犬腺病毒Ⅱ型感染诊断

如何防治狗狗的腺病毒Ⅱ型感染
(1)流行特点
狗腺病毒Ⅱ型感染潜伏期为5~6天，最常与副流行性感冒病毒一同感染。

然而，其他环境因素如寒流、湿度过高及天气变化等，都是本病引发因素。

此外，剧烈的运动或兴奋也会使病情恶化。

(2)临床诊断
主要根据临床症状进行诊断。

狗的腺病毒Ⅱ型感染临床上表现为持续性发热(体温在39.5℃左右)。

鼻部流浆液性鼻漏，可随呼吸向外喷水样鼻液。

6~7天后出现阵发性干咳，以后为湿性咳嗽，呼吸急促，气管听诊有a音，口腔检查可见扁桃体肿大，咽部红肿。

病情继续发展可导致坏死性肺炎。

病狗表现精神沉郁、不吃东西、呕吐，该病往往易和犬瘟热及其他呼吸道疾病混合并发。

混合感染的狗在治疗上困难很大，死亡率很高。

病情一般持续10~20天。

(3)防治措施
1)接种疫苗可用狗腺病毒Ⅱ型疫苗接种，以2~4周间隔连续接种2次，以后每年接种1次。

2)药物防治作用于中枢的镇吹药对本病最有效，如硫酸可待因，1~2毫克/千克体重口服，4~8小时1次。

重酒石酸二氢可待因酮、右旋甲氧甲基吗喃、硫酸吗啡也有效。

当干咳变为排痰的咳嗽时，要用祛痰剂，但必须停用镇咳药，否则下呼吸道会积聚渗出液。

蒸气疗法可使症状改善。

临床上，认为病狗存在有支气管败血性博代氏杆菌感染时，常用氦霉素、庆大霉素、卡那霉素和四环素，连续用14天。

有轻咳而无全身征候的病狗，应进行良好的护理。

如保暖、通风，避免牵病狗散步、运动等。

以免引起阵咳。

犬腺病毒2型的分离鉴定和致病性分析刘彩红;崔宁宁;陈亚磊;廖均乐;朱进华;刘玉秀;田克恭【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2024(60)3【摘要】为了解湖北省犬腺病毒2型(CAV-2)的基因遗传变异特征,本试验从武汉市某比格犬养殖场采集免疫过犬四联活疫苗的临床发病犬的眼、鼻和肛拭子,将经PCR检测为CAV-2阳性的病料接种犬肾细胞(MDCK细胞)进行病毒分离,对CAV-2分离株进行电子显微镜观察和间接免疫荧光鉴定,E3、Fiber、Penton和E1b基因PCR扩增和测序分析以及致病性试验。

结果显示:经分离和鉴定共获得3株CAV-2,分别命名为HB404株、HB405株和HB078株。

3株CAV-2分离株的E3、Fiber、Penton和E1b基因与国外疫苗毒株相似性分别为98.4%~99.6%、99.3%~99.9%、99.8%~99.9%和99.5%~99.7%;3株分离株的E3、Fiber和Penton基因与国内流行毒株相似性分别为96.6%~97.5%、98.5%~99.7%和99.4%~99.9%。

且3株CAV-2分离株与国外疫苗毒株在同一分支,与国内流行毒株不在同一分支。

HB405株能使犬出现精神不振、食欲减退、眼鼻有分泌物、打喷嚏和咳嗽等临床症状。

结果表明,3株分离株的亲缘关系与国外疫苗毒株较近,HB405株为强毒株,能够使犬发病。

本试验结果可为CAV-2的诊断和预防提供参考依据。

【总页数】9页(P9-17)【作者】刘彩红;崔宁宁;陈亚磊;廖均乐;朱进华;刘玉秀;田克恭【作者单位】国家兽用药品工程技术研究中心;河南农业大学动物医学院;河南省动物检疫总站【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.2株鸡源血清4型禽腺病毒的分离鉴定及致病性研究2.血清4型禽腺病毒强毒株GY株的分离鉴定和致病性研究3.Ⅰ群禽腺病毒血清11型的分离鉴定及致病性试验4.一株鸭腺病毒3型的分离、鉴定及致病性分析5.犬腺病毒2型E3基因自然缺失毒株的分离鉴定及其致病性因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

实验动物犬腺病毒检测方法1 范围本标准规定了实验动物犬腺病毒的术语和定义、原理、样品处理和PCR检测。

本标准适用于犬腺病毒的PCR检测。

2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 14926.58 实验动物传染性犬肝炎病毒检测方法GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 683 犬传染性肝炎诊断技术SN/T 4749 犬传染性肝炎检疫技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

3.1犬腺病毒I型（CAV-1）属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，呈二十面体立体对称，直径为70 nm～90 nm，为无囊膜双股DNA病毒，犬腺病毒I型（CAV-1）主要引起犬和其它犬科动物的犬传染性肝炎。

3.2犬腺病毒II型（CAV-2）属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，呈二十面体立体对称，直径为70 nm～90 nm，为无囊膜双股DNA病毒，主要引起幼犬呼吸道疾病和肠炎，致病性较弱。

