下载文档原格式
基因测序和比较基因组学的方法和应用近年来，随着科技的不断进步和发展，基因测序和比较基因组学技术越来越受到科学家们的关注和研究。
这些技术的应用范围越来越广泛，可以被用于医学、生物学和环境科学等多个领域，为人们的生活和健康带来重要的促进和作用。
本文将会介绍基因测序和比较基因组学的方法和应用，并探讨其未来的发展趋势。
一、基因测序基因测序是指对DNA序列进行分析和测量的过程，可以从基因组层面上理解生物的遗传信息和生命过程。
近年来，由于测序技术的不断进步和发展，测序成本和难度也越来越低，并且应用范围也越来越广泛。
基因测序可以分为三个阶段：第一阶段是DNA片段的分离和扩增，第二阶段是识别和检测DNA序列，第三阶段是序列的解码和分析。
其中，最常用的测序技术包括Sanger、Illumina和PacBio等。
基因测序的应用范围非常广泛。
例如，它可以用于医学诊断和治疗，包括癌症的诊断和个体化治疗等。
它还可以应用于生物学和生态学的研究，帮助我们理解不同物种的遗传差异和进化过程。
另外，应用基因测序技术还可以提高农业和食品生产的效率和质量。
总之，基因测序技术的广泛应用将有助于我们更好地理解和应对各种生物和环境问题。
二、比较基因组学比较基因组学是指对不同物种的基因组进行比较和分析，以探索其遗传多样性和进化关系。
比较基因组学可以帮助我们理解生物之间的遗传差异和进化过程，从而提高我们对物种多样性和生态系统的认识。
比较基因组学可以用于遗传多样性的研究、物种鉴定、进化关系的重构等。
例如，比较基因组学研究发现，不同种类的动物之间存在着共同的基因，这有助于我们理解不同物种之间的遗传联系和进化关系。
另外，应用比较基因组学技术还可以鉴定野生动物种群和人类的遗传背景等。
三、基因测序和比较基因组学的应用基因测序和比较基因组学两种技术在现代生物研究中的应用非常广泛。
以下是一些具体的应用案例：1. 对癌症的个体化治疗：通过测序患者的基因组，医生可以识别患者的基因变异，从而进行个体化治疗。
一、我们将如何应对海量的基因信息新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时，却成为限制其广泛应用的一个障碍。
1980年，英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立了DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖，至今已有近三十年了。
在这三十年，DNA测序技术取得了令人瞩目的进展。
目前已进入市场的循环阵列测序平台采用的是与Sanger生物化学测序方法完全不同的原理。
在过去几年，应用极为广泛的毛细管电泳测序法采用的则是多线并行阵列格式，它运用尖端的荧光成像技术进行碱基识别。
上述各类新技术为生物学研究领域开辟了新的视角，也使实验研究达到一个新的水平。
学界对开发这类新技术的兴趣持续高涨，与此同时，人们却发现这些技术存在一定的不足——大量信息数据的产生限制了技术更加广泛的应用，并降低了其市场价值。
过去，研究人员使用Applied Biosystems（ABI）公司的3730XL毛细管电泳测序仪进行基因分析，每年至多能完成六千万碱基的测序量。
随着测序技术日新月异的发展，这种情况已经成为历史。
在2005年刚刚开始进行新一代测序技术开发时，Roche公司和454公司联合开发的焦磷酸测序仪的分析速度就已经达到了上述提及的ABI仪器速度的50倍之上。
也就是从那时起，因基因数据过多而产生的问题凸显了出来，而且这个问题随着其他制造商开发出更多更快的测序仪而愈加严重。
举个例子，ABI的新一代测序平台SOLiD（supported oligonucleotide ligation and detection）单次运行，便可以分析6Gb的碱基序列；而Roche/454测序仪单次运行可以将上述结果转换成12-15个千兆字节（gigabytes）的数据信息；Illumina Genome Analyzer（GAII）测序系统仅在两个小时的运行时间里，就得到10兆兆字节（terabytes）的信息。
基因诊断中测序技术的应用及优缺点一、概述基因诊断，作为现代生物医学领域的一项重要技术，正逐步改变我们对人类遗传性疾病和复杂病症的认知。
测序技术作为基因诊断的核心手段，发挥着至关重要的作用。
测序技术通过直接对DNA或RNA 序列进行测定，能够精准地揭示个体的遗传信息，进而为疾病的预防、诊断和治疗提供有力支持。
随着科技的不断进步，测序技术也在不断更新换代，从早期的第一代测序技术，到如今的第二代、第三代测序技术，其测序速度、准确性和成本效益都得到了显著提升。
这些技术的发展，使得基因诊断的应用范围越来越广，不仅限于遗传性疾病的诊断，还逐渐扩展到肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等多个领域。
测序技术在基因诊断中的应用也并非尽善尽美。
其优缺点并存，使得在实际应用中需要谨慎权衡。
优点方面，测序技术具有高度的准确性和灵敏度，能够检测到基因序列中的微小变异同时，其信息量巨大，能够为研究者提供丰富的遗传信息。
