一、改良平板法建立铜绿假单胞菌生物膜体外模型
（扫描电镜观察）
1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释
2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次
3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌
4、2.5%戊二醛预固定2小时（戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类。但是只使用戊二醛固定的样品无法阻止后面的脱水、渗透和包埋过程对样品脂类的抽提，因而对细胞膜的固定效果不理想。）
5、0.1mol/LPBS漂洗三次，再用1%锇酸固定2小时（经锇酸固定后，又能防止用酒精脱水时所产生的沉淀作用。也是唯一能固定脂类分子的最好的化学固定剂）
6、40-100%系列浓度酒精脱水（1、酒精可以置换组织内的水，最终脱水用的是无水乙醇。高浓度的酒精（95%以上）对细菌有强烈的收缩和脆化的缺点，因此洗后不能立即投入高浓度酒精中。脱水时为了避免细菌萎缩、僵硬，应在不同浓度的酒精里逐渐脱水。2、如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，这时细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能很好的深入细菌内部）
7醋酸乙戊酯置换（醋酸乙戊酯的极性较弱,临界点干燥时可以更好的与co2置换,从而更加完整的保持生物样品的表面形态.）
8将盖玻片装入样品盒中置HCP-2临界点干燥仪中干燥2小时（扫描电镜在观察样品要求在高真空中进行。无论是水还是脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈的汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构，因此，样品在用电镜观察前必须要干燥。
）
9喷金三分钟，电镜扫描（生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。）
二、激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌生物膜
1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释
2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次
3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌
4、SYTO9/PI荧光探针标记生物膜：将上述盖玻片加入等体积混合配置好的染料，室温避光孵育15min，PBS三次冲洗未结合染料。
5、用激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌生物膜：活菌具有完整细胞壁而死菌不具备。SYTO9可以穿越任何细胞壁与DNA结合，PI不能穿越完整细胞壁，但透过不完整细胞壁后对DNA有更大的亲和力，故在死菌中PI可取代SYTO9与DNA 结合。在488nm激光的激发SYTO9呈亮绿色，代表活菌；PI 呈红色，代表死菌。
三、银染法
1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释
2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入医用硅胶膜，37°培养，每24小时换培养液一次
3、灭菌生理盐水多次漂洗，去掉浮游菌
4、25%戊二醛PBS溶液固定1小时
5、蒸馏水清洗一分钟
6、饱和氯化钙溶液结合15分钟
7、蒸馏水清洗15分钟
8、5%硝酸银溶液反应15分钟
9、1%对苯二酚反应2分钟
10、蒸馏水漂洗1分钟
11、5%硫代硫酸钠溶液固定2分钟
12蒸馏水漂洗1分钟
13普通光学显微镜即可观察，黑染部分为生物被膜，空白处为生物被膜“孔道”，空白硅胶片银染后呈散落的黑点或黑斑。（1硝酸银溶液需要过滤2漂洗应该轻重过度）
