雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤后运动功能障碍

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线粒体自噬参与NLRP3介导的炎症反应在脑卒中康复中的作用

文章编号：１００３２７５４（２０２２）０８０６８９０５ｄｏｉ：１０．１９８４５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｚｆｙｓｊｊｂｚｚ．２０２２．０１７４线粒体自噬参与ＮＬＲＰ３介导的炎症反应在脑卒中康复中的作用王　维１，２，　李振东１，３，　张诚诚１，３，　张月娟１，３收稿日期：２０２２０４０９；修订日期：２０２２０５３０基金项目：湖南省卫生健康委科研项目（２０１９０１２４）作者单位：（１．湖南中医药大学研究生院，湖南长沙４１００００；２．湖南省职业病防治院，湖南长沙４１００００；３．湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙４１００００）通讯作者：张月娟，Ｅｍａｉｌ：ｌｋｒｌｋｒ７８６５＠１６３．ｃｏｍ摘　要：　目的　分析线粒体自噬和ＮＬＲＰ３介导的炎症反应在脑卒中康复中的作用。

方法　雄性ＳＤ大鼠随机分为６组：假手术组（Ｓｈａｍ）、Ｓｈａｍ＋雷帕霉素（ＲＡＰＡ）组、再灌注后６ｈ组（Ｉ／Ｒ６ｈ）、Ｉ／Ｒ６ｈ＋ＲＡＰＡ组、再灌注后２４ｈ（Ｉ／Ｒ２４ｈ）和Ｉ／Ｒ２４ｈ＋ＲＡＰＡ组。

建立短暂性大脑中动脉闭塞模型，以刺激大鼠的缺血／再灌注（Ｉ／Ｒ）损伤。

分析缺血核心皮质区域不同类型神经细胞中ｃａｓｐａｓｅ１阳性细胞表达情况。

以ＢＶ２细胞为研究对象，在缺氧葡萄糖剥夺／复氧（ＯＧＤ／Ｒ）条件下检测ＮＬＲＰ３表达，并测定线粒体膜电位。

结果　Ｉ／Ｒ损伤后６ｈ，切割的ｃａｓｐａｓｅ１主要在小胶质细胞中表达［（８８．４±１．１）％］，而在２４ｈ时主要在神经元［（６３．４±２．２）％］中表达。

在ＯＧＤ／Ｒ后，ＢＶ２细胞中ＬＣ３ Ⅰ向ＬＣ３ Ⅱ转化随着时间的推移而减少。

暴露于ＯＧＤ／Ｒ后２４ｈ，ＢＶ２细胞表现出低膜电位的百分比。

与ＯＧＤ／Ｒ组相比，ＲＡＰＡ能够挽救线粒体的损伤（Ｐ＜０．０５），并且ＲＡＰＡ可抑制ＯＧＤ／Ｒ诱导的ＢＶ２细胞中ＮＬＲＰ３、切割的ｃａｓｐａｓｅ１和切割的ＩＬ１β表达水平上调（Ｐ＜０．０５）。

细胞自噬的分子学机制及运动训练的调控作用_钱帅伟

信号调控机制非常复杂且高度保守，其中，ｍＴＯＲ和Ｂｅｃｌｉｎ１作为各种调控通路的汇集点发挥了至关重要的作用。不同形式与强度的运动训练对细胞自噬也有一定的调节作用。一般
来说，适宜强度的运动训练可通过上调细胞自噬水平，降解由于运动刺激所积累的损伤细胞
钱帅伟１，罗艳蕊１，２，漆正堂１，丁树哲１ＱＩＡＮＳｈｕａｉ－ｗｅｉ１，ＬＵＯＹａｎ－ｒｕｉ１，２，ＱＩＺｈｅｎｇ－ｔａｎｇ１，ＤＩＮＧＳｈｕ－ｚｈｅ１
摘要：细胞自噬（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）是真核细胞中普遍存在的生命现象，是将细胞内变形、衰老或损伤的蛋白质和细胞器转运到溶酶体腔中消化降解的一种代谢过程。它的分子发生机制和
向为运动适应与线粒体调控。
作者单位：１．华东师范大学体育与健康学院，上海２００２４１；２．河南师范大学体育学院，河南新乡４５３００７１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈｙｓｉｃａｌＥｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄＨｅａｌｔｈ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２４１，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈｙｓｉｃａｌＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＨｅｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘ－ｉａｎｇ４５３００７，Ｃｈｉｎａ．
Ｔｅｌ：（０２１）５４３４１５４４，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉａｎｓｈｕａｉｗｅｉ９９９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ；罗艳蕊（１９７４－），女，河南南乐人，副教授，博士，硕士研究生导师，研究方向为运动人体科学和体育信息

