纤维素分解菌培养基

纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。

3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。

4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。

二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。

应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。

由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。

将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。

用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。

三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。

浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。

：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。

无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。

把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。

浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。

NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。

实验一纤维素的微生物降解一、实验目的1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。

2、了解纤维素分解的基本理论，并掌握有关纤维素好氧和厌氧分解的一些基本实验技术。

二、实验原理1、从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化2、常用的分离纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法等。

稀释涂布平板法的步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法的步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。

3、测定纤维素分解酶，可观察其对提供的唯一碳源滤纸纤维的分解情况确定。

如果滤纸溃烂，说明有纤维素分解菌的作用。

4、纤维素分解微生物可根据需氧的与否分为两大类：好氧分解微生物和厌氧分解微生物。

三、实验材料1. 培养基A. 赫奇逊液固体培养基（好氧）：KH2PO4 1.0g，MgSO4٠7H2O 0.3g，FeCl3 0.01g，CaCl2 0.1g，NaNO3 2.5g，蒸馏水1000ml，pH值为7.2～7.3，0.1MPa灭菌20min。

B. 厌氧液体培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨2.5g，水1000ml，CaCO3 2.0g；0.1MPa 灭菌20min。

2. 器材A.近3mm粒度菜园土。

B.镊子，无淀粉滤纸，1ml和10ml无菌吸管，无菌水，天平。

3、土样：格物楼西，小树根部约10cm，地表覆盖较多枯叶、枯草，取土深度约15cm。

四、方法步骤1. 土粒法分离纤维素的好氧分解微生物⏹采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5～15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好、标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。

⏹将赫奇逊培养基趁热倒入培养皿，冷却后加直径近于培养皿的滤纸一张，用少量培养液润湿。

分解纤维素的微生物的分离知识点纤维素是植物细胞壁的主要结构成分，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，其结合方式和程度对植物源食品的质地影响很大。

你知道纤维素的微生物怎么分离的吗?下面店铺给你分享分解纤维素的微生物的分离知识点，欢迎阅读。

分解纤维素的微生物的分离知识点一、纤维素与纤维素酶1.纤维素的化学组成含C、H、O三种元素，是一种多糖。

纤维素的基本组成单位是葡萄糖，人体内没有纤维素酶，所以人体不能直接以纤维素为能源物质，但土壤中有分解纤维素的微生物，最终把纤维素分解成葡萄糖释放到无机环境。

2.纤维素的分布棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

纤维素产生于植物的光合作用，地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨。

研究土壤中分解纤维素的微生物将给我们的生活带来很大变化。

3.纤维素酶的组分纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种组分。

前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

二、纤维素分解菌的筛选1.方法刚果红染色法，常用的有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

2.原理(1)含纤维素的培养基中加入的刚果红，可与纤维素形成红色复合物。

(2)当纤维素被纤维素酶分解后，形成的纤维二糖、葡萄糖不和刚果红发生这种反应，红色复合物就无法形成，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