缺点也不容忽视，如测序成本较高、数据处理复杂、隐私保护问题等，都在一定程度上限制了测序技术的广泛应用。
在探讨基因诊断中测序技术的应用及优缺点时，我们需要全面、客观地分析其技术特点、应用范围及挑战，以期更好地推动其在生物医学领域的发展和应用。
1. 基因诊断的概念与重要性在《基因诊断中测序技术的应用及优缺点》一文的“基因诊断的概念与重要性”段落中，我们可以这样描述：基因诊断，即通过直接分析人类基因或基因产物来诊断疾病的方法，是现代医学领域中的一项重要技术。
它涉及对个体的基因组进行深入研究，以揭示与特定疾病相关的基因变异或异常表达。
基因诊断不仅为疾病的预防、早期发现和治疗提供了有力支持，还极大地推动了个性化医疗的发展。
基因诊断的重要性在于其能够提供精准、可靠的疾病诊断信息。
通过基因测序等技术，医生能够直接检测到与疾病相关的基因变异，从而明确疾病的遗传背景和发病机制。
这有助于实现疾病的早期发现和干预，提高治疗效果，降低医疗成本。
一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一、初现庐山真面目——一代测序：又称Sanger测序（多分子，单克隆）历史：第一代DNA测序技术（又称Sanger测序）在1975年，由Sanger等人开创，并在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长5375个碱基。
研究人员经过30年的实践并对技术及测序策略的不断改进（如使用了不同策略的作图法、鸟枪法），2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。
二、江山辈有人才出——二代测序：NGS技术（多分子，多克隆）背景：Sanger测序虽读长较长、准确性高，但其测序成本高通量低等缺点，使得de novo测序、转录组测序等应用难以普及。
经过数据不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技术近年来也杀入历史舞台。
1、Illumina 原理：桥式PCR 4色荧光可逆终止激光扫描成像主要步骤：①DNA文库制备——超声打断加接头②Flowcell——吸附流动DNA片段③桥式PCR扩增与变性——放大信号④测序——测序碱基转化为光学信号优势劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。
而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。
2、Roche 454油包水PCR 4种dNTP车轮大战检测焦磷酸水解发光主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油独立PCR③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号优势劣势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。
与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。
从最初第一代以San ger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年，以lllumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing NGS)的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。
其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。
2009年3月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Scienee〉杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。
同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3致病基因突变和《Nat Gene》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。
此后，通过NGS技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS技术已成为里程碑式的进步。
2010年，《Scienee》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。
近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。
同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。
目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
