叶绿素的提取分离和测定(精)

叶绿素的提取和分离实验报告叶绿素的提取和分离实验，这可真是个有趣的课题。

想象一下，阳光下的小植物，满身的绿色，就像穿着翠绿衣裳的小精灵。

你可知道，叶绿素可不是简单的东西，它可是植物的“魔法武器”。

今天咱们就来聊聊这个实验，顺便看看怎么把叶绿素提取出来，真是让人充满期待啊。

准备工作可得做足。

找几片新鲜的绿叶，最好是一些比较嫩的，比如菠菜或者其他绿叶蔬菜。

小伙伴们，记得洗干净哦，卫生第一。

然后，撕碎这些叶子，越小越好，这样才能让叶绿素更容易释放出来。

这一过程就像是在给小植物“做美容”，哈哈。

撕的过程中，脑海里不禁浮现出那些清新的味道，真是让人忍不住想咬一口。

咱们要用到一些工具。

把撕碎的叶子放进研钵里，加入一些酒精，建议用乙醇。

酒精可真是个好帮手，它能把叶绿素从叶子里“撇”出来。

用杵子慢慢研磨，直到叶子变成绿油油的糊状。

这一刻，感觉自己就像是个小炼金术士，手里的东西似乎在变得神奇。

油绿的汁液渐渐渗出来，真是让人心花怒放。

这时候，你会发现，液体的颜色开始变得浓郁。

小心翼翼地把混合物过滤到一个试管里，别让那些叶子的渣滓混进来哦，咱们要的可是纯粹的叶绿素。

就像在筛选黄金一样，真是小心翼翼。

一过滤，看到清澈的液体，那一瞬间，心里不禁乐开了花，感觉这就是成功的象征。

可以用薄层色谱法来分离叶绿素。

想象一下，在薄层板上，一滴滴的液体就像小小的水滴，兴奋地准备出发。

小心地把试管里的液体滴在板上，然后将薄层板放入含有溶剂的小容器里。

那一刻，真的感觉自己像是在观看一场精彩的表演。

随着时间的推移，液体在板上缓缓移动，颜色也在不断变化。

简直是科学和艺术的结合，太美了！经过一段时间，取出薄层板，看到上面的色带，一条条的，绿的、黄的、甚至还有些微微的蓝色。

这时候，心里默念：“这就是大自然的调色板！”咱们可以用尺子量量这些颜色的距离，分析一下不同色带的组成，原来叶绿素还有好几种呢。

真是让人意外，看来这小小的绿叶，藏着的秘密可真不少。

叶绿素的快速提取与精密测定一、本文概述本文旨在探讨叶绿素的快速提取与精密测定的方法。

叶绿素是绿色植物中的重要色素，不仅赋予植物鲜明的绿色，而且在光合作用中扮演着关键角色。

因此，叶绿素的提取与测定对于理解植物生理学、生态学和环境科学等领域的研究具有重要意义。

本文将详细介绍叶绿素的提取过程，包括材料的选取、提取剂的选用、提取条件的优化等，并阐述精密测定叶绿素的原理和方法，以提高测定的准确性和可靠性。

通过本文的阐述，读者可以了解叶绿素的提取与测定技术，为相关研究提供有益的参考和指导。

二、叶绿素的快速提取方法叶绿素的提取是植物生理学和生态学研究中不可或缺的一环，其准确性和效率直接影响到后续的分析结果。

传统的提取方法往往耗时较长，且提取效果不尽如人意。

因此，我们开发了一种快速、高效的叶绿素提取方法，以期满足现代科学研究对速度和精度的双重需求。

本方法采用有机溶剂萃取法，通过优化溶剂种类、温度和时间等参数，实现了叶绿素的快速提取。

具体来说，我们将新鲜植物叶片剪碎，加入预热的有机溶剂（如丙酮、甲醇等）进行浸泡和搅拌。

在适当的温度下，叶绿素分子能够迅速从植物组织中溶解到有机溶剂中，从而实现快速提取。

与传统方法相比，本方法具有显著的优势。

提取时间大大缩短，通常只需几分钟至十几分钟即可完成整个提取过程。

提取效率显著提高，能够更充分地释放叶绿素分子，减少损失。

本方法还具有操作简便、安全可靠等特点，适用于批量样品的快速处理。

为了验证本方法的准确性和可靠性，我们进行了多组对比实验。

结果表明，本方法提取的叶绿素含量与传统方法相比无显著差异，且重现性良好。

我们还对提取过程中可能出现的干扰因素进行了系统分析，并提出了相应的解决方案，以确保提取结果的准确性。

本方法是一种快速、高效、简便的叶绿素提取方法，适用于各种植物叶绿素的提取和分析。

我们相信，这一方法的推广应用将有力推动植物生理学和生态学等相关领域的研究进展。

三、叶绿素的精密测定技术在完成了叶绿素的快速提取之后，接下来就需要对提取的叶绿素进行精密测定。

叶绿素含量测定方法---丙酮法由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。

藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。

叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。

取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。

采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。

按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。

定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）：叶绿素a含量用以下公式进行计算：Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数叶绿素b含量用以下公式进行计算：Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数叶绿素总含量用以下公式进行计算：Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。

