肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义

肿瘤侵袭转移技术ppt（划痕实验，transwell，裸鼠尾静脉）展开全文取之于园，回馈于园。

先贴上ppt的图，一共有28张ppt，ppt里也有一些动图，需要讲相关课程可以下载ppt，不要叮当内容都是取自园子里前辈们的，图之后我会贴上当时我讲的逐字稿，欢迎大家指正错误，共同学习。

大家好，今天我和大家一起来看一下肿瘤的侵袭和转移相关实验技术我们将从这四方面来看首先是概述：实验探究细胞的侵袭转移可以分为体内和体外两个方面在体外实验现在我们常用的是细胞划痕实验和transwell，在体内实验我们可以使用的技术为裸鼠尾静脉注射以上为现在在国际上较为通用和认可的探究肿瘤侵袭和转移的技术首先是细胞划痕实验，细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力通俗的理解一下，就是用东西在一个铺满细胞的板子或培养基上用画一条线，线上的细胞被机械力去除掉了，通过一段时间的培养，我们可以观察细胞向无细胞区域迁移的情况，体现了细胞的一种迁移能力。

该实验优点：1.在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。

2.适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。

3.与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。

4.研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

我们所需的实验材料有以下：细胞样品仪器、耗材：6孔板 marker笔直尺枪头试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS首先，1.所有能灭菌的器械都要灭菌在超净工作台，就是这个，将所有器材紫外线消毒30min，需要消毒灭菌器材包括——离心管、吸管筒、移液枪、枪头、直尺、marker笔等在6孔板背面画线5-6条，这个就是6孔板，有的人也会用更多孔的板子，在板子的背面，我们用直尺和marker笔画出间距均匀平行的线，这个不行哈。

在每孔加入5X105个细胞，这里数量不同细胞可能不一，原则把握为1.数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整 2.数量少时可培养一段时间至铺满板底5.用1ml枪头垂直于孔板和画的线，制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致这里要注意：人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷，后面提到的一种新技术可以避免这一问题6.吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞7.加入无血清培养基，并根据需要设加实验组、对照组8.放入37度5%CO2培养箱，培养。

细胞划痕实验细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。

实验材料：细胞样品仪器、耗材：6孔板marker笔直尺枪头试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS抗体：Hamster igG 3、λ抗体实验步骤：一.准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）二.流程：1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。

每孔至少穿过5条线。

2.在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。

3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。

4.用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。

5.放入37度5%CO2培养箱，培养。

按0，6，12，24小时取样，拍照。

注意的几个问题：1、划痕前是不倒培养基的，划痕后再倒掉培养基加PBS清洗后加无血清培养基；细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。

划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。

因此是整个培养皿都加培养基的，观察部位是划痕而已。

2、通过算每个视野的划痕面积，可以通过image J 软件计算。

3、划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。

还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。

（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。

如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。

）划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。

因为a.这些细胞本身有迁移能力，且较强。

b.细胞有极性，方便测量，观察。

c.细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。

这也就是transwell发展的最大要求。

细胞划痕实验
细胞划痕实验是一种常用的细胞迁移实验方法，通过创造人工“划痕”来观察细
胞在愈合过程中的迁移和增殖情况，从而研究细胞间的相互作用、信号传导和细胞迁移的机制。

实验原理
在细胞划痕实验中，首先在细胞培养皿中种植一层细胞，在细胞形成单层后，
用刮刀等工具在细胞层中划一条“刀痕”，即人工划伤细胞层。

然后观察细胞在划痕
区的迁移和增殖情况，通过比较划痕前后细胞的变化，可以研究细胞迁移、增殖和愈合过程中的生物学机制。

实验步骤
1.预处理细胞：培养所需的细胞株，并保证细胞活性和纯度。

2.细胞接种：将细胞接种在培养皿中，培养至细胞形成单层。

3.划痕操作：使用刮刀等工具在细胞层中划一条“刀痕”，注意操作要轻
柔并且一致。

4.图像记录：立即在划痕前后拍摄图像，并在不同时间点继续记录细胞
迁移和增殖的情况。

5.数据分析：根据不同时间点的图像，量化分析细胞迁移距离和细胞密
度等指标。

结果解读
通过细胞划痕实验，可以观察到划痕区域细胞的迁移、增殖及愈合情况。

通常，划痕后细胞会向划痕区域迁移，填补伤口，形成新的细胞层。

通过比较不同处理组的细胞迁移速度、距离和形态等指标，可以揭示细胞因子、信号通路等对细胞迁移的调控机制。

应用领域
细胞划痕实验在癌症转移、组织再生、损伤修复等研究领域具有广泛的应用。

在癌症转移研究中，可以通过划痕实验检测抗转移药物的疗效；在组织工程和再生医学中，可以评估生物材料对细胞迁移和愈合的影响。

细胞划痕实验是一种简单有效的细胞迁移实验方法，虽然存在一些局限性和技
术挑战，但在研究细胞迁移和增殖等问题上仍具有重要的应用意义。

细胞划痕实验的详细步骤及说明细胞迁移(cell migration)：也称为细胞移动、细胞爬行或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。

