脂肪酶酶活测定方法

脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。

2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。

方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。

以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。

方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。

b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。

上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。

万方数据苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法．１．３．３对硝基苯酚法对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。

Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积．２３种方法的比较２．１实验仪器和操作难易程度的比较平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。

培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２·１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。

超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。

精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。

操作简单［２·１８］（表１）．２．２实验试剂及精确度的比较平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。

精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。

脂肪酶实验方案富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0.溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6.0 ,7.0 ,8. 0.种子培养基( %) :葡萄糖 2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0.1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0.发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。

观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。

脂肪酶高产菌株的筛选：（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按 1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。

脂肪酶的测定脂肪酶是一种能够加速脂肪分解的酶类物质，它在人类的体内起着非常重要的作用。

脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，可以用于研究肥胖、代谢疾病等疾病的发病机制。

脂肪酶的测定方法有很多种，其中最常用的是化学法和免疫法。

化学法是利用化学反应测定脂肪酶的活性，它的原理是将样品与一种特定底物反应，通过测定产生的底物或反应产物的浓度，来计算脂肪酶的活性。

常用的底物有三酰甘油、辅酶A等。

免疫法则是利用特异性抗体与脂肪酶结合反应，进行测定。

这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单等优点。

在进行脂肪酶测定前，需要收集样品。

常用的样品有血浆、血清、尿液等。

对于血浆和血清样品，需要在采集后立即离心分离血清或血浆，避免冷藏时间过长而影响测定结果。

对于尿液样品，需要在采集后立即保存在冰箱中，避免样品在室温下发生酶解反应。

此外，还需要注意样品的质量和数量，以保证测定结果的准确性。

脂肪酶的测定结果可以反映人体脂肪代谢能力的强弱。

正常情况下，脂肪酶的活性处于一定的范围内。

如果脂肪酶活性过高，说明人体脂肪代谢能力较强，有利于减肥和预防肥胖等疾病；反之，如果脂肪酶活性过低，说明人体脂肪代谢能力较弱，容易出现肥胖和代谢性疾病等问题。

需要注意的是，脂肪酶的测定结果并不是唯一的评估指标，还需要结合其他指标如体重、体脂率、血糖、血脂等指标进行综合分析。

此外，脂肪酶的测定结果也受到许多因素的影响，如年龄、性别、饮食、运动等因素都会对脂肪酶活性产生影响，因此需要综合考虑。

脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，它对于研究肥胖和代谢疾病等疾病的发病机制具有重要的意义。

在进行脂肪酶测定时，需要注意样品的采集、处理和测定方法的选择，以保证测定结果的准确性。

▲制备乳化液
第一次制作乳化液选择高速捣碎机。

将４％ＰＶＡ溶液１００　ｍＬ和底物混合，可以在冰箱中静置５￣１０℃保持１￣２　ｈ，随后向捣碎机转移，这样操作９　ｍｉｎ　３次，乳化液可以保存在冰箱中，在之后的每一次使用时重新实施乳化。

第二可以选择乳化液初步选择超定的功率下严格实施超声乳化处理，在对底物乳化温度控制时可以考虑使用水浴，在冰箱中储存乳化液，再一次应用时需要重新实施乳化。

检测脂肪酶活力的方法
▲抽提正己烷方法
在甘氨酸缓冲液中放置１　ｍＬ橄榄油，添加规定数量的酶液在３７℃的情况。

脂肪酶的检测方法1. 引言脂肪酶是一类能催化脂肪酯的水解反应的酶。

脂肪酶在食品工业、医学领域等具有重要的应用价值。

为了准确、快速地检测脂肪酶的活性和浓度，科学家们开发了多种检测方法。

本文将详细介绍脂肪酶的相关概念以及常用的检测方法，并对其优缺点进行比较分析。

2. 脂肪酶的概述脂肪酶是一种水解酶，主要催化脂肪酯的水解反应，将脂肪酯分解为甘油和脂肪酸。

脂肪酶广泛存在于动植物的组织中，如胃液、胆汁、胰液等。

脂肪酶的作用对于人体的脂肪消化和吸收至关重要，但过高或过低的脂肪酶活性都可能对人体健康产生不良影响。

3. 脂肪酶的检测方法概述常见的脂肪酶检测方法包括传统的酶活性测定法、光谱法、电化学法、电镜法等。

下面将分别介绍这些方法的原理、步骤以及优缺点。

3.1 传统的酶活性测定法•原理：该方法通过测定脂肪酶对底物的水解反应，间接反映脂肪酶的活性。

•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。

2.混合样品和底物溶液，并控制反应条件（温度、pH等）。

3.反应一段时间后停止反应。

4.使用比色法、比浊法等方法来测定反应产物（如甘油）的含量。

•优点：方法简单、成本低廉。

•缺点：测定结果受其他干扰物影响较大，灵敏度相对较低。

3.2 光谱法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中底物或产物的光学性质变化来检测脂肪酶活性。

•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。

2.在一定时间内记录底物或产物的光谱变化。

3.分析光谱数据，计算脂肪酶活性。

•优点：结果准确、灵敏度较高。

•缺点：需要专用的光谱仪器，成本相对较高。

3.3 电化学法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中产生的电流或电势变化来检测脂肪酶活性。