此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。

叶绿素提取方法提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300.一、直接浸提法：1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。

植物叶绿体色素的分析一、实验目的：1、学会叶绿体色素的分离方法。

2、掌握叶绿素的定量测定。

一、3、了解高等植物叶绿体色素的种类组成、性质。

二、实验原理：1、叶绿体色素的提取：（1）原理：叶绿体色素是植物捕获太阳能进行光合作用的重要物质，高等植物的叶绿体色素一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。

叶绿体色素的提取是利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,将待测的植物叶片用研钵研磨让植物组织破碎，利用丙酮的溶解能力将叶绿体色素溶于丙酮中，通过用滤纸过滤分离植物组织碎片，即可以得到叶绿体色素的丙酮粗提液。

（2）步骤：称取新鲜的植物叶子(菠菜等)4g，放入研体中加5ml80%丙酮，少许碳酸钙和石英砂,研磨成匀浆,再加入20ml丙酮，以漏斗过滤到棕色瓶中备用2、叶绿体色素的分离：（1）原理：叶绿体色素的分离提纯一般用层析的方法，其中纸层析是最简单的一种。

当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，引起它们的移动速度不同，因而使混合物分离。

（2）步骤：1）取滤纸条(6.5×30cm),在离纸边1.5cm处用铅笔划一直线，在另一端两角分别拴上一根线(见图1)，用毛细管取吸绿素提取液沿着铅笔线划一条样带，使样带宽度在3mm以内，如色素过淡用电吹风吹干后再点数次，直到样带呈深绿色为止。

2）在层析缸中加入四氯化碳20ml及少许无水硫酸钠,然后将滤纸吊在层析缸中,使下端浸入溶剂中,色素点要略高于液面,滤纸条边缘不可碰到层析缸璧(如图2)用聚乙烯薄膜两层封住层析缸,直立于暗处层析。

3）0.5小时后，观察色素带分布(最上端是橙黄色的胡萝卡素，其次是黄色的叶黄素，然后是兰绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b)，记录色谱图。

如图所示：3、叶绿体色素的性质（一）荧光现象：叶绿体色素在吸收光能以后可以从基态跃迁到激发态，当处于第一单线态（激发态）的电子再回到基态时其携带的能量将以光的形式放射出来产生荧光，叶绿素荧光的颜色是红色的。

实验四：叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定实验目的1、了解叶绿素分离与提取的原理和方法2、了解它们的光学特性和理化性质3、了解叶绿素a、b含量测定的方法。

实验原理1.脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

2.分离：（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。

由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。

（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

3.叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数) 因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。

测定663nm 和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。

其校正过的公式为：Ca＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/LCb＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L实验器材：1、仪器：剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、天平、研钵、滤纸2、试剂：石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液3、材料：菠菜实验步骤：1、叶绿素的提取称取去中脉叶片2g左右，剪碎放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成浆，再加入丙酮10ml，用漏斗过滤即为色素提取液，暗处备用。

叶绿体色素的提取、分离及定量测定一、实验结果1、 滤纸带纸层析：2、 圆形滤纸层析：3、 叶绿素a 、b 含量的测定Ca=12.7A663—2.69A645 Cb=22.9A645—4.68A663推动剂边缘 胡萝卜素 叶黄素叶绿素a （蓝绿色）叶绿素b （黄绿色） 叶绿素b （黄绿色）叶绿素a （蓝绿色）叶黄素胡萝卜素推动剂边缘次数组数Ca=31.35（稀释后数据计算）Cb=15.04（稀释后数据计算）二、问题思考1、大部分植物依靠光合作用合成自身生长繁殖所需的有机物。

