western blot操作规程-相关试剂配制

8SDS-PAGE电泳适用与Bio-Rad Mini Protean 3类电泳槽一、准备工作1 试剂蛋白marker；丙烯酰胺；双丙烯酰胺；Tris碱；甘氨酸；甲醇；冰乙酸SDS；过硫酸铵；甘油；溴酚蓝；β-巯基乙醇；考马斯亮蓝R-250；TEMED；正丁醇2仪器与耗材电泳系统；移液枪；电子天平；pH计；恒温加热器；EP试管；量筒（500ml,250ml,100ml,20ml）；烧杯（500ml,50ml）；玻璃引流棒；储液瓶；二、操作步骤a.灌制分离胶(6cm×8cm×1.5mm):1. 组装好凝胶模具，确保不会发生凝胶渗漏。

2. 凝胶配制所用组分如下：按10%配制（注：先加入○1○2○3○4，然后再从冰箱取出○5○6加入）3. 加入○5APS和○6TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。

（注：一定要将加入的溶液充分混匀，以免胶凝固的不均匀）4. 小心地用移液器将分离胶沿隔片加入模具。

（注：动作缓慢，以免产生气泡）5. 当加入的凝胶溶液7.4 mL时，轻轻在溶液上覆盖一层1 mL正丁醇饱和的水，使胶面平整。

6. 等40 min，待凝胶聚合后，在分离胶和水之间会出现一个清晰的界面。

（注：此时可制备蛋白样品。

具体见“c. 样品的制备”）b. 灌制浓缩胶1.浓缩胶配制所需组分如下：按3.9%配制2.倒出并用滤纸吸干覆盖在分离胶表面的水层。

（注：先加入○1○2○3○4，然后倒出水，最后再从冰箱取出○5○6加入）3.加入○5APS和○6TEMED后，轻轻振荡烧杯使其混匀。

4.小心地用移液器将浓缩胶沿隔片加入模具，直至凝胶到达模具的顶部。

5.斜着插上梳子。

（注：动作缓慢，尽量不要产生气泡）6.放置30 min左右，待凝胶聚合后，小心拔出梳子。

（注：拔出梳子时，要垂直拨出，以免损坏制好的泳道）7.将凝胶放入电泳槽中，在槽中加入1×电泳缓冲液。

（注：1，缓冲液所加入的量，○1玻璃内液面高于玻璃外液面，○2玻璃内的，液面高于短玻璃低于长玻璃。

2，尽量吸尽玻璃内液面的气泡，以免电泳过程中造成短路）c. 样品的制备：1.将蛋白样品和sample buffer在一1.5 mL管中混匀，于95℃加热5 min（或100℃ 3 min）。

2.离心1 sec，点样入泳道。

d. 电泳：1.接好电极，电流应流向阳极。

2.150 V恒压电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部1～5 mm处终止。

时间约60-75min。

（注：此时○1配制电转缓冲液，○2剪NC膜和滤纸）3.取出凝胶板，小心拆卸。

e. 染色与脱色：（注：此步骤按实验需要选择是否操作）考马斯亮蓝染色：1.戴上手套以免手指印留在胶上，将胶移入考马斯亮蓝溶液中，于振荡摇床上缓缓振荡染色2 h以上（一般3～4 h），染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器。

2.加入考马斯亮蓝脱色液，振荡脱色。

Western blot操作过程一、准备工作：1 试剂：Tris碱；甘氨酸；甲醇；预染marker (PRO-STAINTM Prestained Protein MarkerⅠ, mbi)Whatman滤纸（普通实验室用的不行，要厚的，夹膜用的）一抗；二抗；Western试剂盒(170-5013, Bio-Rad)；硝化纤维膜(Amersham)；X光片(最好是柯达的)；显影粉（国产，洗普通照片的即可）；定影粉（国产，洗普通照片的即可）；2 仪器及耗材：膜标记笔；电转系统；冷却系统；磁力搅拌器；水平脱色摇床；锥型瓶（50ml,2个）；托盘；保鲜膜；二、操作步骤（除非特别提到，以下操作均在室温水平摇床上缓缓振荡进行）：1.SDS-PAGE变性电泳；2.电转移：a．将电转用到的膜和滤纸（1张膜+6张滤纸/一块胶）浸泡在电转缓冲液中10min。

（注：此时将分离胶从玻璃板中取出并浸泡到电转缓冲液中）b．按3张滤纸—胶—膜—3张滤纸的顺序包好，并将滤纸四边按胶的大小剪掉，确保胶两边的滤纸无法接触到。

C．将包好的胶放入转移胶架中，（原则：膜白胶黑）。

然后将胶架放入电转槽中。

（原则：黑对黑，白对红）d．倒入电转缓冲液，放入冰盒和磁转子。

将电转槽放到磁力搅拌器上，放入冰箱。

e．进行电转：350mA恒流，时间75min。

（注：此时○1配制TTBS,1×TBS;○2配制Blocking buffer；○3配制一抗和二抗并放入冰箱）3.洗膜：1×TBS 20 mL，5 min×2次。