三、实验设计1.实验流程土壤取样→选择培养(此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。

2.土壤取样采取土样时，可以选择富含纤维素的环境。

3.选择培养(1)目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。

(2)操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。

纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。

特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。

对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。

纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。

纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。

多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。

纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。

实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。

可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。

（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。

先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。

（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。

稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。

（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。

此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。

菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。

常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。

（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。

纤维素降解菌的筛选及酶学性质的研究1.采样腐烂的苹果、蘑菇培养基及地面下10cm处土壤等2.富集培养(1)配制300ml 选择培养基。

(2)在250ml 锥形瓶中装入90ml 培养基（三瓶），放5-8 颗玻璃珠，塞上瓶塞，在121℃下高压蒸汽灭菌22min。

(3)每一份土样各取10g，在无菌条件下加入装有90ml 选择培养基的锥形瓶中，锥形瓶标上相应的标号。

(4)将瓶置于摇床上，在30℃下振荡（150rpm 左右）培养3-4d，至培养基变浑浊。

3.培养基1. 纤维素平板培养基CMC 20 g；KH2 PO4 2 g；ZnCl20.0017g ；MnSO40.0016g ；CoCl20.002 g ；MgSO4 ·7H2O 0.3 g ；(NH4)2 SO41.4 g ；CaCl20.3 g；FeSO4 0.0005g ；琼脂20 g；蒸馏水1000 mL；pH7.0-7.22. 刚果红纤维素鉴别培养基KNO32 g ；MgSO40.5 g ；KH2 PO41 g ；NaCl 1 g；Na2 HPO 41 g ；CMC-Na 20 g ；刚果红0.2 g ；琼脂20 g；蒸馏水1000 mL3. 液体发酵培养基蛋白胨3 g ；硫酸铵2 g ；酵母膏0.5 g ；KH2 PO4 4 g ；CaCl2 ·2H2O 0.3 g；MgSO4 .7H2O 0.3 g；Tween-80 0.2 mL；CMC 20 g；蒸馏水1000 mL4. 菌种保藏培养基（PDA）马铃薯200 g ；葡萄糖20 g ；琼脂15 g ；蒸馏水1000 mL ；pH自然5. 选择培养基CMC-Na5g，NaNO3 1g，KCl 0.5g，酵母膏0.5g，水解酪素0.5g。

将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml。

4.基本实验步骤1.纤维素降解菌的初筛称取样本10 g ，放入盛90 mL 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20 min ，使土样与水充分混合，将细胞分散，用一支无菌移液管从中吸取1 mL土壤悬液加入盛有9 mL无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌移液管从此试管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、不同稀释度的土壤溶液。

纤维素分解菌的筛选及其生长条件的研究作者：路娟娟陈娴孔峰程洁红来源：《江苏理工学院学报》2017年第06期摘要：为筛选出能够降解纤维素的纤维分解菌，为生物质的高效利用提供生物预处理的微生物资源基础。

采集土壤样品进行混合并制成一定浓度的菌悬液，经过初筛、纯化和复筛，获得了6株纤维素分解菌，并对这6株菌用英文字母进行编号，分别为菌A、菌B、菌C、菌D、菌E、菌F；同时进行了每种菌的不同温度、不同pH值对纤维素菌酶活力的影响实验，并获得了每种菌的最适温度、最适pH值参数。

菌株的最适温度和最适pH值可以为纤维素分解菌用于生产、工程实践方面提供合理的工艺参数依据。

关键词：纤维素分解菌；筛选；酶活力中图分类号：Q819.0 文献标识码：A 文章编号：2095-7394（2017）06-0020-05木质纤维素生物质（所有的植物和植物原料）是地球上最丰富的且具有巨大的生物能源和大宗化学品生产潜力的可再生有机物质。

[1]木质纤维素物质主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，三者所占的比例分别是40%、20%～30%和20%～30%。

[2]由于纤维素结构复杂，又与木质素结合形成难以被高效利用的“木质纤维素”，这一直是限制木质纤维素生物质高效利用的瓶颈。

因此，破坏纤维素、木质素的牢固结构，使纤维素、木质素及包裹在其中的有机质成分充分裸露而被利用，是生物质高效利用的前提。

目前，用生物方法对生物质进行预处理是既经济又高效的方法。

筛选出能够降解纤维素的纤维分解菌，为生物质的高效利用提供生物预处理的微生物资源基础。

同时对所筛选出的微生物进行了温适宜度、适宜pH值等生长条件的实验研究。

1 材料及方法1.1 菌种来源采集江苏理工学院校园灌木丛下、小树林下腐烂叶子下面的土壤样品，进行混合后制成一定浓度的菌悬液备用。

1.2 培养基准备（1）赫奇逊噬纤维素基础培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeCl3 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，琼脂25g，水1 000mL[3]。

纤维素分解菌的筛选流程1.首先从自然环境中采集潮湿的土壤样本。

First, collect moist soil samples from the natural environment.2.将土壤样本分离并进行稀释处理。

Separate and dilute the soil samples.3.接种土壤样本到富含纤维素的培养基中。

Inoculate the soil samples into a cellulose-rich medium.4.培养一段时间以促进纤维素分解菌的生长和繁殖。

Culture for a period of time to promote the growth and proliferation of cellulose-degrading bacteria.5.筛选并分离出有纤维素降解能力的菌株。