细胞自噬在神经退行性疾病中的作用

细胞自噬在神经退行性疾病中的作用在我们的身体中，细胞如同一个个忙碌的小工厂，不断地进行着各种生命活动。

而细胞自噬，就像是细胞内部的“清洁工”，负责清除废旧的细胞器、错误折叠的蛋白质以及入侵的病原体等。

近年来，科学家们发现细胞自噬在神经退行性疾病中扮演着至关重要的角色。

神经退行性疾病，是一类令人担忧的疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病等。

这些疾病的共同特点是神经元的逐渐丧失和功能障碍，从而导致认知、运动和其他神经功能的严重受损。

那么，细胞自噬是如何与这些可怕的疾病产生关联的呢？首先，让我们来了解一下细胞自噬的工作原理。

简单来说，细胞自噬是一个分解和回收细胞内物质的过程。

当细胞感受到压力或者营养缺乏时，会形成一个双层膜结构，称为自噬体。

自噬体像一个小口袋，将需要被清除的物质包裹起来，然后与溶酶体融合，其中的物质被降解为小分子物质，这些小分子可以被细胞重新利用，为细胞的生存提供必要的物质和能量。

在正常的生理状态下，细胞自噬对于维持神经元的健康和功能是非常重要的。

神经元是一种高度特化的细胞，它们具有复杂的结构和功能，需要大量的能量和物质来维持正常的活动。

细胞自噬可以帮助神经元清除积累的错误折叠的蛋白质，这些蛋白质如果不及时清除，可能会聚集形成有毒的聚集体，损害神经元的功能。

例如，在阿尔茨海默病中，β淀粉样蛋白的积累是一个重要的病理特征。

细胞自噬可以通过降解这些异常的蛋白质，减少它们对神经元的毒性作用。

此外，细胞自噬还可以清除受损的细胞器，如线粒体。

线粒体是细胞的“能量工厂”，但在某些情况下，线粒体可能会受到损伤，产生过多的活性氧物质，对神经元造成损害。

细胞自噬可以及时清除这些受损的线粒体，维持细胞内环境的稳定。

然而，当细胞自噬功能出现障碍时，问题就来了。

在神经退行性疾病中，常常会观察到细胞自噬的异常。

例如，在帕金森病中，与细胞自噬相关的基因发生突变，导致自噬体的形成和运输出现问题，使得α突触核蛋白等有害物质不能被有效地清除，从而引发神经元的死亡。

利拉鲁肽通过调控自噬和Na+,K+-ATPase活

网络出版时间：２０２２－１２－０９１８：２４：０６　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／／３４．１０８６．Ｒ．２０２２１２０９．１４２７．０１１．ｈｔｍｌ利拉鲁肽通过调控自噬和Ｎａ＋，Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ活性抑制高糖诱导的心肌细胞肥大张　哲１，野战鹰２，王　杏１，杨林泉１，马慧娟１（河北省人民医院１．代谢病重点实验室、２．神经外三科，河北石家庄　０５００５１）收稿日期：２０２２－０８－０７，修回日期：２０２２－１０－１８基金项目：国家自然科学基金青年基金资助项目（Ｎｏ８１２００６３８）；河北省卫生厅基金资助项目（Ｎｏ２０１８００５１）作者简介：张　哲（１９８０－），女，博士，助理研究员，研究方向：糖尿病及代谢疾病，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｅ＿ｚｈａｎｇ８０＠１２６．ｃｏｍ；马慧娟（１９７６－），女，教授，博士生导师，研究方向：糖尿病及代谢疾病，通信作者，Ｅｍａｉｌ：ｈｕｉｊｕａｎｍａ７６＠１６３．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０１０１７文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０１－００４３－０８中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２９２４；Ｒ３２９４１１；Ｒ３９４２；Ｒ５８７１；Ｒ９７７１５摘要：目的　探讨利拉鲁肽（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ，ＬＲＧ）抑制高糖（ＨＧ）诱导的心肌细胞肥大的可能机制。

方法　体外培养Ｈ９ｃ２细胞，分为对照（ＣＯＮ）组、ＨＧ组、低、中、高剂量ＬＲＧ（ＬＲＧＬ、ＬＲＧＭ、ＬＲＧＨ）组、ＬＲＧＨ＋自噬抑制剂３甲基腺嘌呤（３ＭＡ）组。

鬼笔环肽染色观察细胞表面积；试剂盒测定细胞膜Ｎａ＋，Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（ＮＫＡ）活性；ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定ＮＫＡα１、ＮＫＡα２ｍＲＮＡ和蛋白表达；单丹磺胺戊二胺（ＭＤＣ）荧光染色观察自噬囊泡数量；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定肥大标志基因（ＡＮＰ、β ＭＨＣ）、自噬标志基因（Ｂｅｃｌｉｎ１、ＬＣ３、ｐ６２）蛋白表达。