本文介绍了几种DNA水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。
陈跃龙 楚雄医药高等专科学校基因诊断中测序技术的应用及优缺点腺嘌呤与胸腺嘧啶（T）和胸腺嘧啶（T）相似，但与其他核苷酸相比，T在环糊精中的滞留时间为3倍。
胞嘧啶（G）和停留时间也不同。
因此，每个基因和当前的干扰幅度是唯一的。
此外，由于C-甲基化在环糊精中的停留时间大约为正常C停留时间的2倍之久，所以C-纳米孔单分子序列的甲基化可以以99.9%的准确度直接读出，而无需重复测序孔快速去除。
测序技术的发展及其优缺点DNA测序是基因诊断史上具有里程碑意义和划时代意义的技术革命，被称为基因诊断的黄金标准。
桑格在1977年发明了基因测序技术以来，基因测序技术诞生已经有40多年，它广泛应用于遗传病的基因诊断和产前/植入前诊断，特别是单基因疾病。
2007年，罗氏公司伊利米纳公司和ABI公司发明了高通量测序技术，即下一代测序技术。
然而，测序技术的发展至今仍未停止，以单分子实时测序和纳米孔技术为标志的第三代测序新产品也进入了历史阶段。
优点。
（1）DNA聚合酶的反应迅速，能较好地实现基本的测序技术，可在1秒内测量10个核苷酸。
测序速度为化学测序的速度的二万倍。
（2）DNA聚合酶反应具有持续性，可以进行长时间的基因测序，这种技术可以用来测量数千个碱基。
高精度，高达99.999999%。
这将大大减少体外转录。
（3）基因聚合酶能够测出不同基因序列，基于时间差异，可以确定模板C是否被甲基化。
可以获得许多重要的突变，节省项目成本。
（4）挖掘DNA突变和来源的频率，验证率很高。
（5）基因测序技术能够有效的预防癌症的发生。
（6）区分正常和癌症遗传变异水平。
（7）基因组测序，因为它读取时间长，可以精确预测癌细胞的减少数量。
在基因组测序中，重叠群测序重叠群（重叠后）显着减少了随后的基因组装配和注释的工作量，节省了大量时间。
它比NGS快得多。
因此，基因组测序和表征被广泛用于细菌和病原体。
单分子测序的优点在突变或SNP鉴定的病理学检测中是无与伦比的。
基因测序技术的原理和应用1. 引言基因测序是指通过对生物体中基因组的分析，确定基因序列的过程。
基因测序技术已经成为现代生命科学研究的重要工具。
本文将介绍基因测序技术的基本原理以及其在生物学、医学和农业等领域的应用。
2. 基本原理基因测序技术的基本原理是通过测定DNA分子中的碱基序列来确定基因的组成和结构。
以下是基因测序的常用技术：2.1 Sanger测序法Sanger测序法是最早也是最经典的测序技术。
它利用DNA合成反应，通过添加少量的特殊标记链终止核苷酸，使反应中断并由此来确定DNA分子的碱基序列。
2.2 高通量测序技术随着高通量测序技术的进步，现代基因测序已具备了高通量、高精度和高效率的特点。
常见的高通量测序技术包括454测序、Illumina测序和Ion Torrent测序等。
2.3 新一代测序技术新一代测序技术主要包括四大平台：Illumina HiSeq、Ion Torrent、PacBio和454。
这些技术通过改进测序反应过程，大幅提高了测序速度和准确性，并且降低了成本。
3. 应用领域基因测序技术的广泛应用使得生命科学研究取得了巨大的突破。
以下是基因测序技术在不同领域的应用：3.1 生物学研究基因测序技术在生物学研究中起到了重要的作用。
它可以帮助研究人员了解基因组的组成和结构，从而深入研究基因功能、基因调控以及遗传变异等生物学现象。
3.2 医学诊断基因测序技术在医学诊断中具有重要的应用价值。
通过对患者基因组的测序，可以发现与疾病相关的基因变异，并帮助医生制定个性化的治疗方案。
3.3 遗传学研究基因测序技术在遗传学研究中起到了关键作用。
通过测序分析，可以确定个体的基因型以及基因变异的类型和频率，进而揭示遗传性疾病的遗传规律。
3.4 农业领域基因测序技术在农业领域的应用主要包括农作物遗传改良和动物育种。
通过测序分析，可以挖掘出与作物产量、品质和抗性等性状相关的基因，为农业生产提供有力的科学依据。
全基因组重测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是一种高通量测序技术，用于获取一个个体的完整基因组序列信息。
全基因组重测序方法可以揭示个体的遗传变异、基因组结构和功能等方面的信息，对于研究遗传疾病、人类进化、种群遗传学以及农业和生物多样性等领域具有重要的意义。
以下是几种常见的全基因组重测序方法：
1. Sanger测序：虽然现在已不常用于全基因组重测序，但Sanger测序是第一种用于测序基因组的方法。
该方法通过DNA链延伸的方式，使用特殊的标记测定碱基序列。
2. Illumina测序：Illumina测序是目前最常用的全基因组重测序方法之一。
它基于DNA文库的构建，将DNA片段连接到测序芯片上的特定DNA序列上。
然后，通过化学反应和光学信号检测，测定每个DNA 片段的碱基序列。
3. PacBio测序：PacBio测序利用第三代DNA测序技术，采用单分子实时测序（Single Molecule Real-Time Sequencing）原理。
