生物有机化学复习提纲
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一、鞠建华：绪论、酶1 .生物有机化学（Bioorganic Chemistry)：有机化学和生物化学的交叉学科，运用有机化学的理论和方法在分子水平上研究生命现象的化学本质。
2 .你还了解哪些天然产物或者分子具有哪些生物学功能？3共价键、氢键、配价键、离子键、疏水作用、范德华作用力4化学键，范德华力，氢键比较5 R/S构型生物分子立体效应的影响主要表现在：影响反应的活性和方向性；生物分子间的相互作用等。
1. 对反应活性的影响——邻基效应（proximity effects）2. 对反应立体选择性的影响（酶促反应的立体选择性例子）生物体内的基本有机反应1.水解反应:包括酯键、酰胺键和糖苷键的水解。
2.缩合反应:生成酰胺键、酯键、糖苷键的反应,其它缩合反应（羟醛缩合反应、克莱森酯缩合反应、迪克曼缩合）3.磷酰化反应4.氧化和还原反应5.烷基化反应（脂肪酸碳链增长反应）6.加成反应（亲电加成反应、亲核加成反应、环加成反应即迪尔斯-阿尔德反应）7.消除反应8.分子重排反应（克莱森重排、频哪醇重排、法沃尔斯基重排）9.异构化反应⏹酶（enzyme）是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的生物催化剂。
⏹生物催化（biocatalysis）是指利用酶或者生物有机体（细胞、细胞器、组织等）作为催化剂进行化学转化的过程。
举出生活中，酶应用的具体例子。
1.医用：胰蛋白酶——用于促进伤口愈合和溶解血凝块，还可用于去除坏死组织，抑制污染微生物的繁殖。
2.日用：加酶洗衣粉3.食用：凝乳酶——奶酪生产的凝结剂，并可用于分解蛋白质。
乳糖酶——降解乳糖为葡萄糖和半乳糖，获得没有乳糖的牛乳制品，有利于乳品的消化吸收。
4.美容：酶对生物催化的贡献与一般化学催化剂的异同？酶为什么需要形成活性中心？共性：在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点；作用机制都降低反应活化能不同点：酶效率高；底物特异性；酶在体系内处于不断变化中；催化作用由多种因素调节；对反应条件严格为什么酶的催化效率远远地比非催化剂或一般催化剂高？酶原：酶分子没有活性的前体物质。
酶原的激活：在一定条件下，酶原像有活性的酶转化的过程。
别构调节：指小分子化合物与酶蛋白分子活性中心以外的某一部位特异结合,引起酶蛋白分子构像变化、从而改变酶的活性。
抑制剂：引起酶活力降低的别构效应剂。
激活剂：引起酶活力增加的别构效应剂。
举例说明，研究酶抑制剂的现实意义？新药研发:农业:苯磺隆：磺酰脲类除草剂，抑制乙酰乳酸合成酶（ALS）的抑制剂，通过抑制ALS，阻碍侧链氨基酸如缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸的生物合成，导致杂草生长受破坏而死。
畜牧业:脲酶抑制剂不但能抑制瘤胃内脲酶活性，降低瘤胃中氨的浓度，而且可使氨的释放速度平稳，有利于微生物合成菌体豆角、决而提高反刍动物对尿素的利用率,并提高饲料转化率X-衍射晶体学手段研究酶的意义?❖测定酶分子的三维结构，明确其三维构件及结构域分布。
❖从原子级别，理解酶催化的机制。
❖基于酶分子三维结构的药物设计。
酶作为药物靶向目标，为药物前期开发提供了数据支持。
相比于化学合成，酶催化的合成有什么优势？化学合成：涉及糖分子中羟基的保护与脱保护，步骤多，产率低。
糖苷合成酶：催化糖苷合成，一步反应得到目标产物。
◆聚酮类化合物是一大类由细菌、真菌和植物将低级羧酸通过连续的缩合反应产生的天然产物，具有多样的碳骨架结构：◆聚肽类化合物是一类不以mRNA为模板，不需核糖体、tRNA的参与，由非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs）催化合成的天然产物。
其氨基酸原料除了20种蛋白质源的氨基酸外，还含有大量的非蛋白源氨基酸。
AT（acyl transferase，酰基转移酶）：负责将低级脂肪酸以CoA酯形式通过酰基携带蛋白ACP 的辅基；AT结构域对底物识别的特异性决定碳链延长单位的组成，AT结构域的数量和相应的模块决定聚酮体链的长度ACP（acyl carrier protein，酰基载体蛋白）：在聚酮链延伸中起到酰基转移的携带作用KS（ketoacyl-ACP synthase，酮脂酰-ACP 合成酶）：在聚酮链的延长中，起到催化新进入的酰基-ACP与已延长的聚酮中间体之间的缩合作用，使聚酮链得到进一步的延长KR（ketoreductase，酮基转移酶）：参与聚酮链形成过程中酮基的还原，使酮基变为羟基DH（dehydratase，脱水酶）：参与聚酮体碳链羟基的脱水；ER（enoyl reductase，烯醇还原酶），参与聚酮体碳链烯醇式结构中双键的还原反应TE（thioesterase，硫脂酶），通常位于PKS合酶C末端，催化聚酮体碳链末端羟基与酰基-ACP 硫酯的羰基进行亲核性的结合，使聚酮体环化，并将其从酶体中释放酶活力（enzyme activity）指酶促反应速率；即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。
酶的活性单位：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。
酶的比活力:是指单位质量（mg）的蛋白质所具有某种酶的活性，国际标准单位是U/mg或IU/mg米氏常数Km值具有重要的参考意义●Km可以判断酶的专一性和天然底物。