细胞自噬与ULK1蛋白关系的研究进展

细胞自噬与ULK1蛋白关系的研究进展杨龙灿;张莹;余曦;孙家维;李继伟;张旭阳;潘宁波【摘要】细胞自噬是生物体重要的代谢过程,在各个生理、病理过程中扮演重要角色.它由自噬相关蛋白控制,受多条信号通路调控.细胞自噬在神经退行性病变、肿瘤发生、缺血/再灌注损伤、糖尿病、循环系统疾病等方面有重要作用,其可以清除细胞内受损的物质或细胞器,为细胞提供原料和良好的细胞环境.而在细胞自噬的形成过程中,unc-51样激酶1(ULK1)蛋白发挥重要作用,它是细胞自噬的起始开关.因此,通过对ULK1蛋白上下游信号的深入研究,以ULK1蛋白为治疗靶点,干预和调控细胞自噬,将为疾病的治疗提供新的方向.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2018(024)023【总页数】6页(P4635-4639,4646)【关键词】细胞自噬;Unc-51样激酶1蛋白;缺血/再灌注【作者】杨龙灿;张莹;余曦;孙家维;李继伟;张旭阳;潘宁波【作者单位】遵义医学院研究生院,贵州遵义563000;遵义医学院研究生教研室,贵州遵义563000;贵州省人民医院肝胆外科,贵阳550002;贵州省人民医院肝胆外科,贵阳550002;贵州省人民医院肝胆外科,贵阳550002;贵州省人民医院肝胆外科,贵阳550002;贵州省人民医院肝胆外科,贵阳550002;贵州省人民医院肝胆外科,贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R392.28细胞自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，其参与生物体的许多生理和病理过程，与细胞的增殖、凋亡、衰老一样，在生物的生长发育过程中起重要作用。

细胞自噬是1962年由Ashford和Porter[1]在用电子显微镜观察人肝细胞时发现的一种自我吞噬现象。

它是一种进化上相对保守的代谢过程，主要在细胞质中进行。

正常情况下，细胞自噬处于低表达水平，对细胞生长及自我更新起重要作用[2]。

细胞处于饥饿或应激状态时，自噬可对细胞内异常的蛋白质、细胞器等进行降解代谢，同时也可为细胞提供原料，保护细胞，增强细胞对环境的适应能力。

自噬抑制剂3-MA对机械性神经元损伤后神经元凋亡的影响

自噬抑制剂3-MA对机械性神经元损伤后神经元凋亡的影响赵明明;罗鹏;赵永博;尹丰;费舟【摘要】目的研究自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA)对机械性损伤后神经元凋亡的影响.方法小鼠皮层神经元原代培养2w后,采用机械性神经元损伤模型,通过蛋白印迹法(Western blot)定量分析损伤后不同时间点自噬相关分子微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅰ/Ⅱ的表达情况;通过免疫荧光染色分析机械性损伤后24h神经元自噬相关分子LC3的表达情况;小鼠皮层神经元原代培养2w后,用自噬抑制剂3-MA 预处理1h,采用机械性神经元损伤模型,通过乳酸脱氢酶(LDH)活性测定及碘化丙啶(PI)/Hoechst 33342双染测定神经元损伤程度以及3-MA的保护作用,并通过Western blot研究凋亡相关指标caspase-3和自噬相关指标微管相关蛋白轻链3(LC3)和Beclin-1的表达变化.结果 Western blot方法和免疫荧光组化同时证明机械性神经元损伤后24 h LC3Ⅱ表达明显增加;LDH活性测定表明3-MA能抑制机械性损伤造成的LDH活性的增高;PI/Hoechst 33342双染表明3-MA可以明显减少机械性损伤后神经元的凋亡;通过Western blot法证明3-MA抑制LC3Ⅱ,并导致cleaved caspse-3表达明显降低.结论自噬抑制剂3-MA可能通过抑制自噬而减少机械性神经元损伤后神经元凋亡,进而对机械性损伤后神经元起保护性作用.【期刊名称】《中华神经外科疾病研究杂志》【年(卷),期】2016(015)003【总页数】5页(P196-200)【关键词】机械性神经元损伤;凋亡;自噬【作者】赵明明;罗鹏;赵永博;尹丰;费舟【作者单位】海军总医院神经外科,北京100048;第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032;解放军第323医院神经外科,陕西西安710054;海军总医院神经外科,北京100048;第四军医大学西京医院神经外科,陕西西安710032【正文语种】中文【中图分类】R322创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是临床上常见的高致残、致死性疾病，分为原发性脑损伤和继发性脑损伤，根据GCS评分又分为轻度、中度和重度[1,2]。