它通过监测DNA聚合酶在DNA模板上的合成过程，实时测定碱基的加入顺序。
4. Oxford Nanopore测序：Oxford Nanopore测序也是第三代DNA 测序技术，基于纳米孔电流测序原理。
DNA片段通过纳米孔时，测量的电流变化与碱基序列有关，从而实现测序。
这些全基因组重测序方法各有优缺点，如测序精度、读长、覆盖度、成本等方面存在差异。
研究人员和实验室选择具体的方法通常取
决于他们的研究目标、预算以及可用的技术设备。
一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一代测序、二代测序和三代测序是现代生物学领域中常用的测序技术，它们在测序速度、读长、准确度和成本等方面具有不同的优缺点。
下面将分别对这三种测序技术进行详细的优缺点及应用对比。
一代测序，也称为Sanger测序，是最早的高通量测序技术。
该技术基于DNA聚合酶合成双链DNA的特性，通过添加并特异性终止DNA合成的二进制链终止反应（dideoxynucleotides），将合成停止的DNA片段进行电泳分离，最终形成读取序列。
一代测序的主要优点是高准确度，错误率低于0.1%。
然而，其主要缺点是低通量和昂贵的费用，每天只能测序几十到几百个碱基对，且测序成本较高。
由于这些局限性，一代测序在特定应用领域中仍具有重要作用，如对单个基因的测定和疾病相关突变的鉴定。
二代测序是目前最常用的高通量测序技术，代表性的有illumina公司的测序平台。
该技术采用大规模并行测序的方法，将DNA片段固定在微米级反应区域中，通过构建DNA文库、聚合酶链式反应和定向插入测序等步骤，实现对DNA片段的扩增和测序。
二代测序的优点是高通量、高准确度和较短的读长，可以快速地获得数以Gb计的测序结果。
然而，该技术的主要缺点是较短的读长，通常在几百个碱基对左右，这限制了其在一些应用中的使用。
此外，二代测序还容易出现序列偏差和较高的错误率。
尽管如此，二代测序仍广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学和微生物学等研究领域。
三代测序，也被称为单分子测序，是近年来发展起来的一种新技术。
代表性的平台有PacBio和Oxford Nanopore Technologies（ONT）。
三代测序与一二代测序的不同之处在于，它可以直接测序一个单一的分子而无需扩增，同时可以获得更长的读长。
这是通过监测DNA分子在单个酶链中的碱基与探测器相互作用的方式实现的。
三代测序的主要优势是长读长，可以从几千到几十万个碱基对不等。
DNA测序的原理与技术DNA测序是一项利用生物技术分析和解读DNA序列的过程，现已成为各个领域的重要研究手段。
本文将简要介绍DNA测序的基本原理和常用技术及其优缺点。
一、基本原理DNA测序的基本原理是利用DNA的单一碱基（即核苷酸）序列的排列方式来确定一个特定DNA分子的唯一标识，从而确定DNA分子在整个DNA序列中的位置和序列。
DNA的四种碱基分别为腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。
这些碱基按照一定的排列方式构成了人类和其他物种的基因组DNA序列。
DNA测序方法根据其实验过程的不同，分为传统Sanger测序和新兴测序。
二、传统Sanger测序Sanger测序也称为二代测序，是一种通过使用一种特殊的增殖方法来测定DNA序列的技术。
在这种方法中，DNA被复制成许多相同的串联序列，每一次增殖都会随机生成一个已知序列的碱基。
通过逐步扩大这些随机扩增的序列的长度，Sanger测序可以得到完整的位于DNA中的所有碱基的序列。
Sanger测序的优点在于其精度和可靠性高，但它需要耗费时间和更多的资金和劳动力来生成结果。
此外，Sanger测序需要大量的输入DNA，在宏观生物学研究中尤其适用。
三、新兴DNA测序技术新兴DNA测序技术包括第三代测序、单分子打孔测序、纳米孔测序、以及第四代单通道测序等多种技术。
这些技术都以高通量、高速度和低成本而著称，为测量、分析和研究大规模DNA基因组的方法带来了更多机会。
1.第三代测序第三代测序是一种通过平台上的一些微小传感器来读取单个DNA分子上的碱基信息，产生高通量读取的新技术。
目前这种技术的常见应用包括基因组组装、分析和宏基因组学。
第三代测序的优点在于其高精度、低成本和高效性。
2.单分子打孔测序单分子打孔测序技术是新兴的DNA测序技术，其原理是利用小孔将单个DNA碱基传导到电子传感器中。
通过利用微流控技术进一步优化，可以实现以比Sanger测序更快的速度进行DNA测序。
几种常见的基因测序技术的优缺点及应用随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。
与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。
从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。
