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重组乙型肝炎疫苗（酵母）免疫后10年的抗体持久性调查研究目的：调查研究重组乙型肝炎疫苗（酵母）免疫后10年的抗体持久性。
方法：以广西北海市2002年出生的按照免疫程序0、1、6月接种3剂5μgHepB-Y 的200例儿童为研究对象，于2002年对儿童进行免疫后，定期对儿童进行随访并对儿童的静脉血进行采集。
调查随访儿童免疫后1年和免疫后10年血清抗-HBs的动态以及下降动态，同时分析随访儿童免疫后5年抗-HBs呈阴性者再次接种HepB-Y后血清的抗-HBs动态。
结果：被随访儿童重组乙肝疫苗免疫后10 年，抗-HBs的阳性率由免疫后1年的92.96%下降至10年后的60.53%；抗-HBs 的有效阳性率由84.51%下降至30.26%；GMC由28.55 mIU / ml下降至4.38 mIU / ml。
血清抗-HBs阳性率、有效阳性率及GMC的年平均遞减率依次为3.32%、6.14%、11.13%。
同时，本组随访儿童免疫后5年抗-HBs呈阴性者共32例，再次接种HepB-Y后其抗-HBs 阳性率、有效阳性率均达100%。
结论：被随访儿童重组乙肝疫苗免疫后10 年，血清抗-HBs的阳性率、有效阳性率及GMC均呈现出逐年下降的趋势，免疫后5-10年建议加强HepB-Y免疫。
标签：乙肝；HepB-Y；抗体持久性2002年，我国明确推荐使用重组乙肝疫苗（酵母）（H epB- Y）[1] 。
截至现今，HepB-Y 在我国大量使用时间相对较短，其免疫的持久性成为我国免疫规划关注的热点。
本文以广西北海市2002年出生的按照免疫程序0、1、6月接种3剂5μg HepB-Y的200例儿童为研究对象，调查HepB-Y免疫后10年的抗体持久性，现报告如下。
1 资料与方法1.1一般资料选择广西北海市2002年出生的按照免疫程序0、1、6月接种3剂5μg HepB-Y 的200例儿童为研究对象，其中，男121例，女79例。
重组乙肝疫苗(酵母)免疫效果观察
王玉玲;姚颖;于秋洁;白秀珍
【期刊名称】《疾病监测与控制》
【年(卷),期】2014()1
【摘要】目的了解1～5岁儿童接种乙肝疫苗的免疫效果。
方法母亲孕期化验乙肝表面抗原阴性，小儿出生后按0、1、6月程序接种北京生物制品有限公司生产的重组乙肝疫苗。
结果随着年龄的增加和接种乙肝疫苗时间的延长，乙肝表面抗体（抗-HBs）下降，5岁～组较3岁～组较1岁～组抗-HBs阳转率下降。
结论为有效的预防乙型肝炎，常规0，1，6月接种乙肝疫苗后应在3～5岁检测抗-HBs，阴性者应全程再次接种乙肝疫苗。
【总页数】2页(P12-12)
【关键词】基因重组;乙肝疫苗;免疫效果
【作者】王玉玲;姚颖;于秋洁;白秀珍
【作者单位】内蒙古医科大学附属人民医院儿保计划免疫科
【正文语种】中文
【中图分类】R512.6
【相关文献】
1.不同人群接种重组(汉逊酵母)乙肝疫苗后免疫效果观察 [J], 孙迎春;朱丽君;张智;高冬梅;董桂华
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智;高冬梅;董桂华
3.在90例婴儿接种重组酵母乙肝疫苗免疫效果观察及随访 [J], 杨洁芳
4.南昌300名大学生接种重组酵母乙肝疫苗免疫效果观察 [J], 林少龙;封木忠;尧晓云;林丽珍;吴小兰;许爱珍;周红梅
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重组酵母乙肝疫苗体外效力测定方法康晓冬;马小明【摘要】通过研究重组（酵母）乙肝疫苗体外效力的测定方法。
对重组（酵母）乙肝疫苗体外效力进行评价分析，为其在生产实践中的应用及疾病控制中能否达到预期效果提供理论依据。
【期刊名称】《中国畜牧兽医文摘》【年(卷),期】2013(000)004【总页数】2页(P35-35,71)【关键词】酶联免疫吸附实验;乙型肝炎病毒抗原【作者】康晓冬;马小明【作者单位】宁夏农林科学院草畜工程技术研究中心，宁夏银川 750002;宁夏农林科学院草畜工程技术研究中心，宁夏银川 750002【正文语种】中文1 材料和方法1.1 试剂1.1.1 2 mol/L磷酸盐缓冲液（含0.15 mol/L氯化钠，pH7.2）称取氯化钠8.850 g，二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.226 g和十二水磷酸氢二钠（NaH2PO4·12H2O）1.698 g溶于适量水中，调pH至7.2，加水至1 000 ml。
1.1.2 供试品处理液量取20%二乙醇胺0.25 ml和10% Triton X-100 0.20ml，加pH7.2PBS至10 ml。
1.1.3 20%二乙醇胺储备液量取二乙醇胺DEA（在室温下该品可能会边厚或者结晶使用前可加热到30℃以液化）2 ml。
加pH7.2PBS至10 ml。
置于棕色瓶中室温保存，室温暗处可保存4个月。
供试品稀释液取牛血清白蛋白10.0 g，加磷酸盐缓冲液使溶解成1 000 ml，即得。