雷帕霉素在延缓衰老及老年相关性疾病中的研究进展

雷帕霉素在延缓衰老及老年相关性疾病中的研究进展任月英;吴文【摘要】随着生物学家对雷帕霉素(西罗莫司)靶蛋白(target of rapamycin,TOR)研究的深入,发现雷帕霉素通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性影响细胞的生长、增殖、蛋白质合成和细胞自噬,从而延长了无脊椎动物和哺乳动物的生命周期,并预防和延缓了老年相关性疾病的发生.本文对雷帕霉素在延缓衰老及预防老年相关性疾病中的研究进展进行综述.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2014(039)009【总页数】6页(P715-720)【关键词】雷帕霉素;mTOR;长寿;衰老;神经变性疾病【作者】任月英;吴文【作者单位】杭州华东医药集团新药研究院有限公司,杭州310012;杭州华东医药集团新药研究院有限公司,杭州310012【正文语种】中文【中图分类】R979.5生物体的衰老是一个非常复杂的过程。

随着年龄的增长，生物体内各种分子、细胞、组织以及器官的损伤会不断的积累，从而逐渐丧失功能，并最终导致疾病和死亡。

近年来，延缓衰老以及延长人类健康寿命已成为生物学研究的热点，尤其对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制剂的相关研究较为突出。

mTOR抑制剂的研究起源于70年代智利拉帕努伊岛土壤样本中发现的一种新的抗菌活性物质，它是从吸水链霉菌中分离而得，命名为雷帕霉素(rapamycin，结构式见图1)，又名西罗莫司(sirolimus)，为大环内酯类化合物，现主要用于肾移植的抗排异治疗[1-2]。

发现雷帕霉素对酵母和人类细胞的增殖都有抑制作用后，研究人员意识到这两个物种肯定存在某种相同的生长调控基因，1991年在对芽殖酵母的端粒研究中，找到了两个古老的生长调控基因，分别命名为TOR1和TOR2，并认为TOR1和TOR2是雷帕霉素生长抑制作用的遗传介质。

细胞自噬在Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞中的作用

细胞自噬在Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞中的作用杨依; 唐晓丽; 刘悦; 方芳【期刊名称】《《中国病理生理杂志》》【年(卷),期】2019(035)011【总页数】7页(P2028-2034)【关键词】3-甲基腺嘌呤; β-淀粉样蛋白; 雷帕霉素; 自噬; 阿尔茨海默病【作者】杨依; 唐晓丽; 刘悦; 方芳【作者单位】北京中医药大学中药学院北京102488【正文语种】中文【中图分类】R749.1+6; R329.2+5阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD) 是一种神经退行性疾病，其发病率随年龄增长，临床表现为渐进性记忆减退和认知功能障碍，生活自理能力下降，精神人格出现异常等[1]。

β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉积是AD可能的发病机制之一，体内外实验均有研究证明[2-3]，一定剂量以上的Aβ具有神经损伤作用，能对动物行为和认知功能产生影响，导致或加速神经细胞凋亡，常用于模拟AD模型。

生物体内Aβ的生成、代谢降解过程都与细胞自噬密切相关[4]。

正常生理状态下，经自噬产生的Aβ含量不足以发生聚集[5]；当自噬功能出现障碍，可能导致毒性片段产生增多或已形成的Aβ代谢清除异常，Aβ沉积，进而造成神经元损伤[6-7]。

细胞自噬稳态、Aβ及AD的发病存在复杂多向的相互影响，探究其间的关系与机制具有重要意义。

本研究以SH-SY5Y细胞为研究对象，旨在探索Aβ25-35诱导的神经细胞损伤是否与调节细胞自噬相关，并基于蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路对其作用机制进行初步探究。

材料和方法1 实验材料人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株由中国人民解放军总医院药理药学研究室培养赠送。