光合作用所需色素主要有类胡萝卜素和叶绿素。

其中直接参与光合的是叶绿素a，中心色素，其余为天线色素。

2、叶绿素为双羧酸的酯，一个羧基被甲醇酯化，另一个羧基被叶绿醇酯化。

不溶于水而溶于有机溶剂如酒精、丙酮、石油醚。

叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色。

结构的基本特点为拥有一个卟啉环头部及一条叶醇链尾部。

其卟啉环头部由四个甲烯基和四个吡咯环连接而成，大环中央有一个镁原子和四个氮原子结合。

镁原子带正电荷，相连的氮原子偏于带负电荷，因此卟啉环呈极性亲水，可以与蛋白质结合。

尾部叶醇基具有疏水性，为脂溶性物质。

叶绿素a、b结构基本相同，以-CHO代替CH3即为叶绿素b。

叶绿素吸收光谱3、纸层析可行原因：a、色素可提取b、色素可以溶解于某些溶剂中c、不同类型色素在同一溶剂中溶解度不同d、色素分子不会吸附滤纸纤维上e、色素分子可以在体外条件下稳定存在4、本次实验叶绿素a、b含量比值偏低，说明实验有误差。

而由于叶绿素a含有醛基，易于被氧化，亦可导致a的含量下降。

同时由于实验在11月末进行，植物中叶绿素含量下降，a，b的比值可能会受影响。

5、实验注意事项：a、叶片要选取绿色较深的部位，去除叶脉；b、尽量先剪碎，便于之后的研磨；c、研磨前加入二氧化硅和碳酸钠，注意用量。

量少研磨不充分，叶绿素会被液泡中的有机酸破坏；量大不易过滤完全且会使色素层析时颜色变淡；d、过滤时所用棉花不可过多，否则滤液完全被棉花吸收。

植物生理学实验报告实验题目：叶绿素的提取、分离及化学性质鉴定姓名班级学号一、实验原理和目的目的：1.练习叶绿素提取和分离的方法2.进一步了解叶绿素色素成分提取、分离原理：1、溶解性。

叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取2、吸附性。

滤纸对Chlb、Chla、叶黄素、胡萝卜素的吸附能力不同，当用石油醚作推动剂时，其在滤纸上的移动速度不同，可相互分离。

二、实验器具和步骤材料:新鲜植物叶片器具：研钵一个，漏斗一个，刻度试管两支，剪刀一把，长滴管一个，培养皿(直径9cm)一个，圆形滤纸（11cm和7cm)各一张，滤纸条一张试剂：95%乙醇，石油醚步骤：1.色素提取（乙醇粗提液）a.取新鲜叶片洗净擦干，去中脉称1g左右剪碎于研钵b.研钵中加3-5ml95%乙醇研磨成匀浆过滤于刻度试管残渣用少许乙醇冲洗一并过滤定容至10ml2.荧光观察将乙醇提取液试管放于太阳光下观察反射光和透射光下的颜色现象：透射光下呈绿色，反射光下呈红色为叶绿素荧光3.色素萃取（石油醚提取液）取乙醇提取液5ml与另一支试管加2ml石油醚摇荡静止片刻上层深绿色为石油醚提取液4.色素分离a.将（11cm)圆滤纸中间剪一小圆孔取滤纸条捻成紧实芯一端插入圆滤纸中心（孔缘与纸芯紧贴且露出少许，最好相平）用长滴管吸少许石油醚提取液滴于纸芯上端待风干后再滴加几次b.将盛有石油醚的内盖（不要过满）放于培养皿中央将插上纸芯的滤纸放在培养皿上纸芯下端浸入石油醚迅速盖好培养皿。

c.推动剂前缘接近滤纸边缘时取出滤纸，风干可见分离色带，用铅笔标出各种色素位置和名称三、实验数据和作业四、数据分析研磨叶片不充分，提取的叶绿体色素溶液浓度稀，荧光现象不明显分离色带较少的原因：提取的叶绿素的浓度稀胡萝卜素叶黄素。