4 原理CAV-1和CAV-2具有相同的免疫原性，实践中多采用CAV-2作为疫苗免疫保护CAV-1感染。

CAV-1的早期转录E3区比CAV-2缺失500 bp，可用于鉴别检测。

5 样品处理5.1 采样前准备5.1.1 有关动物采集的实验室风险按照GB 19489的规定执行。

5.1.2 按照NY/T 541的规定准备采样工具和器械。

5.2 拭子5.2.1 按照NY/T 541的规定采集咽拭子。

5.2.2 按照NY/T 541的规定采集肛拭子5.2.3 按照NY/T 541的规定采集鼻拭子。

5.3 血清5.3.1 按照NY/T 541的要求，在犬的前肢隐静脉或颈静脉采血。

5.3.2 按照NY/T 541的规定进行采血。

5.3.3 按照NY/T 541的规定制备并储存血清。

犬Ⅱ型腺病毒的分离鉴定
范泉水;夏咸柱
【期刊名称】《中国兽医科技》
【年(卷),期】1999(029)011
【摘要】在做犬腺病毒分子流行病学调查的过程中，从送检的犬粪便中分离出多
株犬腺病毒，并对其中１株进行了系统鉴定。

经形态学、理化学、血清学交叉中和试验、动物感染试验与分子生物学鉴定，证明为１株犬传染性喉气管炎病毒的强毒，即犬Ⅱ型腺病毒。

【总页数】2页(P28-29)
【作者】范泉水;夏咸柱
【作者单位】成都军区联勤部军事医学研究所;解放军农牧大学军事兽医研究所【正文语种】中文
【中图分类】S858.292.5
【相关文献】
1.犬戊型肝炎病毒及腺病毒Ⅰ型混合感染引起犬肝炎及癌前病变的诊断 [J], 刘洋;马国文;武克炳;林宇飞
2.犬Ⅰ型腺病毒TN株的分离鉴定 [J], 乔军;孟庆龄;夏咸柱;何宏彬;范泉水
3.犬2型腺病毒对犬的口服免疫研究 [J], 范泉水;夏咸柱
4.犬腺病毒Ⅰ型和Ⅱ型TaqMan双重荧光定量PCR方法的建立 [J], 巨敏莹; 王艳杰; 刘东霞; 张斌; 韩宇; 乌吉斯古楞; 宋庆庆; 关平原
5.犬腺病毒1型感染普通级比格犬中Ⅰ和Ⅲ型干扰素及其受体分子表达量的比较[J], 孟兴;问婉欣;佟相慧;陈洪岩;韩凌霞
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2023-11-07•犬腺病毒ⅱ型感染概述•犬腺病毒ⅱ型感染的预防和控制•犬腺病毒ⅱ型感染的临床表现和治疗方案•犬腺病毒ⅱ型感染的流行趋势和未来展望目录01犬腺病毒ⅱ型感染概述犬腺病毒Ⅱ型（Canine Adenovirus Type 2，简称 CAV-2）是一种常见的犬病毒，可引起犬只的传染性气管炎、肺炎等呼吸道疾病。

定义CAV-2感染的典型症状包括发热、咳嗽、呼吸困难、食欲不振、精神沉郁等，其中咳嗽是该病毒感染的典型表现。

症状定义和症状传染源患病犬和隐性感染犬是该病毒的主要传染源。

传播途径该病毒主要通过呼吸道飞沫传播，患病犬在咳嗽时会排出大量病毒，健康犬通过吸入这些病毒而感染。

此外，直接接触患病犬的分泌物和排泄物也可能导致病毒传播。

传染源和传播途径诊断对于CAV-2感染的诊断，临床医生通常会结合患病犬的症状、病史和实验室检测结果进行综合判断。

实验室检测方法包括病毒分离、PCR检测和血清学检测等。

鉴别诊断CAV-2感染需要与其他犬呼吸道疾病进行鉴别诊断，如犬瘟热、副流感等。

鉴别诊断需要考虑患病犬的症状、病史和实验室检测结果等因素。

诊断和鉴别诊断02犬腺病毒ⅱ型感染的预防和控制预防措施定期清洁和消毒犬舍、犬只用品和周围环境，减少病毒的传播。

避免与患病犬只接触，防止病毒传播。

定期接种犬腺病毒ⅱ型疫苗，提高犬只免疫力。

及时发现并隔离可疑病例，防止病毒在犬群中扩散。

隔离和治疗将患病犬只隔离在清洁、安静的环境中，避免与其他犬只接触。

使用抗病毒药物和抗生素等进行治疗，缓解症状和预防继发感染。

提供适当的护理和支持，如给予营养丰富的食物和充足的水分。

对病死犬只进行无害化处理，防止病毒传播。

公共卫生措施加强宣传和教育，提高公众对犬腺病毒ⅱ型感染的认识和预防意识。

鼓励宠物主人定期带犬只进行检查和接种疫苗，预防疾病发生。

发现病例及时报告和配合相关部门开展调查和控制措施，防止病毒传播和疫情扩散。

03犬腺病毒ⅱ型感染的临床表现和治疗方案临床表现咳嗽和呼吸困难犬腺病毒ⅱ型感染会导致狗狗咳嗽和呼吸困难，特别是在夜间或运动后。

犬瘟热病毒和犬腺病毒2型双重PCR方法的建立及应用耿庆华;林颖;裴程程;胡殊;林书铭【摘要】根据犬瘟热病毒（canine distempervirus，CDV）和犬腺病毒2型（Canineadenovirus type2，CAV-2）GeneBank登陆的基因序列各设计一对引物，经试验条件优化，建立了检测CAV-2的PCR方法和CDV的RT-PCR方法，CAV-2可扩增1108bp片段、CDV可扩增560bp的目的片段，特异性试验表明建立的方法只能特异扩增CAV-2和CDV，不能扩增犬细小病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体和犬黄胆出血群、狂犬病病毒。

敏感性试验表明，所建立的双重PCR方法可以扩增4．63ng总核酸量。

在上述试验基础上继续优化条件建立了能同时检测CAV-2和CDV两种病毒的双重PCR检测方法，并用该方法检测来自辽宁、吉林等15家动物医院134份鼻液和眼眵样品，与商品化试纸条检测结果相比，本方法更加敏感和方便。