2 药物和试剂雷帕霉素(rapamycin,Rapa,M1768)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA，M2296)购自AbMole；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自CORNING；青-链霉素(penicillin/streptomycin，P/S)和Aβ25-35购自Sigma；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(FFP24)购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒(AR0146)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(0793，噻唑蓝，MTT)、anti-GAPDH(DE0621)和羊抗小鼠IgG-HRP标记Ⅱ抗(DE0602)购自北京拜尔迪生物技术有限公司；anti-mTOR(#2972)和anti-p-mTOR(#2971)购自Cell Signaling Technology (CST)；anti-akt(ab8805)、anti-p-Akt(ab38449)和anti-LC3B(ab48394)购自Abcam；辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZB-2301)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

MiRNA调控脑缺血

第 45卷第1期2024 年1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YAT⁃SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）MiRNA调控脑缺血/再灌注诱导的自噬信号通路研究进展刘筱蔼1，罗友根2（1. 广东食品药品职业学院，广东广州 510520； 2. 江苏医药职业学院盐城市偏瘫康复工程技术研究中心，江苏盐城 224005）摘要：脑卒中时缺血缺氧致脑组织功能损伤，且缺血后脑组织再恢复血液供应时，大量自由基、钙超载等引起脑缺血/再灌注损伤，进一步加重病情。

自噬是一种维持细胞内环境稳态的自我保护机制，但过度自噬引起脑组织损伤。

MiRNA为小的内源性非编码RNA分子，通过与其靶基因mRNA的3’ -UTR中的互补序列结合，导致翻译抑制或mRNA降解，从基因水平上调控多种生理活动。

MiRNA不仅直接作用于自噬相关蛋白，还可通过多种信号通路，参与缺血/再灌注诱导的自噬调控。

但关于miRNA调控脑缺血/再灌注诱导的自噬信号通路尚缺乏系统性归纳与分析。

本文综述了miRNA-124、miRNA-298、miRNA-202-5p、miRNA-142以及miRNA-26b等miRNA通过不同信号通路调控脑缺血/再灌注中的细胞自噬，为脑卒中的自噬研究提供了系统的理论思路。

关键词：脑缺血/再灌注损伤；微小RNA；自噬；信号通路；自噬相关蛋白；调控中图分类号：R363.2 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）01-0021-07DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240004.003MiRNA Regulating Autophagy Signaling Pathway Induced byCerebral Ischemia/ReperfusionLIU Xiaoai1， LUO Yougen2（1. Institute of Nursing， Guangdong Food and Drug Vocational College， Guangzhou 510520， China；2. Yancheng Hemiplegia Rehabilitation Engineering Technology Research Center， Jiangsu Vocational College ofMedicine， Yancheng 224005， China）Correspondence to： LUO Yougen； E-mail：***************Abstract：Ischemia and hypoxia cause functional damage to brain tissues during stroke， and when blood supply is re⁃stored to brain tissues after ischemia， a large number of free radicals and calcium overload cause cerebral ischemia-reper⁃fusion injury， which further aggravates the condition. Autophagy is a self-protection mechanism that maintains the homeo⁃stasis of the intracellular environment， but excessive autophagy causes brain tissue damage. MiRNA is a small endogenous non-coding RNA molecule that regulate various physiological activities at the gene level by binding to complementary se⁃quences in the 3 '- UTR of its target gene mRNA， leading to translation inhibition or mRNA degradation. MiRNA not only directly acts on autophagy related proteins， but also participates in autophagy regulation induced by ischemia/reperfusion through various signaling pathways. However， there is still a lack of systematic induction and analysis of miRNA regulation of autophagy signaling pathways induced by cerebral ischemia/reperfusion. This article reviews the regulation of cellular au⁃·综述·收稿日期：2023-10-16 录用日期：2023-12-11基金项目：国家自然科学基金（31660271），江苏省产学研合作项目（BY20221030），江苏省双创计划（JSSCBS20211166）；广东省医学科学技术研究基金（A2020164）；广东食品药品职业学院自然科学研究项目（2016YZ009），江苏医药职业学院博士科研启动项目（20200010）作者简介：刘筱蔼，第一作者，副教授，研究方向：神经损伤与修复，E-mail：***************.cn；罗友根，通信作者，教授，E-mail：***************第45卷中山大学学报（医学科学版）tophagy during cerebral ischemia/ reperfusion by miRNA-124， miRNA-298， miRNA-202-5p， miRNA-142， miRNA-26b and so on through different signaling pathways， providing a systematic and theoretical approach for the study of autoph⁃agy in stroke.Key words：cerebral ischemia reperfusion injury；MicroRNA；autophagy；signal pathway；autophagy related pro⁃teins； regulation［J SUN Yat⁃sen Univ（Med Sci），2024，45（1）：21-27］脑卒中具有高致残率和高死亡率的特点，早期预防具有十分重要的意义。