最小的底物通常是酶的最适底物●Km可以用于推断某一代谢反应的方向和途径微生物是现代工业酶开发的重要源泉，这是为什么？有何实例？微生物中酶的最适温度范围变化极大不可逆抑制（irreversible inhibition）有机磷化合物;有机汞、有机砷化合物;重金属盐;烷化试剂;抗生素1. 示例工作的研究背景1.1 什么是酰胺键？有机化学中，羧酸经活化再与胺进行亲核取代反应，形成的化学键即为酰胺键其中羧基可被活化成酰氯、脂、酰基咪唑、酸酐、酰基叠氮等1.2 酰胺键的生物合成多肽与蛋白质的生物合成－催化合成肽键；氨基酸或结构类似物在酰胺键合成酶催化下形成酰胺键1.3 相关工作的研究意义➢解析一类化合物的生物合成机制➢分析一个关键催化酶的理化性质➢发表科学研究内容提供研究参考➢建立后续开发工作基础2. 制定研究技术路线和方案3. 实验工作的开展3.1 获取目的基因序列并注释功能3.1.1 mcbA基因的生物信息学分析-1海洋b-咔啉生物碱Marinacarbolines A~D生物合成基因簇仅仅含三个基因3.1.2 mcbA基因的生物信息学分析-2利用NCBI数据库分析编码蛋白的结构域和功能等通过同源比对和保守结构域分析确定McbA的功能，活性位点和功能域3.1.3 mcbA基因的生物信息学分析-3同时找出一系列的同源蛋白进行比对进一步分析具体的催化功能3.1.4 mcbA基因的生物信息学分析-4分析发现McbA是一类ATP依赖性的酰胺键合成酶，在进化上有独特性功能蛋白的进化树分析－便于了解酶类型，选取合适的参考对象3.2 mcbA基因的克隆设计引物扩增目的基因片段，经测序鉴定后的目的片段连接原核表达载体如pET28a，导入E.coli BL21(DE3)表达菌株3.3 McbA蛋白的表达纯化如何计算蛋白的分子量？如何进行蛋白的表达纯化？如何保证酶蛋白活性稳定？3.4 McbA酶促反应检测方法－活性分析方法3.5 McbA酶促反应最适条件－活性分析基础（1）材料的选择•酶的来源：–野生型来源：动物、植物以及微生物等各种原料–异源宿主来源:目前多通过将相关酶基因克隆至异源微生物(大肠杆菌、酵母)宿主中，通过发酵法来生产酶制剂。
（2）细胞破碎（3）酶的抽提（4）酶的初步分离浓缩–盐析法–等电点沉淀法–有机溶剂分级分离法–选择热变性法（5）酶的纯化（6）酶的组合分离纯化策略（7）结晶和保存结晶–经过各种提纯方法获得较纯的酶溶液后，将酶进行结晶。
保存–固态：除盐后经冷冻干燥得到酶粉，低温下可以长期保存。
–液态：除盐后，浓缩，还在酶溶液中加入甘油、牛血清蛋白、巯基乙醇、半胱氨酸等保护剂，在低温下保存（-20 ℃或-80 ℃）。
1.酶基因的随机突变策略（1）易错PCR技术为代表的无性进化定义：从单一酶分子基因出发，采用不具有3’→5’校对功能Taq酶进行PCR扩增时，通过调整反应条件，改变Taq酶的突变频率，以一定的频率引入突变构建突变库，然后选择或筛选所要的突变体。
调整的PCR条件：a)增加Mg2＋（稳定非互补的碱基对）b)添加Mn2＋（降低聚合酶的特异性）c)4种底物的浓度不平衡（dATP/dTTP/dCTP/dGTP）突变频率的控制：理论上每个靶基因导入的取代残基的个数宜在1.5~5个之间。
连续易错PCR：将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次易错PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
无性进化：易错PCR技术产生的突变只发生在单一分子内部。
（2）DNA改组技术技术为代表的有性进化定义：–是从2种以上同源正突变基因出发，用酶（DNaseI）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
原理：–DNA片段互为模板和引物，进行扩增和延伸时碱基序列会重新排布而形成众多的突变基因，分离出全长突变基因后再进行常规PCR扩增以进行定向选择。
结果：–将存在于不同基因中的多种正突变结合在一起。
（3）基因家族之间的同源重组•定义：–又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶（DNaseI）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
•原理：–与DNA改组相同，过程亦相同。
•区别：–DNA改组从通过易错PCR等技术获得两个以上正突变基因出发进行重排；基因家族重排从基因家族中若干同源基因出发进行重排。
2.酶突变基因的定向选择•酶分子的定向进化=随机突变+正向重组+定向选择（筛选）•定向选择定义：–是在人工控制条件的特殊环境下，按照人们所设定的进化方向对突变基因进行筛选，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。
突变基因文库的筛选3.酶分子定向进化的应用a)提高酶分子的催化效率⏹实例1：L-天冬氨酸酶的定向进化研究–进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落；–得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶。
⏹实例2：β-内酰胺水解酶定向进化研究经过DNA重排技术其头孢噻肟的最低抑制浓度为原始菌株的32000倍，其对抗生素的耐受力增强证明其催化效率相应提高。
b)提高酶分子的稳定性实例1：枯草杆菌蛋白酶热稳定性的提高利用连续易错PCR和交错延伸方法重组DNA；枯草杆菌蛋白酶最适作用温度提高17℃，65℃的半衰期增加200倍。