研究结果表明，本实验建立的方法敏感、特异，适用于动物犬瘟热病毒和犬腺病毒2型的快速检测和鉴别诊断。

%A pair of PCR primers were designed according to sequence of CAV-2 and CDV respectively, which could amplify 1 108 bp fragment for CDV and 560 bp fragment for CAV-2. The products of PCR were proved to be specific.The sensitivity of PCR for CAV-2 and CDV showed that the method could amplify 4.63ng nucleic acid.The result of rudimentary application showed that the method was specific, sensitive, efficient, rapid and provided a new detecting method for the mixed infection with CAV-2 and CDV.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2012(029)005【总页数】4页(P38-41)【关键词】犬瘟热病毒;犬腺病毒2型;双重PCR;鉴别诊断【作者】耿庆华;林颖;裴程程;胡殊;林书铭【作者单位】沈阳出入境检验检疫局,辽宁沈阳110016;沈阳出入境检验检疫局,辽宁沈阳110016;沈阳出入境检验检疫局,辽宁沈阳110016;沈阳出入境检验检疫局,辽宁沈阳110016;沈阳出入境检验检疫局,辽宁沈阳110016【正文语种】中文【中图分类】S851.33犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，经济损失严重。

犬咳嗽的鉴别诊断与防治姓名：虞思聪学号：122203221班级：动医1202近年来，随着人们物质生活、文化生活水平的提高，城市居民养犬者越来越多，犬病也不断发生。

但是，由于现阶段我国犬病诊疗技术水平较为落后，导致常见和多发疾病的诊疗错误增加，不但造成了疾病的进一步恶化，而且带来了不必要的医疗纠纷。

所以，鉴别诊断犬常见疾病有着重要的意义。

本文就犬常见症状之一的咳嗽做一阐述。

咳嗽是一种保护性的反射动作，是多种疾病引起的一种症状，不是独立的病名。

咳嗽可将呼吸道异物或病理性分泌物排出体外。

起排除异物，清洁呼吸道的作用，同时咳嗽也会对机体造成威海。

如：可使呼吸道内感染扩散，使胸内压升高，甚至发生气胸、肺气肿、肺出血等。

犬咳嗽病是临床上较常出现的症状之一，冬春及气候多变季节常发并不为年龄品种所限制。

1 犬咳嗽的分类1.1 传染性疾病引起的咳嗽包括犬温热、疱疹病毒、结核杆菌、副流感病毒、犬腺病毒Ⅱ型感染等。

1.2 上、下呼吸道引起的咳嗽包括鼻窦炎、咽炎、上呼吸道堵塞、气管塌陷、支气管炎症、肺免疫性疾病和呼吸器官肿瘤等。

1.3 心血管疾病引起的咳嗽常见于心脏衰竭、肺血栓、血管疾病引起的肺水肿等。

1.4 其它原因引起的咳嗽首先是过敏引起的咳嗽，常见的如支气管哮喘、嗜酸细胞性肺炎和花粉过敏等；其次是外伤及生理性因素引起的咳嗽，如异物、刺激性气体、外伤、气管形成不全等；最后是寄生虫和物理因素引起的咳嗽，如肺吸虫、心丝虫等引起的寄生虫性咳嗽，项圈太紧、食道梗塞、灌药不当等引起的咳嗽即是物理因素引起的咳嗽。

2 犬咳嗽的主要疾病症状鉴别主要是了解咳嗽发作的时间、发展变化及其类型；是否呼吸困难，或流鼻涕，喘气；休息情况，特别是晚间情况；训练及兴奋的影响；采食的关系；是否有痰液和痰液的性状，根据此类可以初步分析咳嗽的某些原因。