基于线粒体功能障碍和内质网应激探讨非酒精性脂肪性肝病发病机制

· 综述·基于线粒体功能障碍和内质网应激探讨非酒精性脂肪性肝病发病机制*薛春燕　饶晨怡　吴　玲　黄晓铨　陈世耀　李　锋#复旦大学附属中山医院消化科（200032）摘要　非酒精性脂肪性肝病（NAFLD ）是一种肝脏细胞脂肪异常堆积引起的慢性肝病，其患病率在全世界范围内呈上升趋势，已成为慢性肝病的最常见原因。

NAFLD 发病机制复杂多样，胰岛素抵抗、遗传和表观遗传因素、慢性全身性炎症、线粒体功能障碍、内质网应激、饮食和肠道菌群等均是NAFLD 发生、发展的重要因素。

本文主要讨论了线粒体功能障碍和内质网应激等参与NAFLD 形成的机制，旨在为NAFLD 防治提供新的认识和治疗思路。

关键词　非酒精性脂肪性肝病；　线粒体功能障碍；　内质网应激；　氧化性应激；　非折叠蛋白质应答Exploring Pathogenic Mechanisms of Non⁃alcoholic Fatty Liver Disease Based on Mitochondrial Dysfunction and Endoplasmic Reticulum Stress XUE Chunyan, RAO Chenyi, WU Ling, HUANG Xiaoquan, CHEN Shiyao, LI Feng. Department of Gastroenterology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai (200032)Correspondence to: LI Feng, Email: li.feng2@zs⁃Abstract Non⁃alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a chronic liver disease caused by abnormal accumulation offat in the hepatocytes. Its prevalence is rising globally and has become the most common cause of chronic liver disease worldwide. The pathogenesis of NAFLD is multifaceted, involving insulin resistance, genetic and epigenetic factors, chronic systemic inflammation, mitochondrial dysfunction, endoplasmic reticulum stress, diet, gut microbiota, and other significantcontributors. This article primarily delves into the mechanisms of mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress in the development of NAFLD, aiming to provide new insights and therapeutic strategies for NAFLD.Key words Non⁃Alcoholic Fatty Liver Disease;　Mitochondrial Dysfunction;　Endoplasmic Reticulum Stress;　Oxidative Stress;　Unfolded Protein ResponseDOI ： 10.3969/j.issn.1008⁃7125.2022.12.007*基金项目：复旦大学附属中山医院科研基金⁃308（2019ZSFZ09）#本文通信作者， Email: li.feng2@zs⁃非酒精性脂肪性肝病（non⁃alcoholic fatty liver disease, NAFLD ）指在无酒精作用下，以肝内细胞脂肪过度沉积为特征的慢性渐进性肝病。

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雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤后的运动功能障碍摘要:哺乳动物雷帕霉素的受体(mTOR)是负向调节自噬的丝氨酸/苏氨酸激酶。

雷帕霉是mTOR 信号抑制剂，可以促进自噬并在中枢神经系统 (CNS) 的几种疾病中起到神经保护作用。

在本研究中，我们评估了小鼠脊髓损伤 (SCI) 后，应用雷帕霉素是否促进自噬，并降低神经组织损伤和减少运动功能障碍。

我们的结果表明雷帕霉素的应用大大减少了损伤脊髓组织中p70S6K 蛋白质的磷酸化以及LC3和Beclin 1 的高表达。

此外，损伤脊髓组织中，雷帕霉素组的神经元丢失和细胞死亡率明显低于溶剂对照组。

并且，在大鼠后肢运动功能评分--（BMS评分）中，雷帕霉素处理组得分明显高于溶剂对照组。

这些结果表明，脊髓损伤后，雷帕霉素通过抑制 mTOR 信号通路，提高自噬水平，并减少神经组织损伤和运动功能障碍。

脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗可能成为一种新的治疗策略。

关键词：自噬；Beclin1；LC3；雷帕霉素靶蛋白；雷帕霉素；脊髓损伤前言：雷帕霉素是一种大环内酯类药物，最初被用作抗真菌剂。

雷帕霉素是一种特殊的哺乳动物雷帕霉素受体阻滞剂(Ravikumar et al., 2004; Schmelzle and Hall, 2000)。

它结合于胞质的FK结合蛋白(FKBP12)。

雷帕霉素-FKBP12复合物抑制mTOR，阻止p70S6K 和4EBP1的磷酸化(Vignot et al., 2005)。

因此，雷帕霉素抑制mTOR 从而促进自噬(Kamada et al., 2004;Klionsky and Emr, 2000;Schmelzle and Hall, 2000; Wang and Klionsky, 2003)。