1.1.4 10% Triton X-100储备液量取1ml10% Triton X-100加PH7.2PBS至10 ml。
室温可保存4个月。
如果该溶混浊请勿使用。
1.1.5 1%硫柳汞溶液称取硫柳汞1g，加pH7.2PBS至100ml，溶解即。
1.1.6 样品稀释液 1%BSA，0.01%硫柳汞溶液，用PBS溶解。
1L的配制方法：取BSA10.0 g置于烧杯中，加pH7.2PBS溶液，约800 ml。
时间：地点：主讲：胡永珍参加人员：内容：重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。
第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。
但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。
第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。
第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。
第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。
根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。
第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。
因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。
筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。
由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。
但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。
.....重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）Chongzu Yixing Ganyan Yimiao (Niangjiu Jiaomu)Hepatitis B Vaccine Made by Recombinant DNA Techniques inSaccharomyces Cerevisciae Yeast本品系由重组酵母菌表达的乙型肝炎(简称乙肝)病毒表面抗原（HBsAg）经纯化、加入铝佐剂制成，用于预防乙型肝炎。
1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2 制造2.1 生产用菌种2.1.1 名称及来源生产用菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母原始菌种，菌种号为2150-2-3（pHBS56-GAP347/33）。
2.1.2 种子批的建立应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。
由美国默克公司提供的菌种经扩增1代为主种子批，主种子批扩增1代为工作种子批。
2.1.3 种子批检定主种子批及工作种子批应进行以下项目的全面检定。
2.1.3.1 培养物纯度培养物接种于哥伦比亚血琼脂平板和酶化大豆蛋白琼脂平板，分别于20~25℃和30~35℃培养5~7天，应无细菌和其他真菌被检出。
2.1.3.2 HBSAg基因序列测定应与美国默克公司提供菌种的HBSAg基因序列保持一致。
2.1.3.3 质粒保有率采用平板复制法检测。
将菌种接种到复合培养基上培养，得到的单个克隆菌落转移到限制性培养基上培养，计算质粒保有率，应不低于95%。
PR%= [A /（A+L）] ×100式中PR为质粒保有率，（％）；A为在含腺嘌呤的基本培养基上生长的菌落数，CFU/皿；A+L为在含腺嘌呤和亮氨酸的基本培养基上生长的菌落数，CFU/皿2.1.3.4 活菌率采用血细胞计数仪器，分别计算每毫升培养物中总菌数和活菌数，活菌率应不低于50%活菌率=活菌数/总菌数×100%.....2.1.3.5抗原表达率取种子批菌种扩增培养，采用适宜的方法将培养后的细胞破碎，分别用Lowry法测定破碎液的蛋白质含量，并采用酶联免疫法或其他适宜方法测定HBsAg含量。
【关键字】精品核准日期：2010年3月26日重组乙型肝炎疫苗（酵母）说明书【药品名称】通用名称：重组乙型肝炎疫苗（酵母）英文名称：Hepatitis B Vaccine Made by Recobinane DNA Techniques Yeast汉语拼音：Chongzu Yixingganyan Yimiao (jiaomu)【成分和性状】本品系由重组酵母表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）经纯化，加氢氧化铝佐剂制成。
本品单次人用剂量1.0ml含有：主要活性成分：60ug；辅料成分：氢氧化铝、氯化钠；含硫柳汞防腐剂（含量不高于2.0ug/ml）.本品外观为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散。
