人全外显子组序列捕获及第二代测序

全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是指利用序列捕获或者靶向技术将全基因组外显子区域DNA 富集后再进行高通量测序的基因组分析方法。

与全基因组重测序相比，全外显子组测序只需针对外显子区域的基因序列测序，覆盖度更深、数据准确性更高，更加简便、经济、高效。

技术优势
高性价，强分析，快速交付
外显子组测序主要用于识别和研究与疾病相关的编码区的基因组变异。

结合大量的公共数据库提供的外显子数据和正常人群数据库, 有利于更好地排除无害突变及解释变异信息之间的关联和致病机理。

技术路线
技术参数
样本要求。

第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。

我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。

我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。

要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。

第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。

显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。

但是它可以实时记录荧光的强度变化。

当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。

当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。

这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

第二个是纳米微孔。

因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。

这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。

Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。

在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。

而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。

2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。

其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。

最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。

否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。

2.限制性内切酶的活性1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。

因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小。

2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。

3.限制性内切酶的用量1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。

2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。

由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。

3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。

4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。

使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。

5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。

全外显子测序的技术要点全外显子测序是一种高通量测序技术，可以同时测定一个生物体的所有外显子区域的DNA序列。

全外显子测序技术的出现，极大地促进了人类基因组学的发展和疾病研究的进展。

下面将介绍全外显子测序技术的要点。

1. 序列捕获：全外显子测序的第一步是捕获外显子区域的DNA序列。

这一步骤使用特定的引物或探针，使外显子区域的DNA片段与其结合，然后通过化学方法将其他DNA片段去除。

这样可以高效地富集外显子区域的DNA序列。

2. 高通量测序：全外显子测序使用高通量测序技术，如Illumina测序平台。

这种测序技术可以同时测定大量的DNA序列，从而提高测序的速度和效率。

高通量测序技术的出现，使得全外显子测序成为可能。

3. 数据分析：全外显子测序产生的数据量庞大，需要进行复杂的数据分析。

数据分析的主要步骤包括测序质量评估、序列比对、变异检测等。

这些分析可以帮助研究人员鉴定外显子中的遗传变异，从而进一步研究其与疾病的关联。

4. 疾病研究应用：全外显子测序技术在疾病研究中具有广泛的应用价值。

通过对疾病样本和正常样本进行比较，可以发现与疾病相关的遗传变异。

这些变异可能是疾病的致病原因，也可以作为疾病的标志物进行诊断和预后的判断。

5. 个体化医疗：全外显子测序技术为个体化医疗提供了基础。

通过分析患者的外显子序列，可以了解其个体差异和易感基因型。

这对于制定个性化的治疗方案和预防策略非常重要。

6. 遗传咨询：全外显子测序技术的应用还使得遗传咨询工作更加准确和全面。

通过对患者及家族成员的全外显子测序，可以准确地识别携带疾病相关基因突变的个体，为其提供个性化的遗传咨询和风险评估。

7. 数据存储和共享：全外显子测序产生的数据量巨大，对于数据的存储和共享提出了挑战。

科研机构和数据库需要建立完善的数据管理系统，确保数据的安全性和可访问性，以促进全外显子测序数据的广泛应用。

8. 未来发展：随着测序技术的不断发展，全外显子测序技术也将不断改进。

这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。

随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。

这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：全基因组从头测序或者重测序目标序列重测序转录组分析微生物组研究基因调控研究NGS 序列二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。

从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。

台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。

这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。

目前，这些仪器的通量在10 Mb到 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。

高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。

一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。

与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。

还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。

因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。

有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。

这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。

这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。

DNA测序二代DNA测序的工作流程如下：DNA样本制备文库构建和验证文库分子大规模平行克隆扩增测序二代测序DNA样本的质量控制首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。

外显子捕获结题报告2010-11-22内容1 项目信息 (1)2 工作流程介绍 (2)2.1 Agilent液相捕获平台 (2)2.2 NimbleGen 液相捕获平台 (3)2.3 生物信息分析流程 (4)3 分析报告 (5)结果 (5)3.1 标准生物信息分析 (5)3.1.1 数据产出统计 (5)3.1.2 目标区域单碱基深度分布图 (6)3.1.3外显子捕获测序的均一性 (7)3.1.4一致序列组装和SNP检测 (7)3.1.5 SNP注释 (8)3.1.6插入/缺失(indels)检测 (9)3.1.7插入/缺失(indels)注释 (9)3.2个性化分析 (9)3.2.1氨基酸替换预测 (9)3.2.2群体SNP检测和等位基因频率估计 (12)3.2.3孟德尔遗传病分析 (13)3.2.4 NGS-GW AS 分析 (14)3.2.5正向选择信号的检测 (14)4 数据分析方法说明 (15)4.1信息分析软件及常用参数介绍 (15)4.2参考数据库 (16)4.3数据文件格式 (17)1 项目信息2 工作流程介绍采用Aglient SureSelect外显子靶向序列富集系统和NimbleGen SeqCap EZ人全外显子捕获系统。

这两个系统都采用液相系统进行高特异性和高覆盖率的外显子区域捕获。

2.1 Agilent液相捕获平台图2.1 Aglient外显子捕获和测序流程基本流程：首先将基因组DNA随机打断成150-200bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库。

文库经纯化后经过LM-PCR的线性扩增与SureSelect Biotinylated RNA Library (BAITS)进行杂交富集，再经过LM-PCR 的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序（Hiseq2000测序仪）。

对每个捕获文库进行高通量测序并保证测序深度达到要求，原始图像文件经过Illuminabasecalling Software 1.7进行碱基读取，获得读长为90bp双末端序列（reads）。