自噬是一种细胞内的分解代谢的机制，通过自噬溶酶体途径降解细胞质成分(Mizushima, 2004)。

这种机制对维持稳态起着重要的作用，在某些疾病中起到保护作用(Hara et al., 2006; Liang et al., 1999; Ru-binsztein et al., 2005; Shintani and Klionsky, 2004)。

自噬在细胞生长和应激状态下清除或者再利用长寿蛋白和受损的细胞器(Levine and Klionsky, 2004;Shintani and Klionsky, 2004)。

已有研究表明，自噬对正常细胞的生长，分化和存活也很重要(Reggiori and Klionsky, 2002; Schmelzle and Hall, 2000)。

新近研究表明，应用雷帕霉素能够增强自噬，在亨廷顿病和帕金森病等某些神经退行性疾病中能够保护神经细胞(Malagelada et al., 2010; Ravikumar et al.,2004)。

在这些退行性疾病中，应用雷帕霉素诱导自噬能够增强对聚集蛋白的清除从而减少其毒性(Berger et al., 2006; Webb et al., 2003)。

以往的研究表明，在创伤性脑损伤和脑缺血后的神经组织中自噬活动是增强的(Bigford et al., 2009; Diskin et al., 2005; Ramiet al., 2008)。

应用雷帕霉素增强自噬的活性并降低脑外伤和新生儿缺氧缺血性脑损伤的神经组织损伤(Carloni et al., 2008; Erlich et al., 2007a)。

一些研究也表明，自体吞噬增强可以减少受中枢神经系统（CNS）中受损神经细胞的凋亡(Carloni et al., 2008; Pan et al.,2008)。

因此，使用雷帕霉素促进自噬被认为能够在中枢神经系统中起到神经保护功能。

我们此前曾报道，脊髓损伤（SCI）后受损的神经组织中自噬活性显著增强(Kanno et al., 2009b, 2011)。

然而，在SCI后受损神经组织中细胞自噬的实际功能目前还不清楚(Kanno et al., 2009c)。

此外，雷帕霉素治疗是否能促进细胞自噬和诱导脊髓损伤后受损的神经组织的神经保护功能仍有待阐明。

本研究的目的是，应用脊髓损伤小鼠模型，检测脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗是否抑制mTOR信号通路，促进细胞自噬。

我们还研究了脊髓损伤后，应用雷帕霉素治疗是否可降低脱髓鞘，神经元减少和细胞死亡等神经组织损伤，以及是否提高运动功能恢复。

我们在这里展示，在损伤的脊髓组织应用雷帕霉素治疗可通过抑制mTOR通道显著提高自噬活动。

此外，雷帕霉素显著减少脊髓损伤后的神经组织损伤和提高运动功能。

因此，应用雷帕霉素可能是一种新的治疗脊髓损伤的策略。

方法：实验动物所有的实验程序，通过日本东北大学动物管理和使用委员会的批准。

所有的努力都是尽量减少实验动物的用量，并在研究中尽可能地减少动物的痛苦。

共58只成年C57BL/6J雌性鼠（10-12周龄）用于本实验。

在每个时间点每组实验用四个或五个动物。

老鼠在24℃条件下饲养，每笼3或4只，术前术后均自由饮食。

脊髓挫伤模型将 1.25％氟烷混合于氧/氧化亚氮（30/70％）的混合气体中麻醉小鼠。

手术过程中，通过一个加热垫监测和维持直肠温度在37.0±0.5 ℃。

脊柱区皮肤去毛并用消毒液清洗。

沿中线切开皮肤15毫米，暴露T8到T12的椎板。

在T10行椎板切除术，露出带完整硬脑膜的背部脊髓。

脊柱用互成角度的夹子夹住T8和T12的横突一保持稳定。

脊髓损伤的模型制作应用改良的纽约大学脊髓打击器(Bassoet al., 1996; Gruner, 1992; Hashimoto et al., 2007; Kanno et al.,2009a; Kim et al., 2001; Okada et al., 2004)。

重量10g的打击棒（顶端直径1.5mm）从3mm高出落在T10脊髓节段上。

肌肉和皮肤分层闭合。

每天挤压膀胱两次直到自主排尿。

对假手术动物进行了同样的手术程序，但没有打击脊髓。

雷帕霉素的制备和用药雷帕霉素（Calbiochem公司）溶解在二甲基亚砜（DMSO）（25毫克/毫升）中，并进一步稀释在0.5毫升含有5％的聚乙二醇400和5％的失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（Tween 80简称乳化剂T-80）的水溶液中，配制后立即注射。

