第四章 酶的分子修饰与模拟

种催化构象、催化活性的修饰蛋白。
例子：血清白蛋白pH3下微扰松散加入诱导修
饰物（如吲哚），并调pH至中性使其重新折叠成特 定构象双功能或多功能试剂（如戊二醛）冻结， 稳定新结构酯酶活性产物。
本章内容提要
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酶的化学修饰 酶的物理修饰与诱导构象重建 酶的蛋白质工程技术修饰 酶的人工模拟
修饰条件控制：修饰剂的种类与浓度、温度、pH
和反应时间等。
大分子结合修饰
大分子结合修饰的过程：
修饰剂的选择：根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择
适宜的水溶性大分子。
修饰剂的活化：大分子修饰剂在使用之前一般需要经过 活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。
修饰：将带有活化基团的大分子修饰剂与酶液混合，控 制一定条件，使修饰剂活化基团与酶分子的侧链基团以 共价键结合，对酶分子进行修饰。
缺点：成本及人工付出太高。
限制性内切核酸酶酶切片段取代法
先将原基因中需修饰的片段用限制酶切出，同时用化学法合 成相对应的修饰片段，再通过连接酶将修饰片段装入原基因 中。
关键：在待修饰的部位能够找到适当的限制酶切序列。
4.3.1 主要方法
寡核苷酸引物指导的定点突变
原理：利用噬菌体M13的单链化与双链化互变。
优点：很好的普适性，可改变、添加或删除原基因中 的核苷酸或核苷酸片段。
4.3.1 主要方法
盒式突变法
该法是在上述方法基础
上发展起来的。
特点：能在同一位点上 同时作出多种突变选择。
4.3.2 进展与应用
随着蛋白质化学的发展，现在认识到，整个蛋白 质分子可划分出一个个结构（功能）域；同样， 蛋白质工程修饰也可扩展到结构域的水平。
金属离子置换修饰
置换后结果
酶活性降低或完全失活
酶活性提高或稳定性增加
• 锌型蛋白酶置换成钙型蛋白酶，活力提高20~30%；
制成结晶，活力提高2~ 3倍；
• -淀粉酶由杂离子型置换为钙离子型，结晶后活 力提高3倍以上，并且稳定性大大增加。
4.1 酶的化学修饰
金属离子置换修饰
大分子结合修饰
酶蛋白侧连基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰
大分子结合修饰
使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶
的特性与功能的方法。
定义：利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，
常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖
聚合物、聚氨基酸等。（使用前一般需经过活化， 然后在一定条件下与酶分子共价结合。）
端pH值等），使酶分子的空间构象发生某些改变， 从而改变酶的某些特性和功能的方法。
特点：不改变酶的组分和基团，酶分子中共价键不
发生改变，副键发生某些变化和重排。
例子：羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，
水解能力降低；高压处理纤维素酶后，最适温度有所
降低，但活力提高。
4.2 酶的物理修饰与诱导构象重建
酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应实际生
产工艺要求。
本章内容提要
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酶的化学修饰 酶的物理修饰与诱导构象重建 酶的蛋白质工程技术修饰 酶的人工模拟
4.1 酶的化学修饰
化学修饰是在酶分子一级结构水平上的改造
化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。只要选择合适 的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，能够在 较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良 特性，甚至创造出新的活性。
成其他物质。
氨基的化学修饰反应
主要修饰剂：二硝基氟苯、醋酸酐、二硫化碳、 O-甲基异脲等。 作用：产生脱氨基或共价结合将其屏蔽。
巯基的化学修饰反应
主要修饰剂：二硫苏糖醇、巯基乙醇等还原剂及酰 化、烷化剂。 作用：与巯基反应，破坏二硫键。
咪唑基的化学修饰反应
主要修饰剂：碘乙酸、焦碳酸二乙酯等。 作用：使咪唑基发生烷基化、卤代反应。
• 机制：酶分子经肽链有限水解后，可使其分子量减小，在保 持其酶活力的前提下，显著降低其抗原性甚至完全消除。
• 实例：用亮氨酸氨肽酶水解木瓜蛋白酶、酵母的烯醇化酶， 经有限水解后，抗原性均显著降低。
例：胃蛋白酶原的激活
HCl 胃蛋白酶原 pH ~2
（从N端失去44个氨基酸残基） 胃蛋白酶
自身激活
例：胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各 种化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶 分子上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团） 产生化学反应，对酶分子结构进行改造。
4.1 酶的化学修饰
金属离子置换修饰
大分子结合修饰
酶蛋白侧连基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰
第四章
酶的分子修饰与模拟
为什么要对酶分子进行修饰？
酶的分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生
改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称
为酶分子修饰。 天然酶在应用中的限制因素：
容易变性失效：一般经不起高温、强酸、强碱、有机溶 剂及时间引起免疫反应和被识 别降解；