【接种对象】本疫苗适用于对乙肝疫苗常规免疫无应答的16岁及以上年龄的乙型肝炎易感者。
以上所述“无应答者”系指按照常规免疫程序和剂量接种3剂乙肝疫苗后，经采血确认其抗体水平未达到阳转者（≥10IU/ml为阳转标准）。
【规格】每支1.0ml。
每1次人用剂量1.0ml。
含HBsAg60ug。
【免疫程序和剂量】(1)于上臂三角肌肌内注射(2)根据目前的临床研究结果，推荐无应答者接种1剂（1.0ml），经采血确认其抗体水平仍未达到阳转者再考虑接种第二剂，两剂价格至少四周以上。
【不良反应】基于国内已完成的1105例16岁以上无应答者的临床试验结果汇总分析（详见【临床试验】），60ug（445例）、30ug（439例）和10ug（221例）疫苗组不良反应总体发生率分别为33.03﹪、31.21﹪、29.86﹪.所观察到的不良反应均以1级不良反应为主，未发生3级以上不良反应，所有不良反应均在7日内发生。
常见不良反应:局部反应表现为注射局部疼痛、硬结、红斑、肿、出疹、瘙痒等；全身反应表现为：发热、头痛、疲倦乏力、变态反应、肌肉痛；偶见不良反应有恶心呕吐、腹泻和咳嗽等。
一般不需特殊处理，可自行缓解，必要时可对症治疗。
尽管本疫苗临床试验中未发现一下罕见不良反应，但接种时应注意密切观察：过敏性休克、脱髓鞘、过敏性皮疹、血小板减少性紫癜、神经系统疾病、急性肾小球肾炎和肝肾疾病。
凝胶限量法检查重组酵母乙肝疫苗中的细菌内毒素一、 实验目的掌握细菌内毒素检查法。
二、 实验原理细菌内毒素检查法广泛应用于药品、生物制品的质量控制。
内毒素检查有两种方法：凝胶法和光度测定法。
其中凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU ）表示。
细菌内毒素检查法在细菌内毒素限量值（L ）与理论最大有效稀释倍数（MVD ）确定后，还要进行鲎试剂灵敏度复核试验和供试品预干扰试验、干扰试验等操作。
本实验从干扰试验开始进行。
三、 实验材料与仪器供试品：重组（酵母）乙肝疫苗，细菌内毒素快速检测试剂盒（湛江安度斯生物有限公司）、漩涡混合器、电热恒温水浴锅、玻璃试管、带针头微量注射器等。
细菌内毒素快速检测试剂盒：内毒素标准品（CSE ），3EU/支鲎试剂（TAL ），0.25EU/ml细菌内毒素检查用水（ETW ），2ml/支四、 实验步骤1、细菌内毒素限量值（L ）的确定：MKL =其中L 为供试品德细菌内毒素限值，以EU/ml 表示，K 为每公斤体重每小时可接受的内毒素剂量，K=5EU/(kg •h)表示。
人均体重按60kg 计算，注射时间按1h 计算，供试品剂量为1ml 计算，M=1/60 ml/（kg •h ），以此计算L=300EU/ml ，为理论内毒素限值。
2、理论最大有效稀释倍数（MVD ）的确定：λcL MVD =其中L 为理论内毒素限值，L=300EU/ml ，c 为供试品溶液的浓度当L 以EU/ml 表示时，c=10μg/ml ，λ为鲎试剂标示灵敏度，mlEU/25.0=λ，以此计算MVD=1200。
3、内毒素标准品（CSE）稀释向1支内毒素标准品（3EU）中加入0.6ml的细菌内毒素检查用水（ETW），混匀2~3min，得到5EU/ml的CSE，CSE（5EU/ml）再用ETW配制5（0.1EU/ml）、10（0.5EU/ml）倍稀释液，备用。
中国生物制品学杂志2013年9月第26卷第9期Chin J Biologicals September 2013，Vol.26No.9重组乙型肝炎疫苗（酵母）是由重组酵母菌表达的乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg ）经纯化，加入铝佐剂制成。
鉴别试验是重组乙型肝炎疫苗常规的检测项目，《中国药典》三部（2010版）中规定重组乙型肝炎疫苗鉴别试验采用ELISA 法［1］，但重组酵母菌表达的HBsAg 经铝佐剂吸附后不能直接检测，而且ELISA 法检测时间也较长。
本实验用处理液将重组乙型肝炎疫苗（酵母）上的铝佐剂解离下来，再采用胶体金法检测疫苗中的HBsAg ，并对该方法进行验证，以期建立稳定的重组乙型肝炎疫苗（酵母）快速鉴别试验。
1材料与方法1.1疫苗及参考品重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）、重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）和甲型乙型肝炎联合疫苗分别来自3个不同的生产厂家（编号为A 、B 、C ）；甲型肝炎灭活疫苗（批号：2009113001）由厂家C 提供；重组（酵母）乙型肝炎疫苗冻干参考品重组乙型肝炎疫苗（酵母）快速鉴别试验方法的建立王静，白亦昊，周长明，纪宏，武晗燕北京市药品检验所，北京100035摘要：目的建立重组乙型肝炎疫苗（酵母）快速鉴别试验方法。