【NGS原创系列⼆】DNA建库那些事⼉众所周知，⽬前市场上主要以⼆代测序为主，⼆代测序过程中第⼀步是⽂库构建，本期为⼤家介绍⼀下常见⽂库构建的种类。

针对于illumina测序平台，DNA类的⽂库主要分为：DNA⼩⽚段⽂库、DNA⼤⽚段⽂库、Exon⽂库、PCR-Free⽂库和单细胞⽂库等。

DNA⼩⽚段建库DNA⼩⽚段⽂库是指⽚段⼤⼩在1kb以下的普通DNA⽂库（200bp、350bp、500bp等），DNA⼩⽚段⽂库可⽤来进⾏⼈重测序，动植物、微⽣物的de novo和重测序，16s rRNA测序，宏基因组测序等项⽬类型的⽂库构建。

DNA⼩⽚段⽂库的构建主要包含以下2种⽅法：01传统⽂库构建流程传统建库流程主要分为以下⼏个步骤：（1）将待测序的DNA分⼦⽤超声波打碎成200-500bp长的序列⽚段（2）将打碎后的基因组进⾏末端补平（3）在补平后的⽚段3’端加A和5’端进⾏磷酸化（4）对修复后的⽚段进⾏接头连接（5）对接头连接后DNA⽚段进⾏PCR扩增（6）对扩增后的⽂库进⾏磁珠纯化DNA⼩⽚段⽂库建库原理图如下：02转座法建库流程转座法建库相对于传统建库，其实验⽅法简单快速，5分钟内即可同时完成DNA⽚段化和接头连接，⽽且所需要的DNA量少。

⽬前市⾯上能提供具有⾃主知识产权专利的Tn5转座法建库试剂盒的公司就只有Illumina公司和TransGen公司。

由于转座酶与所输⼊的基因组量有⼀定的⽐例关系，因此我司开发了2款转座酶法建库试剂盒：（1）针对50ng起始量DNA（2）针对1ng起始量DNA转座法建库原理图如下：DNA⼤⽚段建库DNA⼤⽚段⽂库，⼜称之为末端配对（mate-paired）⽂库，⽚段长度⼤于1kb，主要⽤于动植物，微⽣物的de novo测序。

DNA⼤⽚段⽂库的构建主要分为以下⼏个步骤：（1）将待测序的基因组打断（2）将打碎的基因组进⾏末端修复和进⾏Biotin标记（3）将标记好的基因组环化（4）将环化后的基因组打碎（5）磁珠捕获⽚段化的基因组（6）对捕获后的基因组进⾏末端修复加A和加接头（7）对接头连接后的基因组进⾏PCR扩增（8）将PCR扩增后的⽂库进⾏分选回收DNA⼤⽚段⽂库建库流程图如下：Exon⽂库⼈类外显⼦组总共约30 Mb，占⼈类基因组约1%，外显⼦具有⾼度的保守型，且⼤部分疾病的致病位点位于外显⼦区。

国际儿科学杂志2021年1月第48卷第1期Int J Pediatr，Jan 2021，Vol. 48 ,No. 1•综述.• 9 •全外显子组测序技术在新生儿遗传病诊断中的应用魏豪（综述）颜景斌（审校）上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学附属儿童医院200040通信作者:颜景斌,Email:189****8323@【摘要】新生儿期的遗传病往往具有临床症状不典型、病情较为严重等特点，从而造成诊断和治疗的困难。

随着测序技术的不断发展，第二代测序技术以其高通量、低成本、快速化检测等优势逐渐应用于临床领域。

全外显子组测序（whole exome sequencing,WES)技术作为第二代测序技术的一种，仅对基因组外显子区域进行序列捕获、富集并测序，再利用生物信息学手段对W E S产生的大量数据进行分析和筛选，从而找到遗传病的变异基因或位点。

W ES技术因其具有检查结果提示全面和报告周期短的优势，逐渐成为新生儿遗传病分子诊断的重要手段。

【关键词】全外显子组测序技术；新生儿；遗传病诊断基金项目：国家重点研发计划“精准医学研究”重点专项(2016YFC0905102)DOI: 10. 3760/cma. j. issn. 1673-4408. 2021.01.003Application of whole exome sequencing technology in the diagnosis of neonatal genetic diseasesWei Hao，Yan JingbinShanghai Children's Hospital，Shanghai Institute of Medical Genetics，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200040, ChinaCorresponding author：Yan Jingbin, Email：189****************【Abstract】Genetic diseases that have shown clinical symptoms in neonatal period are often character-ized with atypical symptoms and serious condition, which contributes to difficulties in diagnosis and treat­ment With the progress of sequencing technology, the next-generation sequencing technology is gradually ap­plied to the clinical field with its advantages of high throughput, low cost and rapid detection. As one of next-generation sequencing technologies, the whole exome sequencing technology (WES) captures, enriches andsequences the genomic exon regions, and then the large amount of WES data is analyzed by bioinformaticsmethods and screened to find variant site in gene that causes genetic disease. WES technology has gradually be­come an important means of diagnosis in neonatal genetic diseases because of its advantages of comprehensiveresults and short reporting period.【Key words 】Whole exome sequencing technology; Neonates ；Genetic disease diagnosisFund program：uPrecision Medicine Research>,Key Special Project of National Key Research and Devel­opment Plan (2016YFC0905102)DOI ：10.3760/cma. j. issn. 1673-4408.2021.01.003罹患遗传病的新生儿往往具有多系统的临床表 型，与普通新生儿相比具有更高的发病率和病死率，大约有1/3的新生儿遗传病患儿在5岁之前死亡[1]。