机械性阻塞引起的咳嗽：通常在运动和兴奋时发作，而在休息时较为安静，可能会听到阻塞的噪音和咕噜音：如软腭，喉或气管塌陷或阻塞时咳嗽通常特别洪亮，呈发作性。

畜牧兽医学报 2023,54(7):2982-2990A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.029开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):犬腺病毒2型E 3基因自然缺失毒株的分离鉴定及其致病性王佳丽,周 宁,陈 曦,岳 华,汤 承*(西南民族大学畜牧兽医学院,成都610041)摘 要:犬腺病毒2型(c a n i n e a d e n o v i r u s t y pe 2,C A V -2)是重要的犬呼吸道病原,本试验旨在调查C A V -2在川渝部分地区的流行情况及其分离毒株致病性㊂采用检测C A V -2的特异性P C R 方法,对2021 2022年采集自川渝部分地区的121份患呼吸道疾病的犬鼻咽拭子进行检测,分离流行毒株并研究其基因组特征及致病性㊂结果显示:C A V -2的阳性率为29.8%,值得注意的是,69.4%的阳性样本在E 3基因存在9个核苷酸连续缺失(1035 1043n t ),导致4个氨基酸缺失(345 348a a )㊂成功分离出1株E 3基因自然缺失毒株,噬斑纯化后的细胞半数感染值为10-9.46T C I D 50㊃0.1m L -1;该毒株经口鼻感染幼犬后,幼犬出现体温升高㊁打喷嚏㊁流鼻涕及咳嗽等典型呼吸道症状㊂该分离毒株基因组全长31786b p,与G e n B a n k 中C A V -2基因组的核苷酸相似性为98.8%~98.9%㊂与已知的C A V -2基因组相比,本研究分离毒株除了E 3基因的独特突变外,还在F i b e r ㊁H e x o n 和E 1A 等蛋白有独特的氨基酸突变,使得该毒株在基因组进化树上区别于已知的C A V -2毒株㊂本试验首次获得了中国C A V -2毒株的基因组序列,发现了E 3基因的自然缺失现象,有助于了解C A V -2的流行及遗传进化㊂关键词:犬腺病毒2型;E 3基因自然缺失株;分离鉴定;基因组;致病性中图分类号:S 852.659.1 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-2982-09收稿日期:2022-12-14基金项目:西南民族大学新发动物疫病防控创新团队(2020N T D 02)作者简介:王佳丽(1996-),女,四川南充人,硕士生,主要从事小动物疾病研究,E -m a i l :w a n g ji a l i 1113@163.c o m *通信作者:汤 承,主要从事预防兽医学研究,E -m a i l :t a n g c h e n g101@163.c o m I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o n a n d P a t h o g e n i c i t y o f C a n i n e A d e n o v i r u s T y pe 2S t r a i n w i t h N a t u r a l D e l e t i o n i n E 3G e n eWA N G J i a l i ,Z HO U N i n g ,C H E N X i ,Y U E H u a ,T A N G C h e n g*(C o l l e g e o f A n i m a l H u s b a n d r y a n d V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,S o u t h w e s t M i n z u U n i v e r s i t y ,C h e n gd u 610041,C h i n a )A b s t r a c t :C a n i ne a d e n o v i r u s t y p e 2(C A V -2)i s a n i m p o r t a n t r e s p i r a t o r y p a t h o ge n i n C a n i n e .T h e a i m of t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t ig a t e th e p r e v a l e n c e a n d p a t h o g e ni c i t y of C A V -2i n p a r t s o f S i c h u a n P r o v i n c e a n d C h o ng q i n g M u n i c i p a l i t y .Th e n a s a l s w a b s o f 121c a ni n e s w i t h r e s p i r a t o r y t r a c t d i s -e a s e s w e r e c o l l e c t e d f r o m 2021t o 2022f o r d e t e c t i n g C A V -2b y s p e c i f i c P C R p r i m e r s ,a n d t h e e pi -d e m i c s t r a i n w a s i s o l a t e d f o r f u r t h e r s t u d y ,i n c l u d i n g i t s g e n o m e c h a r a c t e r i s t i c s a n d p a t h o ge n i c i -t y .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e p o s i t i v e r a t e of C A V -2i n c a n i n e w a s 29.8%.N o t a b l y,69.4%o f t h e p o s i t i v e s a m pl e s h a d i d e n t i c a l 9c o n s e c u t i v e n u c l e o t i d e d e l e t i o n s (1035-1043n t )i n t h e E 3g e n e s ,w h i c h r e s u l t i n gi n 4a m i n o a c i d d e l e t i o n s i n t h e E 3g e n e s (345-348a a ).O n e s t r a i n w i t h n a t u r a l E 3d e l e t i o n w a s s u c c e s s f u l l y is o l a t e d ,a n d t h e h a l f i n f e c t i o n v a l u e o f M D C K c e l l s w a s 10-9.46T C I D 50㊃0.1m L -1a f t e r p l a q u e p u r i f i c a t i o n .T h e p u p p i e s i n o c u l a t e d w i t h t h e i s o l a t i o