方法选取不同的处理液对吸附铝佐剂的3批重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）进行解离，采用胶体金法检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg ），筛选快速鉴别试验的最佳处理液；优化快速鉴别试验的反应温度和反应时间，并对该方法进行特异性、灵敏度和重复性验证。
结果处理液A （10%Triton X -1000.20ml 、20%二乙醇胺1.25ml 、0.01mol ／L PBS 8.55ml ）为重组乙型肝炎疫苗快速鉴别试验的最佳样品处理液；快速鉴别试验的最佳反应温度为25℃，最佳反应时间为15min ；该方法特异性较强，重复性良好，最低检出限为1.375μg ／ml 。
结论建立了重组乙型肝炎疫苗（酵母）快速鉴别试验方法，为该疫苗的快速鉴别提供了参考。
关键词：重组乙型肝炎疫苗；酵母；快速鉴别试验中图分类号：R373.2+1R392-33文献标识码：A 文章编号：1004-5503（2013）09-1334-03Development of a method for rapid identity test on recombinanthepatitis B vaccine （yeast ）WANG Jing,BAI Yi -hao,ZHOU Chang -ming,JI Hong,WU Han -yanBeijing Institute for Drug Control,Beijing 100035,China Corresponding author:ZHOU Chang -ming ，E -mail ：ZCM.602@Abstract ：Objective To develop a method for rapid identity test on recombinant hepatitis B （HB ）vaccine （yeast ）.Methods Three batches of recombinant HB vaccine containing aluminium adjuvant were dissociated with various treat －ment solutions and determined for HBsAg with colloidal gold stripes to screen the optimal treatment solution.The reaction temperature and reaction time for rapid identity test were optimized,and the developed method was verified for specificity,sensitivity and reproducibility.Results Treatment solution A,containing 0.20ml of 10%Triton X -100,1.25ml of 20%diethanol amine and 8.55ml of 0.01mol ／L PBS,was screened as optimal treatment solution for rapid identity test on recombinant HB vaccine （yeast ）.The optimal temperature and reaction time for the test were 25℃and 15min respective －ly.The developed method showed high specificity and high reproducibility,by which the minimum detection limit was 1.375μg ／ml.Conclusion A method for rapid identity test on recombinant HB vaccine （yeast ）was developed,which provided a reference for rapid identification of the vaccine.Key words ：Hepatitis B vaccine;Yeast;Rapid identity test·技术方法·通讯作者：周长明，E -mail ：ZCM.602@1334··DOI:10.13200/ki.cjb.000160（20001302）由中国食品药品检定研究院提供。
1.2主要试剂处理液A（10%Triton X-1000.20ml、20%二乙醇胺1.25ml、0.01mol／L PBS8.55ml）、处理液B（3%柠檬酸缓冲液，含柠檬酸钠3.0g、磷酸氢二钠0.588g、磷酸二氢钠0.166g、去离子水100ml）和处理液C［20%（w／v）柠檬酸钠］均由本所生化生检室配制；乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（胶体金法）购自北京万泰生物药业股份有限公司。