它参与到很多生理和病理的活动中，如下：免疫：如淋巴细胞的定向迁移是其分化成熟和发挥功能的关键之一;炎症：炎症反应最重要的功能是将白细胞送到炎症灶，白细胞迁移到炎症部位并发挥其吞噬和组织损伤作用;肿瘤转移：肿瘤转移是肿瘤恶化后最常见的活动，如侵入淋巴管、血管后随脉管系统实现远处转移;损伤修复：当机体发生损伤时，免疫细胞和血小板会迁移到损伤部位，参与消炎和凝血;胚胎发育：胚胎期不同类型祖细胞迁移至特异靶位以保证各组织、器官的正常发育。

细胞划痕实验的基本原理：在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合。

因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验(Wound-Healing Assay)，广泛用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。

细胞划痕实验过程：在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后再继续培养细胞至实验设定的时间(可有不同时间点)，取出细胞培养板，显微镜下观察周边细胞是否迁至中央划痕区，并拍照。

具体实验步骤：1. 培养板划线标记用marker笔在6孔板背后画横线(用直尺比着)，每孔至少穿过5条线，每条线均匀且平行。

2. 细胞铺板在孔内接种约5-10*105个细胞(可根据细胞的生长快慢调整接种数量)，原则为过夜后细胞能够长满，切记一定要铺匀(细胞铺板均匀技巧可参考往期内容)。

3. 细胞划线第二天用20uL枪头(灭菌)或牙签，垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交。

Tips：减少划痕距离的误差办法——●不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签;●枪头要垂直，不能倾斜，划痕时可比着直尺;●最好保持力度一致，尽量一次性划完。

抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）实验导读瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。

因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。

肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。

前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。

图1肿瘤转移示意图根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。

异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。

肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。

通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。

当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。

间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。

针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。

细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。

其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。

下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后，由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。

抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响（细胞划痕法）实验导读瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。

因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。

肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。

前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。

图1 肿瘤转移示意图根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。

异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。

肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。

通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。

当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。

间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。

针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。

细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。

其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。

下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后，由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。

肿瘤细胞划痕实验步骤嘿，朋友们！今天咱来聊聊肿瘤细胞划痕实验那些事儿。

你想想啊，这肿瘤细胞就像是一群调皮捣蛋的小家伙，咱得想办法研究它们呀。

那划痕实验就是个好办法呢！首先，咱得准备好细胞培养板，就像给这些小家伙准备一个舒适的家。

把肿瘤细胞培养得好好的，让它们长得密密麻麻的。

然后呢，拿个细细的工具，在细胞上面轻轻地划一道痕，就像是给它们划了一条小跑道。

这道痕可重要啦，就看这些肿瘤细胞怎么个跑法咯。

接着呀，就把培养板放一边，让这些细胞自己活动活动。

这时候，你就可以想象它们像是在赛跑一样，有的跑得快，有的跑得慢。

过一段时间后，再来观察这些划痕。

看看细胞是怎么迁移的，是不是有的地方细胞多了，有的地方细胞少了。

这就像是看一场小小的细胞运动会呢。

这实验可有意思啦！咱能从这些划痕的变化里看出肿瘤细胞的很多特点。

比如说它们的迁移能力强不强呀，是不是很活跃呀。

你说，这像不像我们观察小朋友们做游戏，能看出每个小朋友的性格和能力一样？肿瘤细胞也是有它们自己的个性呢！而且哦，做这个实验可得细心，就像照顾小宝贝一样。

每个步骤都不能马虎，不然得出的结果可就不准确啦。

在这个过程中，要注意细胞的状态，不能让它们受到伤害。

还要掌握好划痕的力度，不能太轻也不能太重。

你想想，如果太轻了，那划痕不明显，细胞迁移起来也不明显，那不就白做啦？要是太重了，把细胞都给弄坏了，那还研究啥呀！总之呢，肿瘤细胞划痕实验就像是一个小小的探索之旅，带着我们去了解这些神秘的小家伙。