n7期王佳丽等:犬腺病毒2型E3基因自然缺失毒株的分离鉴定及其致病性s h o w e d t y p i c a l r e s p i r a t o r y s y m p t o m s,s u c h a s s n e e z i n g,r u n n y n o s i n g a n d c o u g h i n g.T h e g e-n o m e o f t h e i s o l a t e w a s31786b p,a n d s h a r e d t h e h o m o l o g y o f98.8%-98.9%i n n t w i t h t h e C A V-2g e n o m e s i n G e n B a n k.C o m p a r e d w i t h t h e k n o w n C A V-2g e n o m e s,b e s i d e s t h e u n i q u e m u t a t i o n s o f t h e E3g e n e,t h e i s o l a t e i n t h i s s t u d y a l s o h a d u n i q u e a m i n o a c i d m u t a t i o n s i n F i b e r, H e x o n,a n d E1A,w h i c h m a d e t h i s s t r a i n d i s t i n g u i s h f r o m t h e k n o w n C A V-2s t r a i n i n t h e g e-n o m i c e v o l u t i o n a r y t r e e.T h i s s t u d y o b t a i n e d t h e g e n o m e s e q u e n c e o f t h e C h i n e s e C A V-2s t r a i n f o r t h e f i r s t t i m e,a n d f o u n d t h e s t r a i n w i t h n a t u r a l d e l e t i o n i n E3g e n e s,w h i c h i s h e l p f u l t o u n-d e r s t a n d t h e p r e v a l e n c e a n d g e n e t i c e v o l u t i o n o f C A V-2.K e y w o r d s:c a n i n e a d e n o v i r u s t y p e2;E3g e n e n a t u r a l d e l e t i o n s t r a i n;i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n;g e n o m e;p a t h o g e n i c i t y*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:T A N G C h e n g,E-m a i l:t a n g c h e n g101@163.c o m犬腺病毒(c a n i n e a d e n o v i r s,C A V)属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属,是一种无囊膜㊁线状的双链D N A病毒,具有两种血清型:I型(C A V-1)㊁I I型(C A V-2)[1]㊂C A V-1主要引起犬传染性肝炎㊁狐狸脑炎;而C A V-2主要引起犬传染性气管支气管炎,临床表现为高热㊁流涕㊁咳嗽等[2],还可能与致死性腹泻病相关[3]㊂除了感染犬以外,C A V-2还有感染浣熊[4]㊁棕熊[5]㊁红狐[6]以及狼[7]等野生动物的报道㊂1962年,D i t h f i e l d等[8]从呼吸道病犬首次分离出C A V-2毒株;1988年,M a c a r t n e y等[3]从犬腹泻样本中分离出C A V-2,证实了可在犬的消化道中增殖;2009年,张洋等[9]首次从犬子宫上皮组织中分离出C A V-2,表明了该病毒有多种组织嗜性㊂据报道,C A V-2与犬呼吸道冠状病毒㊁犬副流感病毒㊁犬瘟热病毒等病毒存在混合感染[10]㊂当前,G e n B a n k中仅有3条C A V-2全基因组,分别来源于美国㊁加拿大㊁日本,基因组全长约31000b p㊂该病毒衣壳蛋白主要由F i b e r㊁H e x o n 和P e n t o n组成,F i b e r由凸起㊁轴㊁尾三部分构成,可介导病毒与宿主细胞受体间融合,在感染过程中起到关键作用[11];H e x o n含量最多,是决定腺病毒抗原性的主要蛋白;P e n t o n主要发挥内化作用[12],并对病毒存活功能稳定性有着重要作用㊂E3基因属于早期转录基因,主要编码免疫调节蛋白[13],具有免疫抑制的作用[14]㊂此外,E3基因是C A V-2分子检测的靶基因[15]㊂目前国内关于C A V-2的病原流行病学资料不多㊂薛林杰[16]对河南省2018 2020年采集的1410份犬粪便样本进行C A V-2检测,结果显示阳性率为2.48%;张发明等[17]对成都地区2016 2017年出现呼吸道症状的78份犬鼻拭子以及消化道症状的213份犬肛门拭子进行C A V-2检测,结果显示鼻拭子检出率为17.95%,粪便样本检出率为15.96%;冀君(J i)等[18]对河南㊁湖北㊁江苏三省2017 2019年的224份犬腹泻样本进行C A V-2检测,阳性率为8.5%㊂上述资料显示不同地方C A V-2在犬中的流行率差异较大,但未见关于国内C A V-2基因组研究的报道,其分子特征和遗传演化仍待调查㊂本研究的目的是对川渝部分地区C A V-2的流行情况进行调查,并对流行毒株的基因组及生物学特性进行探究㊂1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂M D C K细胞由本实验室保存;D M E M培养基㊁D N A提取试剂盒购自A i d l a b B i o t e c h北京有限公司;P C R P r e m i s T a q酶购自南京诺唯赞有限公司;胎牛血清购自武汉普诺赛生物;A l e x a F l u o r488山羊抗兔I g G㊁D A P I封片液购自A b b k i n e公司;大肠杆菌感受态细胞㊁p M D19-T克隆载体购自宝生物工程(大连)有限公司;兔抗C A V-2高免血清由本实验室保存㊂1.1.2样本来源2021 2022年,从重庆㊁成都㊁西昌7个宠物医院,共采集121份患呼吸道疾病的犬鼻咽拭子,其中重庆30份㊁成都43份㊁西昌48份㊂1.2D N A的提取将样本拭子放入2m L离心管中,加入适量含有1%双抗的P B S溶液,振荡涡旋混匀以后置于4ħ,7000r㊃m i n-1离心10m i n后吸取200μL上清液,采用D N A提取试剂盒提取病毒D N A㊂3892畜牧兽医学报54卷1.3检测C A V-2的P C R方法选取C A V-2参考毒株U77082的E3基因作为靶基因,使用P r i m e r5设计一对C A V-2特异性检测引物,F:5'-C C T C A A C G A G A T G C C T C T T C C C A-3';R:5'-C A T