其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。
2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。
同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。
此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。
2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。
近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。
同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。
目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。
1、第一代测序1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。
1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。
2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。
其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。
每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的 ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的 DNA 片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。
依据电泳条带读取 DNA 双链的碱基序列。
人类基因组的测序正是基于该技术完成的。
Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。
目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。
例如，临床上采用 Sanger 直接测序 FGFR 2 基因证实单基因 Apert 综合征和直接测序 TCOF1 基因可以检出多达 90% 的与 Treacher Collins 综合征相关的突变。
值得注意的是，Sanger 测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行 PCR 直接扩增测序。
单个突变点的扩增包括该位点在内的外显子片段即可，不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。
因此，应明确定位要扩增的位点所在的基因外显子和该点的具体位置，设计包括该点在内的上下游 150 ~ 200 bp 的外显子片段引物。
此外，尽管有NGS 的出现，但 Sanger 测序对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。
到目前为止，Sanger 测序仍然是作为基因检测的金标准，也是 NGS 基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。
值得注意的是，Sanger 测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。
对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的 NGS。
虽然 Sanger 测序具有高度的分析准确性，但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。
另外，Sanger 测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。
1.2 连锁分析采用的是间接测序法。
在 NGS 出现之前，国际通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大规模全基因扫描和连锁分析基础上的位置候选基因克隆。
人类的染色体成对出现，一条来自父亲，一条来自母亲，每一对染色体在同样的位置上拥有相同的基因，但是其序列并不完全相同，被称为父系和母系等位基因。
遗传标记是指在人群中表现出多态现象的 DNA 序列，可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。
它存在于每一个人，但大小和序列有差别，具有可遗传性和可识别性。
目前采用第二代遗传标记，即重复序列多态性，特别是短串联重复序列，又称微卫星标记。
连锁分析是以连锁这种遗传现象为基础，研究致病基因与遗传性标记之间关系的方法。
如果控制某一表型性状的基因附近存在遗传标记，那么利用某个遗传标记与某个拟定位的基因之间是否存在连锁关系，以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体某一位置上。