1.3快速鉴别试验最佳处理液的选择取3批（2012-03005、201203004、201109078）重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）500μl，于室温4000r／min离心5min，弃上清460μl，分别加处理液A、B、C40μl，混匀，反应15min，按照HBsAg胶体金试剂盒使用说明书将试纸条的加样端直接插入待测反应液中，放置30min，判断结果。
1.4快速鉴别试验反应条件的优化1.4.1反应温度的优化取3批（201203005、2012-03004、201109078）重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）500μl，于室温4000r／min离心5min，弃上清460μl，加处理液A40μl，混匀，分别于4、25、37℃下反应15min，检测处理后的样品，确定最佳反应温度。
1.4.2反应时间的优化取3批（201203005、201203004、201109078）重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）500μl，4000r／min离心5min，弃上清460μl，加处理液A40μl，混匀，在室温条件下，分别反应0、15、30min，检测处理后的样品，确定最佳反应时间。
1.5方法的验证1.5.1特异性验证取重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）（201109007）和甲型肝炎灭活疫苗各500μl，设平行对照，在室温下，4000r／min离心5min，弃上清460μl，加处理液A40μl，混匀，反应15min，检测处理后的样品；同时取重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）离心后的上清液40μl作为空白溶液，加处理液A40μl，混匀，反应15min，检测处理后的样品，验证该方法的特异性。
1.5.2灵敏度验证取重组（酵母）乙型肝炎疫苗冻干参考品（20001302）1支，加500μl水稀释成浓度为11μg／ml，再等比稀释成5.5、2.75、1.375、0.6875μg／ml4个浓度，各取40μl，分别加等体积的处理液A，反应15min后进行检测，验证该方法的灵敏度。
1.5.3重复性验证由不同实验员对同一批次的重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）及同一实验员对厂家A重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）10批（201203040、201203039-1、201203038-2、201203037-2、201202023-2、201202019-2、201109008-2、201109007、201109006、201109005）、厂家B重组乙型肝炎疫苗（汉逊酵母）10批（201205014、201204008、201204007-1、201204006-2、201203005-3、201203004-2、201202003、201202002-2、201202001、201109078-1）、甲型乙型肝炎联合疫苗8批（201205008、201205007、201205006、201205005、201205004、201205003、201205002、201204001）分别进行鉴别试验，以甲型肝炎灭活疫苗作为阴性对照。
2结果2.1快速鉴别试验的最佳处理液检测结果显示，经处理液A解离后的重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）检测结果呈阳性，经处理液B和C解离后的重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）检测结果均呈阴性，因此选择处理液A作为重组乙型肝炎疫苗快速鉴别试验的最佳处理液。
2.2快速鉴别试验的最佳反应条件2.2.1最佳反应温度处理液A在4、25、37℃下处理3批重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）15min后的检测结果均呈阳性，考虑试验的方便性和快捷性，选择室温（25℃）作为快速鉴别试验的最佳反应温度。
2.2.2最佳反应时间处理液A与3批重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）疫苗反应0、15、30min后的检测结果均呈阳性，反应0min样品的检测条带略浅于反应15和30min的检测条带，在检测结果相同的情况下，选择最短反应时间15min作为快速鉴别试验的最佳反应时间。
2.3方法的验证2.3.1方法的特异性处理液A解离的重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）的检测结果呈阳性，而甲型肝炎灭活疫苗和空白溶液的检测结果均呈阴性，表明该方法特异性较强。
2.3.2方法的灵敏度检测结果显示，11、5.5、2.75和1.375μg／ml的参考品可见条带，颜色由深至浅（图略）；而0.6875μg／ml的参考品未见条带。