G G G C C T G A T T T T G T T G T T T-3',目的片段736b p㊂P C R扩增体系配比:2ˑP C R P r e m i x T a q12.5μL,d d H2O8.5μL,上㊁下游引物各1μL,模板D N A2μL;反应程序:94ħ预变性5m i n;94ħ变性30s,52ħ退火30s,72ħ延伸70s,35个循环;72ħ终末延伸7m i n㊂反应结束后,取P C R产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳(120V, 25m i n)进行鉴定㊂所有阳性样本的P C R产物纯化后连接到p M D19-T载体上,再转化到大肠杆菌感受态细胞中,阳性质粒送往北京擎科生物有限公司测序及分析㊂1.4病毒的分离选取3份C A V-2阳性样本,将其上清用0.45μm的滤器过滤处理后,吸取200μL上清液接种于长成单层M D C K细胞的六孔板上;同时设置阴性对照,接种等量的D M E M培养基;分离的病毒液经噬斑纯化3次后,进行病毒的鉴定及T C I D50的测定㊂1.5病毒的鉴定1.5.1 P C R鉴定吸取200μL纯化后的病毒液提取D N A,采用 1.3 中的方法进行C A V-2检测㊂1.5.2间接免疫荧光试验病毒液接毒48h 后,弃去培养液,使用P B S清洗三次后,加入冰丙酮放入4ħ冰箱固定10m i n,弃去丙酮使用P B S清洗后,加入5%的B S A溶液放入37ħ培养箱封闭30m i n,弃去B S A溶液后,将兔抗C A V-2血清作为一抗(1ʒ500稀释),F I T C标记山羊抗兔I g G为二抗(1ʒ3000稀释),进行免疫荧光,同时设置未接毒的细胞进行同步操作,作为阴性对照㊂1.5.3 电镜观察收集纯化后的病毒液, 10000r㊃m i n-1离心5m i n,取上清送往成都里来生物有限公司进行透射电镜制样㊁观察,观察病毒形态及拍照㊂1.6E3基因自然缺失分离株对幼犬致病性自某养殖场购买6只1月龄中华田园犬,未接种疫苗㊁已驱虫,经检测犬细小病毒㊁犬冠状病毒㊁犬副流感㊁犬瘟热㊁C A V-2均为阴性,将幼犬平均分为2组,一组经口鼻接种2m L病毒滴度为10-9.46T C I D50㊃0.1m L-1的分离毒株病毒液;另一组接种等量的D M E M培养基;详细记录幼犬每日体温以及临床表现,每日采集鼻咽拭子与肛门拭子,采用荧光P C R方法[19]检测排毒情况㊂1.7分离株基因组扩增与拼接根据G e n B a n k中C A V-2全基因参考序列U77082,使用P r i m e r5设计18对基因组扩增引物,用于扩增分离毒株的全基因,相关引物信息见表1㊂获得的P C R的产物纯化后连接到p M D19-T载体上,转化到大肠杆菌感受态细胞后,挑取单个菌落送往北京擎科生物公司进行测序,最后使用S e q m a n 软件将所有测序结果拼接,获得分离毒株全基因组序列㊂1.8分离毒株的序列分析将本研究获得的C A V-2全基因㊁E3基因㊁F i-b e r基因㊁H e x o n基因㊁P e n t o n基因运用M E G A7软件分别与其对应参考序列的核苷酸及氨基酸进行多重比对,并采用最大似然法建立C A V-2全基因㊁E3基因遗传进化树,进行系统发育分析㊂采用R D P4.39软件对本研究获得的C A V-2全基因组进行重组分析㊂2结果2.1C A V-2的检测结果121份样本中,36份检测为C A V-2,阳性率为29.8%,测序结果进一步证实了检测结果的准确性㊂其中成都地区阳性率为27.8%㊁西昌地区阳性率为35.4%㊁重庆地区阳性率为23.3%,表明C A V-2已在上述地区流行,详见表2㊂值得注意的是,36份C A V-2阳性样本中,有25个毒株的E3基因存在同样的9个核苷酸的连续缺失(1035~1043n t),导致4个氨基酸的缺失(345~348a a)㊂2.2E3基因片段的进化分析选取G e n B a n k中全部45条C A V-2E3基因片段和本研究获得的36条长度为736b p的E3基因片段(G e n B a n k登录号:O P018862~O P018896),采用最大似然法建立进化树,结果显示:本研究所获得的36条E3基因序列共分为两大支,其中11条序列与G e n B a n k中现有C A V-2毒株序列聚为一大支,另25条E3基因部分缺失毒株序列则独立聚为一大支,详见图1㊂2.3病毒的分离与鉴定样本上清液接种于M D C K细胞,盲传3代以后,其中1份出现了细胞病变,连续传递至第5代48927期王佳丽等:犬腺病毒2型E 3基因自然缺失毒株的分离鉴定及其致病性表1 C A V -2全基因扩增引物T a b l e 1 P r i m e r s a r e u s e d t o a m p l i f y wh o l e g e n e o f C A V -2引物P r i m e r 引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e 片段长度/b pS i z eF 1TG G G A C G G T C A G G T T C A G G T R 1C G G A A T C T T G G A G G T C G T T G A1806(67-1872)F 2C C T G A A G C T G A C A G A C T T G A C C R 2C A G A C A G A C A A C G C T G G A C A C 1813(1773-3585)F 3A T G A T C T A A A G C A A C G A A TR 3G A A G A A G A T C C A A C T A A A G A C1998(3493-5490)F 4T G T A A A C A A A A G T C A T C A T C C T C R 4G T G C C A T T T A T G C T A G T T T T C C A 1976(5369-7344)F 5C C T G T T C T T T A C C A T T C C A A R 5A T C C A G C A G G C G G G C A A C A1881(7236-9116)F 6G C A T C A A G C C A C A A A C A A T C A C A AR 6T C T T T G C G G G A A G G C A C C A C 2094(8977-11070)F 7T T C A T C C C A G C C T T T T G C R 7T A C T C T G T C A C A T T A G G C A T 1952(11005-12956)F 8G G T G G G G A A T T T A A G T CR 8T C T G C G T A C A C T T C G T C A T A 1963(12904-14866)F 9C C C G T G G T G T T T A C T C C C GR 9G G C T G G T C A G A G G G C T T T A 1896(14796-16691)F 10C A C C C C T G A T G C C C A T G A C R 10T C C A G G C A G T A G G A G G A G A T T 1913(16595-18507)F 11G G A C T C C G C T A C C G