板）。
b) 使用洁净的铁环或无菌塑料处理棒，在固体培养基表面进行菌落的划线、划圆或刺取等操作，以分离出单个微生物菌落。
c) 将分离得到的单个菌落转移到无菌富含纤维素的液体培养基中培养。
3. 筛选与纯化a) 从初步培养基中挑选出优良的单菌落，根据其特征进行初步筛选。
b) 针对初步筛选出的菌落，进行进一步鉴定和纯化，采用形态学、生理生化特性及分子生物学方法进行分析。
c) 辅助使用显微镜、PCR、基因测序等技术手段，确保所得微生物为纤维素分解菌。
四、注意事项1. 实验操作应在无菌环境下进行，避免外源污染。
2. 纤维素的质量和处理方式会影响微生物的分离，选择适当的纤维素基质、浓度和处理方法。
3. 注意培养基的配制和pH值的调节，确保适合目标微生物的生长需求。
4. 操作过程中要注意个人防护，避免对自身和他人造成伤害。
5. 实验后要及时清洗和消毒使用的设备和试剂，避免污染和交叉感染。
纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。
特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。
对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。
纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。
纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。
多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。
纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。
实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。
可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。
（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。
先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。
（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。
稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。
（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。
此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。
菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。
常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。
（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。
环境微生物技术实验总结报告一、国内外研究进展：①纤维素资源据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。
纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。
在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。
纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。
但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。
而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。
灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。
如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。
②农业废弃物资源的利用现状植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。
我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。
但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。
土壤中纤维素分解菌的分离、鉴定以及酶活性分析
摘要：纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球
上数量最大的可再生资源。
如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。
从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。
迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。
主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。
以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。
与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。
关键词：纤维素酶产生菌；鉴别培养基；透明水解圈
一、实验原理：
（一）纤维素与纤维素酶
（1）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。
棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。
（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即
C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。
（二）纤维素分解菌的筛选
（1）筛选方法
刚果红染色法。
能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。
（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理
刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。
当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
二、实验材料及用具
（一）实验材料
（1）样品的采集与处理
样品的采集：采集土样时，应选择富含纤维素的环境。
若找不到合适环境，可将滤纸埋在土壤中一个月左右，也会有能分解纤维素的微生物生长。
样品的处理：采集后的样品保存于4℃并在2d内使用。
（2）培养基
羧甲基纤维素钠（CMC-Na）固体培养基（1000ml）
CMC-Na：20g
Na2HPO4: 2.5g
KH2PO4: 1.5g
蛋白胨： 2.5g
琼脂：20g
pH：7.0-7.5. （二）仪器及用具
99ml无菌水（带玻璃珠，玻璃珠用量以充满瓶底为最好）1瓶，含9ml无菌水的试管6支，无菌培养皿，1ml无菌移液管，土壤样品，天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器等。
三．操作步骤
（一） （一）土壤土壤取样
土样的采集要在富含纤维素的环境中进行，这是因为在纤维素含
量丰富的环境中，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。
取表层一下5～10cm 处的土样，放入无菌袋中保存备用。
如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。
（二） （二）选择培养
选择培养需要的仪器有：250mL 锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL 和10mL 的移液管、天平、摇床、温度计等。
在250mL 锥形瓶中装入30mL 培养基，用8层纱布做成瓶塞，将
瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20m in 。
选择培养的操作：称取土样20g ，在无菌条件下加入装有30mL
培养基的摇瓶中。
将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d ，至培养基变混浊。
此时可以吸取0.1mL 培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。
（三） （三）梯度稀释
（1） （1）制备土壤悬液：称取土壤5g 迅速倒入含45ml 无菌水
的锥
形瓶中振荡5～10min ，使土壤充分打散，即成10-1的土壤悬液。
（2）稀释：用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液1ml ，吹入9ml 的无菌水中即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成
10-3～10-6的稀释液。
注意：操作时管尖不能接触液面每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的
液面要高于上一次，以减少稀释中的误差。
（四）（四）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）培养基的制备参照培养基组成配制。
在1000mL三角瓶中装入500mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
（2）倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。
（3）涂布平板：将稀释度为10-4～10-6的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。
30℃倒置培养观察，直到出现明显的菌落。
（4）染色与观察
取含有明显菌落的培养基，滴加约一滴管的刚果红染料摇匀，染色约15分钟后加入1mol/l的nacl浸泡10～15min，洗去染液，观察是否产生透明圈及其大小
（五）实验结果记录及分析
(1)实验记录
（2）结果分析
三个不同稀释度的培养皿产生的菌落数不同，浓度越大菌落数越多，大量菌落数连成一片，形成较大的透明圈。
稀释度为10-6的培养皿内产生了单菌落，观察发现其透明圈较小，由酶的活性与透明圈大小具有一定的线性关系，判断出改种菌类对纤维素的分解能力较弱。
（六）注意事项
（1）在土壤稀释分离操作中，每稀释十倍最好更换一支移液管；（2）土壤细菌及真菌较多，培养时应选取较高的稀释度；
（3）把握好培养时间及培养温度。
参考文献：《微生物学实验指导》作者：黄秀梨辛明秀
叶姜瑜一种纤维素分解菌鉴别培养基微生物通报，1997，24（4）：251～252
陈敏一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基杭州师范学院学报（自然科学版），2001，18（5）：11～12。