•步骤：1.在电极表面修饰脂肪酶或底物，并固定在电极上。

2.浸入电解质溶液中，建立电化学检测系统。

3.测量电流或电位的变化，并计算脂肪酶活性。

•优点：结果准确、实时监测。

•缺点：需要专用的电化学仪器，操作复杂。

3.4 电镜法•原理：该方法通过电镜观察样品中脂肪酶的形态和数量来评估脂肪酶活性。

2.3.2脂肪酶酶活的测定
采用橄榄油乳化法测定。

酶活定义：脂肪酶在40℃，pH8.0水解橄榄油乳化液每分钟产生1μmol 的脂肪酸所耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位。

（1）底物的制备：
A．称取PVA 20g，加入800mL水，在沸水中加热搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1000mL，得2%PVA溶液。

以干净的双层纱布过滤，取滤液备用。

B．量取2%PVA溶液150mL，加橄榄油50 mL，用高速组织捣碎机处理6min，即成乳白色PVA溶液，该溶液现配现用，冷藏有效期为1周。

（2）测定方法：
取两个150mL的锥形瓶，编号为空白A和样品B。

分别于A和B中各加入5 mL底物溶液和4mLpH8.0的磷酸缓冲液，再向A中加入20 mL无水乙醇。

将A、B 于40℃水浴5min，然后向A、B中各加入待测酶液1 mL，立即混匀计时，40℃水浴10min后，向B中补加20 mL无水乙醇终止反应，取出。

将A和B中加两滴酚酞，用0.05mol/LNaOH溶液滴定，直至微红色并保持30秒不褪色为终点，记录耗NaOH溶液的体积。

脂肪酶活力=（b-a）×N×F/T
式中：b——样品耗NaOH溶液毫升数；
a——空白耗NaOH溶液毫升数；
N——每毫升NaOH的微摩尔数；
F——稀释倍数；
T——反应时间（min）。

由于缓冲液离子强度低，为减小误差，反应后净耗0.05mol/LNaOH溶液体积为1.5～2.5mL为宜。

脂肪酶的检测方法
脂肪酶是一种重要的酶类物质，它在人体内起着分解脂肪的作用。

脂肪酶的检测方法有多种，下面将介绍其中的几种常见方法。

1. 酶活力测定法
酶活力测定法是一种常见的脂肪酶检测方法。

该方法通过测定脂肪酶对底物的催化作用，来确定脂肪酶的活力。

具体操作步骤为：将待测样品与底物混合，加入适量的缓冲液，然后在一定的温度和时间下反应。

反应结束后，通过测定反应液中的产物浓度或底物消耗量来计算脂肪酶的活力。

2. 免疫学检测法
免疫学检测法是一种基于抗体与抗原相互作用的检测方法。

该方法通过检测脂肪酶在样品中的含量，来确定脂肪酶的水平。

具体操作步骤为：将待测样品与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

然后加入标记有荧光物质的二抗，使其与复合物结合。

最后通过荧光信号的强度来测定脂肪酶的含量。

3. 基因检测法
基因检测法是一种通过检测脂肪酶基因的变异来确定脂肪酶水平的方法。

该方法通过PCR扩增脂肪酶基因，然后对扩增产物进行测序，检测基因序列中的变异情况。

根据不同的基因变异类型，可以预测脂肪酶的活力水平。

总之，脂肪酶的检测方法有多种，每种方法都有其特点和适用范围。

在实际应用中，应根据需要选择合适的方法进行检测。

一．脂肪酶活测定原理：脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。

在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。

水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。

酸碱滴定法 :酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。

脂肪酶活力单位＝(A-B)*nf/t*v式中：A为样品耗碱液ml数，B为对照组耗碱液ml数，n为每毫升碱液微克分子数(n=cM=0.05x23x1000)，f为稀释倍数，t为作用时间(分),v:反应的酶液的体积二．挥发性脂肪酸（VFA）的测定滴定法分析1原理：将废水以磷酸酸化后，从中蒸发出挥发性脂肪酸，再以酚酞为指示剂用NaOH 溶液滴定馏出液。

废水中的氨态氮可能对测定形成干扰，因此应当首先在碱性条件下蒸发出氨态氮。

4．计算挥发性脂肪酸含量计算如下：VFA=V (NaOH)*C*1000/Vs (mmol/L)式中：V(NaOH)-----滴定消耗的NaOH标准溶液的体积，ml;c ------ 滴定消耗的NaOH标准溶液的准确浓度，mol/L;Vs--------被测废水水样的体积，ml.酶活力定义：40℃,ph为5.6的条件下，每分钟酶解淀粉释放出lmg的还原糖(葡萄糖)所需酶量为一个酶活力单位。

1U=1mg还原糖\min.ml酶三．淀粉水解酶活性原理：淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位体积样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

四.纤维素酶酶活力测定：原理：纤维素酶水解纤维素，产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定的范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系，利用比色法测定其还原糖的量就可测定纤维素酶的活力。