T T C A C A A R 11C A T T A A A T T C C C A G A G T T C C A C 2007(18400-20403)F 12G T G T T C A T C G G A C C A G T G G A R 12A C C G C C T A A A C C C T C A A A C A C 1838(20367-22204)F 13G A G A T T G C T T A C C T G A C T A T G A A A CR 13C T T G T C T G G T G G T T G T C C T C A1887(22140-24026)F 14C A C T A A A G A G C C C A A A G C C A G R 14A G G C C C A G T T G G G A T G C A G G T T C T C 1880(23978-25857)F 15C T A A A G T C A G A A G C G G A G G C A R 15G C T T C A A T A G C A C C A T C T1825(25807-27631)F 16A T G G A A C A A T A G G G G C T G T G G T A R 16G G T T T T G A G T A T G A T G A T G C T C T T G C1855(27526-29380)F 17A C A C T T C T A A C A A A G A T A C A GR 17A C G G T G C T A T G C T T A G T G G T G T1158(29242-30399)F 18G C A A A A T A A C A A A A C A C C A C T A R 18C G T G T G C G T G T G C G T G C 1422(30365-31786)表2 C A V -2检测结果T a b l e 2 T h e r e s u l t s o f d e t e c t i n g CA V -2地区A r e a样本数S a m p l e 阳性率/%P o s i t i v e r a t e95%置信区间(C I)/%C o n f i d e n c e i n t e r v a l成都C h e n gd u 4327.814.1~41.5西昌X i c h a n g 4835.421.7~49.1重庆C h o n g q i n g 3023.37.6~39.0合计T o t a l12129.822.0~37.65892畜 牧 兽 医 学 报54卷Ә.本研究获得序列Ә.S e q u e n c e s o b t a i n e d i n t h i s s t u d y 图1 C A V -2E 3基因核苷酸序列进化树F i g .1 E v o l u t i o n a r y t r e e o f C A V -2E 3g e n e n u c l e o t i d e s e qu e n c e 后,细胞培养物在48h 左右出现稳定病变,表现为细胞圆缩㊁聚集呈典型的葡萄串状病毒,如图2B ㊂经测定,该分离株纯化后细胞半数感染值为10-9.46T C I D 50㊃0.1m L -1㊂经P C R 和间接免疫荧光试验及电镜鉴定该分离株为C A V -2㊂间接免疫荧光试验结果显示接毒的细胞胞浆内可见特异性的绿色荧光(图2C );电镜下可见排列整齐㊁无囊膜㊁大小约80n m 的典型腺病毒样粒子(图2D )㊂综上,本研究成功分离出一株C A V -2E 3基因自然缺失株,命名为G 1/C h i n a /C A V -2㊂2.4 G 1/C h i n a /C A V -2株对幼犬致病性2.4.1 临床表现 G 1/C h i n a /C A V -2株经口鼻感染幼犬3d 后,3只幼犬均出现体温增高㊁流鼻涕㊁打喷嚏的临床症状,体温变化详见图3A ;有2只第5天出现咳嗽的症状㊂第7天后感染犬临床症状逐渐减轻,第9天恢复正常㊂阴性组3只幼犬体温㊁临床表现正常㊂2.4.2 排毒情况 攻毒组幼犬在感染后第2天开始排毒,鼻咽拭子㊁粪便同时检测到病毒的排出;鼻咽排毒量在第5天达到高峰,第11天结束;粪便排毒第4天达到高峰,第8天排毒结束㊂排毒情况详见图3B ㊂2.5 G 1/C h i n a /C A V -2株基因组分析2.5.1 G 1/C h i n a /C A V -2完整基因组特征 本研究成功获得G 1/C h i n a /C A V -2株完整基因组68927期王佳丽等:犬腺病毒2型E 3基因自然缺失毒株的分离鉴定及其致病性A.对照细胞;B .接毒48h 病变细胞;C .间接免疫荧光;D.电镜(50000ˑ)A .C o n t r o l c e l l s ;B .C P E a t 48h h o u r s a f t e r v i r u s i n o c u l a t i o n ;C .I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e ;D .E l e c t r o n m i c r o s c o pe (50000ˑ)图2 分离毒株鉴定图F i g.2 I d e n t i f i c a t i o n p i c t u r e s o f t h e i s o l a t e d s t r a in A .试验犬体温;B .试验犬排毒情况A.T e m p e r a t u r e d e t e c t i o n o f p u p p i e s ;B .D e t o x i f i c a t i o n o f t h e p u p pi e s 图3 G 1/C h i n a /C A V -2攻毒后幼犬的体温和排毒情况F i g .3 T e m p e r a t u r e c h a n g e s a n d d e t o x i f i c a t i o n o f t h e p u p p i e s p o s t c h a l l e n ge (G e n B a n k 登录号:O P 060355),与G e n B a n k 中全部3条C A V -2全基因组核苷酸相似性为98.8%~98.9%㊂与已知C A V -2全基因组相比,本研究分离毒株除了在E 3基因第1035~1043n t 缺失外,在基因组5'端第341n t 有一个碱基G 插入㊁E 1A 基因上第531~542n t 缺失㊁D N A p o l y m e r a s e 上第4034~4036n t 缺失㊁基因组5'第28232n t 处,有一个碱基G 插入㊂与G e n B a n k 全部33条F i b e r 蛋白完整序列相比,G 1/C h i n a /C A V -2株有2个独特的氨基酸位点突变(F 220S ㊁K 493R );与G e n B a n k 全部35条H e x o n 蛋白完整序列相比,有1个独特的氨基酸位点突变(A 559T );P e n t o n 蛋白无独特的氨基酸位点突变,遗传稳定㊂选取G e n B a n k 中全部3条C A V -2全基因组,以及3条C A V -1和其他物种2型腺病毒全基因序列作为外围毒株,采用最大似然法建立进化树,结果显示G 1/C h i n a /C A V -2株与C A V -2参考序列聚为一大支,但单独聚为一小分支,见图4㊂经R D P 4.39软件分析未见重组事件发生㊂2.5.2 G 1/C h i n a /C A V -2株E 3基因特征 G 1/C h i n a /C A V -2株的E 3基因共1086b p,与G e n -B a n k 中全部3条完整C A V -2E 3基因序列核苷酸之间相似性为97.0%~97.4%㊁氨基酸相似性为95.3%~95.9%㊂与已知E 3基因完整序列比对后发现:G 1/C h i n a /C A V -2株除了E 3蛋白有4个氨基酸连续缺失(345~348a a)外,还有9个独特的氨基酸位点突变,见表3㊂基于G 1/C h i n a /C A V -2株完整E 3基因的进化树与基因组进化树一致(结果未7892畜牧兽医学报54卷Ә.