Screen and isolate bacteria with cellulose degradation ability.6.通过观察和测定菌株的生长特性来初步鉴定。

Preliminary identification of bacterial strains by observing and measuring their growth characteristics.7.进行酶活性测定以确认菌株的纤维素降解能力。

Enzyme activity assays to confirm the cellulose degradation ability of bacterial strains.8.将具有潜在应用前景的菌株进行进一步鉴定和纤维素降解能力测定。

Further identification and cellulose degradation ability testing of bacterial strains with potential application prospects.9.将菌株进行16S rRNA基因测序以了解其系统发育关系。

配制方法:
称取本品44.2g于1L蒸馏水或去离子水中
（可按比例增加或减少配制量），加热煮沸1分钟，分装，121℃高压灭菌15分钟,灭菌结束后请摇匀，
以防琼脂沉积于器皿底部而凝固，备用。

注意事项:
实验室专用；使用时避免与皮肤、眼睛接触；
避免吸入或吞食。

250g
セルロース分解菌培
地
纤维素分解菌培养基
Cellulose Decomposing Microorganisms Medium
製品コ―ド：12147
調製法：
本品44.2gを精製水１Lに加えて振り混ぜのち、1
分
間に加熱して煮沸溶解、分注する。

121℃で１5分間高
圧蒸気滅菌する。

滅菌後振いて、凝固を防止して使用
する。

注意事項：
試験室専用；使用の時、皮膚、目と接触を避ける,
吸入と飲み込むの場合を注意する。

組成(配方)：g/L
硫酸アンモニウム（硫酸铵）…………………2.0g
硫酸マグネシウム（硫酸镁）…………………0.5g
リン酸二水素カリウム（磷酸二氢
钾）……… 1.0g
塩化ナトリウム（氯化钠）……………………0.5g
セルロース（纤维素粉）……………………
20.0g
コンゴレッド（刚果
红）………………………0.2g
寒天（琼脂）………………………………20.0g
滅菌後のpH7.1±0.1(25℃)
許可号：20111116
保存方法：室温、光を避ける、防湿
保存期限：三年間。

第7课时 分解纤维素的微生物的分离学习目标 1.掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。

2.理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。

3.掌握纤维素酶的测定方法。

一、纤维素分解菌的筛选1．纤维素与纤维素酶 (1)纤维素①基本组成单位：-----------。

②分布：主要分布在植物--------------等器官中。

特别提醒 纤维素的分布、主要性质和作用分布 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素主要性质 常温下比较稳定，不溶于水及一般有机溶剂；纤维素不具有还原性，但在一定条件下能进行水解反应，产生葡萄糖，故其水解产物具有还原性 作用植物细胞细胞壁的主要成分；一种重要的膳食纤维，具有刺激胃肠蠕动、促进消化液分泌的功能；此外纤维素可用于造纸、纺织、制造炸药等(2)纤维素酶①组成：是一种复合酶，至少包括三种组分，即C 1酶、C X 酶、葡萄糖苷酶。

②作用：纤维素―――――――→C 1酶和C X 酶纤维二糖―――――――→葡萄糖苷酶葡萄糖特别提醒 除自然环境中存在的分解纤维素的微生物外，在草食性动物牛、马、羊等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其可产生纤维素酶分解纤维素，而人体没有分解纤维素的能力。

2．纤维素分解菌的筛选 (1)方法：--------------。

①方法一：先培养------------，再加入-------------进行颜色反应。

②方法二：在------------时就加入刚果红。

特别提醒 方法一需要用NaCl 溶液洗去培养基表面浮色后，再进行观察，方法二不需要。

(2)原理纤维素＋刚果红→红色复合物↓纤维素酶纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物 ↓以--------------心的透明圈1．如何设计实验证明纤维素酶能分解纤维素？提示 设计对照实验。

取两支试管，分别加入等量的滤纸条和缓冲液，在一支试管中加入纤维素酶，另一支试管中加入等量蒸馏水，振荡反应一段时间后，可观察到加入纤维素酶的试管中滤纸条被水解，而加入蒸馏水的试管中滤纸条没有变化。