SCI4小时后，雷帕霉素治疗组的小鼠，腹腔内注射雷帕霉素，剂量为1毫克/公斤体重。

对照组小鼠注射等体积的溶剂。

行为分析为了评估SCI后的功能，制定了应用后肢运动功能评分（BMS）的等级评定表(Basso et al., 2006; Engesser-Cesar et al., 2005)。

这个标准是专门为小鼠制定的，因为小鼠与大鼠的运动恢复的特性是不同的。

我们也分析了BMS的分项分数，因为一些动物可以改善某方面的运动功能，而不遵循典型的模式恢复，并因此不会反映在BMS总得分上(Basso et al., 2006)。

在手术前，将小鼠单独放置在一个设定的开放的塑料区域4分钟，以确保所有实验对象获得最大得分值。

小鼠被放置在开放的领域，受过训练研究员以双盲的方式评测小鼠的的BMS分值。

在SCI后4 h和24 h，3，7，14，21，28，35，和42天测得BMS分值。

Western blot检测在SCI后24小时或3天处死小鼠，取出脊髓组织。

脊髓放于裂解缓冲液中，裂解液包括50mM Tris HCl（pH值7.6），20mM氯化镁，150mM的NaCl，0.5％的Triton-X，5单位/毫升抑肽酶，5微克/毫升亮肽素，5微克/ mL胃酶抑素，1mM苄脒，1mM苯甲磺酰氟。

离心去除残余脊髓组织，根据BioRad 蛋白浓度测定手册测定溶解液中的蛋白水平(Bio-Rad Laboratories, GmbH, Munich, Ger-many)。

溶胞产物中的蛋白质，在15％凝胶上通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，然后电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。

对膜进行封闭1 h在TBST缓冲液中（pH为7.5的0.01M的Tris盐酸，0.15M NaCl 和0.05％吐温20）含有3％的牛奶，和孵育兔抗hospho p70S6K的抗体（1:1000，Cell Signaling公司），兔抗-LC3的抗体（1:500; MBL）或稀释的兔抗-Beclin 1的抗体（1:100，Santa Cruz Biotechnology 公司），在4℃下， TBST缓冲液中过夜。

将膜洗涤三次，并在室温下放于与辣根过氧化物酶（1:1000; Invitrogen公司）结合的二抗中孵育1小时。

免疫反应的条带，应用增强的化学发光试剂（Amersham公司）和数字化的LAS-1000 Pro（FUJIFILM，东京，日本）显影。

应用扫描密度分析和图像J 1.42q软件程序对定量条带的密度（美国国立卫生研究院）。

用β微管蛋白对条带密度的数量进行标准化，然后，这些数量值与雷帕霉素处理组，溶剂处理组和假手术对照组进行比较。

组织制备脊髓损伤后3天及42天，向小鼠腹腔内过量注射100毫克/公斤的戊巴比妥钠。

小鼠穿心灌注生理盐水，然后置于由4％的多聚甲醛和0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合的pH 7.4混合液中。

用于免疫组化染色的脊髓节段，含损伤部位一起收集后固定在相同的固定液中4℃过夜，之后用石蜡包埋。

围着受伤的部位切取7微米厚的切片装于玻片上。

连续切取9个周长250微米的切片，跨越脊髓损伤中心部位2000微米的长度。

如在描述的是用于免疫组织化学染色的切片制备。

免疫组织化学免疫组化染色检测LC3和自噬基因Beclin1使用SCI 3天后的切片。

切片脱蜡后再水化，然后在PBS中洗涤10分钟，然后用PBS含有0.3％聚氧乙烯去水山梨醇洗涤10分钟，，并用含3％的乳剂和5％牛胎儿血清（FBS）的0.01M的PBS冲洗2小时。

切片置于PBS稀释的兔抗-LC3的抗体（1:100; MBL），兔抗-Beclin 1的抗体（1:100;圣克鲁斯生物公司）或鼠标的anti-NeuN抗体（1:100，Chemicon公司）中4℃过夜。

用PBS冲洗后，将切片与山羊抗兔IgG的AlexaFluor594二抗（1:500，Molecular Probes公司）或山羊抗小鼠IgG 的Alexa Fluor488的二抗（1:500，Molecular Probes公司）中，在室温下孵育1小时。

切片包埋于含DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的Vectashield中标记细胞核。

在每个实验中，在同一时间对切片进行染色。

LC3阳性细胞和Beclin 1的阳性细胞计数免疫组织化学染色LC3和自噬基因Beclin1后对每个切片均使用激光显微镜（(BX 51;Olympus, Tokyo, Japan)）扫描。