通过这个实验，我们能更好地认识肿瘤细胞，为治疗肿瘤找到更好的方法。

所以啊，大家可别小看了这个实验，它可是很有意义的呢！让我们一起好好地去探索肿瘤细胞的世界吧，说不定哪天就能找到攻克肿瘤的大秘密啦！。

肿瘤细胞迁移试验迁移是肿瘤细胞转移过程中必不行少的环节之一。

肿瘤细胞与母体瘤分别，穿越血管壁，侵袭周边正常组织时，需要一定的运动能力。

高转移的肿瘤细胞通常具有较强的运动性。

多种物质可刺激肿瘤细胞的迁移，如肿瘤细胞分泌因子、生长因子、细胞外基质成分(FN,LN）以及一些癌转移靶器官的代谢产物或分泌产物等生长因子对肿瘤细胞有趋化作用，可使其发生定向运动。

本节介绍两种测定细胞迁移的试验办法。

（一）细胞划痕法本办法借鉴体外细胞致伤愈合试验模型，测定肿瘤细胞在细胞外基质上的运动特性。

【材料】 1．细胞系及其培养肿瘤细胞及其所需培养液（RPMI 1640培养液、FBS)。

2．主要试剂人工重构基底膜材料（Matrigel)、纤维衔接蛋白（fibronectin, FN)、牛血清清蛋白（BSA)。

3．器具 96孔培养板、移液器、测微尺、显微镜。

【办法】 1．制备包被基底膜用灭菌双蒸水分离配制以下3种溶液：①lOg/L BSA;50mg/L Ma-trigel, l：8稀释液；② 10mg/L FN，以50 ul/孔分离加入96孔培养板，4℃过夜，BSA为对比基底；③水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/L BSA的无血清培养液，37℃,30分钟。

2．制备培养单层细胞将细胞密度为5x105/ml的肿瘤细胞接种于包被Matrigel或FN的96孔培养板中，每组平行4个样本，用体积分数为10％的RPMI 1640培养液常规培养，直至形成细胞单层。

3．人工划痕在单层培养细胞上，用移液器滴头沿培养板底部呈一字形划痕，镜下记录划痕区相对距离，然后，用无血清培养液洗涤，更换含10g/L BSA和体积分数为1％的RPMI 1640培养液，培养24小时更换体积分数为10％的RPMI 1640培养液，继续培养24小时，观看并照相。

【结果】培养24小时后在倒置显微镜下观看并测量迁移距离，测量细胞向划痕致伤区迁移的相对距离，即按照原始细胞致伤区距离计算出细胞实际迁移距离。

细胞划痕实验详细步骤及说明去除细胞时要轻柔，避免对周围细胞造成影响。

5.观察和记录在培养时间的不同时间点，观察细胞迁移的情况并拍照记录。

可以使用软件测量划痕区域的宽度，进而计算细胞迁移率和愈合速度等参数。

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。

它在免疫、炎症、肿瘤转移、损伤修复和胚胎发育等生理和病理活动中扮演重要角色。

细胞划痕实验是一种常用的体外实验，通过在单层细胞上人工制造一个空白区域，观察边缘细胞的迁移和愈合情况，以研究药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。

具体实验步骤包括：在培养板上标记划线，铺上约5-10*105个细胞，用枪头或牙签在中央区域划下一条线，去除划下的细胞并更换新鲜培养基，观察和记录细胞迁移的情况。

在操作过程中，要注意保持垂直划线、轻柔去除细胞、避免冲散单层贴壁细胞等技巧，以减少误差。

最终，可以使用软件测量划痕区域的宽度，计算细胞迁移率和愈合速度等参数，为细胞迁移研究提供实验数据。

为了保证细胞数量和状态不受影响，建议使用移液枪缓慢吸走，避免使用吸泵。

细胞应该放入37℃，5%CO2培养箱中进行培养。

在适当的时间点（例如6、12、24小时后），取出细胞并在显微镜下观察并拍照。

在使用Image J软件打开图片后，应随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值。

注意事项：1.划痕实验一般选择6孔板，因为它大小适中，可以保证有相当距离的平直划痕，便于观察。

当然，如果需要高通量初筛时，也可以使用12或者24孔板。

2.细胞的接种密度原则一般是过夜为100%融合。

如果过夜后细胞未100%融合，可以适当延长培养时间，但是由于细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐渐变差，后续细胞可能会凋亡而不是迁移。

3.为了降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果的影响，有以下方法：①使用无血清或低血清培养基（<2%）可降低细胞增殖对实验结果的影响；②一般认为24小时为细胞的一个周期，在选取合适的时间点（例如6、12、24小时）检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间；③如果要单纯考虑细胞迁移，可以先使用丝裂霉素（1μg/ml）处理1小时，抑制细胞的分裂。