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酶的化学修饰 酶的物理修饰与诱导构象重建 酶的蛋白质工程技术修饰 酶的人工模拟
4.4
模拟酶：
酶的人工模拟
根据酶的作用原理，模拟酶的活性中心和催
起副键的改变，使酶分子空间结构发生某些改变，从而引
起酶的特性和功能的改变。
被修饰的侧链基团：主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、
酚基等
经常被修饰的残基是：


亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His
亲电的Tyr、Trp
羧基的化学修饰反应
主要修饰剂：乙醇-盐酸、碳化二亚
胺等。
作用：使羧基酯化、酰基化或结合生
其他物质。
酶蛋白侧连基团修饰
酶蛋白侧链基团修饰后效果
提高稳定性 •O-甲基异脲修饰溶菌酶。 •亚硝酸修饰天门冬酰胺酶。 提高酶活性 •枯草杆菌蛋白酶经酚基修饰剂修饰后，对带正电底物 的结合力增加。 改变特性与功能 •葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰后，其最适pH下降0.5个 单位，且稳定性增加。 •大肠杆菌的苹果酸酶经巯基修饰剂修饰后，由原先催 化四种生化反应，变为只催化其中两种，活性却提高 10倍以上。
性状。例如：
RNase复性时加入丙酸（竞争性抑制剂），修饰后酶具有酸性磷酸
酯酶活性；
胰蛋白酶复性时，50℃比20 ℃下和天然酶稳定性高5倍。
前沿：Keyes实验室的“BIO-SYN-CATTM ”技
术，包括三个基本环节：微扰；诱导和修饰； 交联。
能使某些原来不具有酶活性的蛋白质转化为具有某
4.1 酶的化学修饰
金属离子置换修饰
大分子结合修饰
酶蛋白侧连基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰
肽链有限水解修饰
定义：利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结
构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能 的方法。
方法：
修饰剂：常用专一性较强的蛋白酶或肽酶。
酚羟基的化学修饰反应
主要修饰剂：四硝基甲烷等。 作用：使酚基碘化、硝化或琥珀酰化。
胍基的化学修饰反应
主要修饰剂：二羰基化合物：环己二酮、乙二醛、苯 乙二醛等。 作用：与胍基缩合生成稳定的杂环。
色氨酸吲哚基的化学修饰反应
主要修饰剂：N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、 4-硝基苯硫氯等。 作用：使吲哚基发生开环或取代反应生成
应用：
阐明蛋白质结构和功能的关系 蛋白质的定向改造
4.3.2 进展与应用
应用实例

嗜热脂肪芽孢杆菌酪氨酸-tRNA合成酶51位Thr替换
成Pro后，对底物亲和力显著升高，反应速率常数
上升25倍。

T4溶菌酶的3-Ile替换成3-Cys，再经氧化，与97Cys形成二硫键后，其热稳定性大大提高； -内酰胺酶的70-Ser换成70-Cys后，对胰蛋白酶水 解的抵抗力可升高3倍。
4.1 酶的化学修饰
金属离子置换修饰
大分子结合修饰
酶蛋白侧连基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰
定义：将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会
引起酶蛋白化学结构和空间构象的改变，从而改变酶的某 些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。
通过氨基酸置换修饰，可以提高酶活力、增加酶的稳定性
底物结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得
以提高。 实例：
右旋糖酐:核糖核酸酶＝6.5 : 1，活力提高至原酶的2.25倍; 右旋糖酐:胰凝乳蛋白酶＝11:1，活力提高至原酶的5.1倍;
右旋糖酐:胰凝乳蛋白酶＝11: 1，活力提高30%。
b）增加酶的稳定性
机制：酶可与大分子修饰剂形成复合物，起保护酶的天然构
4.3 酶的蛋白质工程技术修饰
蛋白质工程，又称为第二代基因工程，它
是以重组DNA技术为基础，结合X-衍射分
析技术、蛋白质溶液构象理论及计算机辅
助设计（CAPD）发展起来的一种定点定
位修饰技术体系，也是在基因水平上进行
蛋白质改造的一种技术科学。
4.3.1 主要方法
化学全合成法
根据原基因序列进行全化学合成，仅在定位修饰的部位作出 相应的改变。 优点：可在多点同时进行定点（位）突变；
相对稳定性 1 70 140 240 350
c）降低或消除抗原性
机制：抗体与抗原间的特异结合是由于它们间的特定
分子结构所引起的，酶经水溶性大分子修饰可使酶的结 构产生某些改变，从而降低甚至消除其抗原性。
实例：
精氨酸酶经PEG修饰后，抗原性显著降低 用PEG对色氨酸酶进行修饰，可完全消除其抗原性 PEG修饰后的L-天门冬酰胺酶，也可完全消除其抗原性