1986 年 Morton 等提出优势对数记分法 (log odds score method，LOD)，主要检测两基因以某一重组率连锁时的似然性。
LOD 值为正，支持连锁 ;LOD 值为负，则否定连锁。
通过计算家系中的微卫星标记与致病位点之间的 LOD 值，可以初步估算二者间的遗传距离及连锁程度，从而确定该基因在染色体上的粗略位置。
然后利用该区域的染色体基因图谱，分析定位区域内所有基因的功能与表达，选择合适的候选基因进行突变检测，最终将致病基因定位或克隆。
然而，采用连锁分析进行基因检测存在很大的局限性。
不但所需遗传样本量较大，一般要求提供三代及以上遗传家系患者血样，而且数据量大、处理复杂、产出速度较慢、定位不够精确( 一般只能定位在染色体某一区间 )，这就使得研究工作繁重和定位基因的时间周期特别长。
目前，连锁分析采用的单核苷酸多肽性和短串联重复序列还在使用，但经典的间接测序方法，如单链构象多肽性、变性梯度凝胶电泳和异源双链分析在美国已被淘汰，而在发展中国家作为研究手段还在有限使用。
2、新一代测序 (NGS)主要包括全基因组重测序 (whole-genomesequencing，WGS)、全外显子组测序 (whole-exomesequencing，WES) 和目标区域测序 (Targeted regionssequencing，TRS)，它们同属于新一代测序技术。
总体而言，NGS 技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，使得遗传学者可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。
但这些不同的测序技术在测序范围、数据分析量以及测序费用和时间等方面又有很大差别，如果选择适合的方法，对于临床诊断和科学研究将起到事半功倍的作用。
2.1 目标区域测序目前常用的是基因芯片技术。
其测序原理是基于 DNA 杂交原理，利用目标基因组区域定制的探针与基因组 DNA 进行芯片杂交或溶液杂交，将目标基因区域 DNA 富集，再通过NGS 技术进行测序。
其测序过程是通过把数以万计的 cDNA 或寡聚核苷酸置于芯片上制成列阵，将芯片上固定好的已知序列的核苷酸探针与溶液中含有荧光标记的相应核酸序列进行互补配对，根据测序仪所显示强荧光的位置和强度，获取每组点阵列信息，再利用生物信息学算法确定目的靶核苷酸的序列组成。
测序所选定的目标区域可以是连续的 DNA 序列，也可以是分布在同一个染色体不同区域或不同染色体上的片段。
目标区域测序技术，对于以往通过连锁分析将基因突变锁定在染色体某一片段区域内，但无法找出突变是一个非常好的进一步检测手段。
2010 年，Nicholas 等使用基因分型芯片联合连锁分析技术，成功发现头小畸形的新基因 WDR62，文章发表在《NatGenet》杂志。
类似的研究在家族性胰腺癌中确定 8 个候选变异位点和在家族性渗出性玻璃体视网膜病变发现易感基因 TSPAN12。
基因芯片测序技术可以将经过连锁分析锁定了目标范围或经过全基因组筛选的特定基因或区域进行更深一层的研究，是解决连锁分析无法发现致病基因的有效手段。
基因芯片技术对于已知基因突变的筛查具有明显优势，可以快速、全面地检测出目标基因突变。
同时，由于目标区域受到了限制，测序范围大幅度减少，测序时间和费用相应降低。
但基因芯片检测所需要的 DNA 的量要大，由于已提取的 DNA 存在降解的风险，用于基因芯片研究的血标本最好是冰冻的全血，这样可以使用于检测 DNA 的量有充分保证。
2.2 全外显子组测序 (WES)外显子组是单个个体的基因组 DNA 上所有蛋白质编码序列的总合。
人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的 1%，但大约包含 85% 的致病突变。
WES 是利用序列捕获技术将全外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因分析方法。
采用的技术平台主要是罗氏公司的 SeqCap EZ 全外显子捕获系统，Illumina 公司的 Solexa 技术和 Agilent 公司的SureSelect 外显子靶向序列富集系统。
其捕获的目标区在 34 ~ 62 M 之间，不仅包括编码区同时也加入了部分非编码区。
NGS 的测序过程主要包括DNA 测序文库的制备、锚定桥接、PCR 扩增、单碱基延伸测序和数据分析。
研究者根据测序仪捕获到在测序过程中掺入有不同荧光标记碱基片段，经计算机将荧光信号转化成不同颜色的测序峰图和碱基序列。
基因测序结果与NCBI的SNP数据库、千人基因组数据库等国际权威数据库比对，最终确定是否为突变基因。
自NGS 技术问世以来，利用 WES 在临床疾病致病基因的鉴定研究中取得前所未有的成果。
这些成果不仅集中在单基因遗传疾病，还在多基因影响的复杂疾病中获得大量相关基因的发现。
在单基因遗传性疾病中，如视网膜色素变性、终端骨发育不良等发现新基因或已知基因新突变。