（注：膜的触胶面为正面向上放置）4.封闭：Blocking buffer 20 mL，1 h。

5.洗膜：TTBS 20 mL ，5min×3次。

6.孵育一抗：15mL一抗，1.5h。

7.洗膜：TTBS 20 mL ，5min×3次。

8.孵育二抗：15mL一抗，1.5h。

（注：此时配制显影液和定影液）9.洗膜：TTBS 20 mL，5min×3次。

（注：此时配制发光底物）10.将膜上多余的水分去尽，摊到事先铺好的保鲜膜上。

11.化学发光底物与膜反应5min（注：反应过程中要保持膜湿润，并浸没在发光底物中）。

12.控去膜上水分（不要干），保鲜膜包好，四周要留些边。

用透明胶将其贴在X光片夹中。

13.暗房内在X光片上曝光30 sec，1 min，10 min，1 h。

14.将X光片在显影液中摇晃，直至X光片上出现并达到合适黑度。

15.X光片清水中漂洗片刻，放入定影液20 min，自来水漂洗2 h以上，晾干。

Western blot 所需试剂蛋白提取所用试剂：蛋白提取液：Hepes 、二硫苏糖醇（DTT）、胃蛋白酶抑制剂、亮肽素、antipain（抗痛素）、PMSF溶剂：KOH、异丙醇、甲醇SDS-PAGE电泳所用试剂：丙烯酰胺、双丙烯酰胺、SDS 、Tris-base 、APS 、甘氨酸、β-巯基乙醇、甘油、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250 、冰乙酸、TEMED、预染Mark 溶剂：HCl电转所用试剂：NaCl 、Tween-20 、脱脂奶粉、NC膜、whatman滤纸蛋白含量测定所用试剂：考马斯亮蓝G-250 、85% 磷酸、95% 乙醇显影所用试剂：定影液、显影液、保鲜膜、X光片、剪刀、直尺、铅笔、计时器Acrylamide/Bis (30% T, 2.67% C)：丙烯酰胺58.4 g (29.2 g/100 mL)双丙烯酰胺 1.6 g (0.8 g/100 mL)纯净水定容至200 mL，过滤，于4 °C下黑暗保存，戴手套操作，操作尽量避光10% (w/v) SDS：戴口罩，风扇关将2 g SDS加入18 mL dd H2O中，轻柔搅拌溶解后，用dd H2O定容至20 mL。

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8：Tris base 27.23 g (18.15 g/100 mL)dd H2O 80 mL用6 N HCl 调pH 值至8.8。

用dd H2O定容至150 mL，并于4 °C存放。

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8：Tris base 6 gdd H2O 60 mL用6 N HCl 调pH 值至6.8。

用dd H2O定容至100 mL，并于4 °C存放。

1M Tris-HCl, pH 6.8:Tris base 6gdd H2O 30ml用6 N HCl 调pH 值至6.8。

用dd H2O定容至50mL，并于4 °C存放电泳缓冲液母液Electrode Buffer, 10×，pH 8.3 (1 L)：Tris base 30.3 g甘氨酸144.0 gSDS 10.0 g溶解后，用dd H2O定容至1,000 mL (不要用酸或碱调pH 值)。

电泳工作液：将90 mL of 10×母液用810 mL dd H2O稀释，并完全混匀。

电转缓冲液：Tris 3.03 g甘氨酸14.4 g甲醇200 mL 加dd H2O至1000 mL。

测定其pH一定要大于8.0, 否则重配，不要加HCl调节pH。

4℃备用。

Stock Sample Buffer 母液，5×: （用于配置蛋白样品）1 M Tris-HCl, pH 6.8 12.5 mL (sterile)甘油25 mL (sterile) (高压灭菌)SDS 1 g溴酚蓝12.5 mg混匀，并充分溶解，室温保存。

Reducing Sample Buffer 工作液：5×SDS Reducing Sample Buffer(现配现用) β-巯基乙醇(β-Me) 30 µl5×SDS Stock Sample Buffer 100 µl混匀，并充分溶解，室温保存。

上样蛋白配置：（30ul 体系）5×SDS Reducing Sample Buffer 6 µl蛋白样50ug裂解液补体系至30ul混匀，95 °C 加热5 min，室温冷却后加入样品井中。

10× TBS 母液（1 L）：Tris 24.2 gNaCl 80 g 加HCl调节pH 至7.6 。

1× TBS 工作液：取10× TBS的50ml，加水定容至500ml10% APS (现配现用)：（一周失效）Wash Buffer（TTBS）(现配现用):1× TBS 400mlTween-20 400ulBlocking Buffer 封闭液(现配现用):TTBS 20mlnonfat dry milk 1gAntibody Buffer (现配现用): (一个抗体用15ml antibody buffer)TTBS 15mlnonfat dry milk 0.03g考马斯亮蓝染色液（1 L）：考马斯亮蓝R-250 1.0 g甲醇450 mLddH2O 450 mL搅拌2 hr直至完全溶解，然后加入冰乙酸100 mL混好溶液后，过滤，用棕色瓶(empty "methanol" or "ethanol" bottle)盛装，室温下保存。

凝胶应在RT下缓缓振荡染色2 h以上。

染色液反复使用不可超过3次。

考马斯亮蓝脱色液（1 L）：甲醇100 mL冰乙酸100 mLdd H2O 800 mL蛋白含量测定Stocking Reagent（原液）：考马斯亮蓝G-250 1g85%磷酸200ml95%乙醇100ml将混合物于磁力搅拌器上搅拌溶解，至完全溶解为止（需2 h以上），然后，过滤溶液，溶液密封存放于旧的棕色乙醇瓶中，4℃放置（可长期存放）。

蛋白含量测定Working Reagent（工作液）：即DyeStocking reagent 15ml85%磷酸40ml95%乙醇20mlddH2O 加至总体积为400ml将溶液混匀后，过滤，溶液密封存放于旧的棕色乙醇瓶中，4℃放置（可放置数周）。