本研究所获得的C A V-2基因组Ә.C o m p l e t e g e n o m e o f C A V-2o b t a i n e d i n t h i s s t u d y图4C A V-2全基因的最大似然法进化树F i g.4M a x i m u m l i k e l i h o o d e v o l u t i o n a r y t r e e o f C A V-2c o m-p l e t e g e n o m e展示)㊂3讨论犬呼吸道疾病是犬的常见病和多发病,感染性因素是主要原因,常见的病原包括病毒㊁细菌㊁支原体等[20];C A V-2是犬重要的呼吸道病毒之一[21],但国内对其研究不多㊂本研究对2021 2022年川渝部分地区患呼吸道疾病的犬鼻咽拭子进行C A V-2检测的检出率为29.8%,表明C A V-2已在川渝部分地区广泛流行,其与犬呼吸道疾病的关系值得进一步关注㊂与薛林杰[16]对河南省犬粪便样本的C A V-2检出率为2.48%以及冀君等[18]对河南㊁湖北㊁江苏三省犬腹泻样本的C A V-2检出率为8.5%表3分离毒株G1/C h i n a/C A V-2E3蛋白氨基酸位点突变T a b l e3A m i n o a c i d s i t e m u t a t i o n o f E3p r o t e i n o f t h e i s o l a t e G1/C h i n a/C A V-2对比毒株C o m p a r e d s t r a i n氨基酸位点P o s i t i o n o f a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n 107126235245247295325331363O P060355S H A M N E V N S A C000020T P T K D D M D P U77082T P T K D D M D P L C557011T P T K D D M D P相比,川渝部分地区鼻咽拭子的C A V-2检出率明显更高,可能与地域差异或样本类型有关㊂本研究成都地区的检出率为27.8%,高于张发明等[17]对成都地区2016 2017年犬鼻拭子的C A V-2检出率(17.75%),提示犬呼吸道样本中C A V-2的流行有上升的趋势,值得进一步关注㊂有趣的是,本研究获得的36条E3基因片段中,有25条的E3基因出现9个核苷酸的连续缺失,导致4个氨基酸的缺失(347~349a a),占阳性样本69.4%,表明E3基因自然缺失株已成为当前川渝部分地区C A V-2优势流行毒株㊂E3基因序列相对保守,但是近年国外报道了E3基因发生点突变现象[22-23],本研究发现E3基因缺失株,说明当前C A V-2E3基因已经出现变异现象㊂腺病毒E3基因编码的蛋白可以阻断MH C-Ⅰ类限制性抗原的呈递以减少细胞毒性T细胞对病毒的杀伤作用,以及抑制免疫介质发挥作用,从而使病毒逃避宿主免疫系统攻击[13]㊂因此,E3基因突变可能会影响其免疫逃避能力,使得病毒粒子更易入侵动物机体,加大了临床防控的难度㊂本研究E3基因自然缺失毒株有4个氨基酸缺失和9个独特的氨基酸突变,是否会影响该病毒的免疫逃避功能仍需进一步研究㊂此外,E3基因作为C A V-2检测的靶基因[24],核苷酸突变可能会影响临床检测的准确性,延误动物的疾病诊断与治疗,临床上需要高度关注㊂作者成功分离到一株E3基因自然缺失毒株G1/C h i n a/C A V-2,该毒株口鼻感染幼犬后引起明显的呼吸道症状,包括打喷嚏㊁流鼻涕以及咳嗽,未观察到腹泻症状,与其他学者的人工感染结果相似[25-26];也有C A V-2毒株人工感染幼犬后出现腹泻[27-28]或致死[29]的报道,表明C A V-2不同毒株引起的临床症状差异较大㊂但遗憾的是,所有人工感染试验均无毒株基因组信息的报道,无法分析其症状多样化的分子基础㊂因此,进一步加强基因组研究对探究C A V-2毒株致病性差异是非常必要的㊂本研究成功获得了分离毒株G1/C h i n a/C A V-2的基因组序列,这是首次获得中国C A V-2毒株的基因组序列㊂基于基因组的进化分析显示,G1/C h i-n a/C A V-2在进化树上单独位于一分支,和已知的C A V-2有明显的遗传距离,显现了独特的遗传进化88927期王佳丽等:犬腺病毒2型E3基因自然缺失毒株的分离鉴定及其致病性方式㊂进一步分析发现该毒株除了E3基因的独特突变外,还在F i b e r㊁H e x o n和E1A等蛋白有独特的氨基酸突变,这些氨基酸突变对C A V-2生物学特性的影响还需进一步研究㊂4结论本研究对2021 2022年川渝部分地区呼吸道病犬的鼻拭子进行了C A V-2检测,检出率为29.8%,表明C A V-2已在川渝部分地区广泛流行,该病毒与犬呼吸道疾病的关系值得进一步关注㊂首次发现E3基因自然缺失毒株,且该毒株已成为川渝部分地区优势流行毒株㊂成功分离出一株E3基因自然缺失毒株,人工感染幼犬后引起典型的呼吸道症状;获得该毒株的完整基因组,这是首次获得中国C A V-2毒株基因组㊂本研究结果有助于了解C A V-2的流行及遗传进化㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E C A R O N,MA R T E L L A V,B U O N A V O G L I A C.C a n i n e a d e n o v i r u s e s a n d h e r p e s v i r u s[J].V e t C l i nN o r t h A m S m a l l A n i m P r a c t,2008,38(4):799-814.[2] B E N E T K A V,W E I S S E N BÖC K H,K U D I E L K A I,e t a l.C a n i n e a d e n o v i r u s t y p e2i nf e c t i o n i n f o u rp u p p i e s w i t h n e u r o l o g i c a l s i g n s[J].V e t R e c,2006,158(3):91-94.[3] MA C A R T N E Y L,C A V A N A G H H M A,S P I B E YN.I s o l a t i o n o f c a n i n e a d e n o v i r u s-2f r o m t h e f a e 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