叶绿体色素的提取、分离及含量测定实验目的叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。

叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。

另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。

因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。

实验原理从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。

利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。

分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。

纸层析是其中最简单的一种。

当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。

强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。

而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。

叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。

A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。

植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。

研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。

本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。

材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。

方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。

2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。

3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。

4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。

5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。

6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。

7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。

结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。

加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。

加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。

通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。

叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。

这种反应也证实了叶绿体的存在。

叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。

叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。

乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。

这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。

叶绿素的提取与分析测定叶绿素是一类广泛存在于植物、藻类和一些细菌中的色素分子，它在光合作用中起着重要的作用。

叶绿素的提取和分析测定是植物生理学、植物生态学、环境科学等领域的研究中常用的实验操作之一、本文将介绍叶绿素的提取和分析测定的方法及其应用。

1.取新鲜叶片，将其放置于干净的细网纱袋中，用乙醇浸泡片刻，使其浸润。

2.将浸泡的细网纱袋取出，轻轻挤压以使叶绿素溶出。

3.用乙醇将溶液稀释至一定浓度。

4.离心沉淀，将上清液取出，即可得到叶绿素溶液。

叶绿素的浓度可以通过分光光度法进行测定。

分光光度法是根据不同物质对光的吸收特性来测定其浓度的一种分析方法。

具体步骤如下：1.将提取得到的叶绿素溶液置于紫外可见分光光度计中。

2. 使用合适的波长进行测定，一般波长为663 nm和645 nm。

3.依次测定样品和纯溶剂（如乙醇）的吸光度，并计算其差值。

4.根据比色法原理，利用比色计算公式或标准曲线，计算叶绿素的浓度。

叶绿素的分析测定可以帮助我们了解植物光合作用的效率、叶片的生理状态、环境因子对植物的影响等。

叶绿素浓度的变化可以指示植物对环境的适应能力和营养状态。

因此，叶绿素的提取与分析测定在植物生态学研究、农业生态学研究、环境科学研究等领域中得到广泛应用。

叶绿素的提取与分析测定方法的选择应根据具体的研究目的和实验条件进行优化。

例如，在进行叶片叶绿素含量测定时，应尽量选择含有丰富叶绿素的叶片样品，避免阳光直射、避免用硬物破坏叶片结构等。

在选择测定波长时，要根据叶绿素的特性选择吸收峰值附近的波长，以提高测定的准确性。

总之，叶绿素的提取与分析测定是植物生理学、植物生态学、环境科学等领域研究中常用的实验操作。

通过选择合适的提取方法和测定方法，可以准确测定叶绿素的含量，从而为相关研究提供重要的数据支持。

叶绿素的提取与分析测定叶绿素的提取与分析测定是一项重要的生物技术实验，主要用于研究植物光合作用中的重要色素——叶绿素。

下面将详细介绍实验的步骤、方法和数据分析。

一、实验目的本实验旨在提取和分析测定叶绿素，了解其在植物光合作用中的重要作用，并为进一步研究植物生长和发育提供基础数据。

二、实验原理叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，它能够吸收太阳光能，并将其转化为化学能，为植物的生长和发育提供能量。

叶绿素广泛存在于植物的绿色组织中，尤其在叶片中含量最为丰富。

本实验将采用有机溶剂（如乙醇、丙酮等）从植物组织中提取叶绿素。

提取后的叶绿素可通过分光光度法进行定量分析。

三、实验步骤1.样品准备：选取新鲜植物组织（如叶片），用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干表面水分，称取一定质量（m）的样品备用。

2.叶绿素提取：将样品放入研钵中，加入适量有机溶剂（如乙醇-丙酮混合液），研磨成匀浆。

将匀浆转入离心管中，于低温下离心（如4℃、10000 r/min），收集上清液备用。

3.叶绿素定量分析：取一定体积（V）的上清液，加入适量蒸馏水稀释，用分光光度计在663nm和646nm波长下测定吸光度（A）。

根据朗伯-比尔定律，叶绿素的浓度（C）可由吸光度计算得出。

公式如下：C = (11.77A663 -2.59A646) / m / V4.数据记录：记录每个样品在各波长下的吸光度，并计算出叶绿素浓度。

5.数据分析：对所得数据进行统计分析，比较不同样品间的叶绿素含量差异，并绘制柱状图或饼图等图形表示结果。

四、实验结果与数据分析假设我们选取了三种不同植物的叶片进行实验，以下是实验所得的数据：1.三种植物叶片中叶绿素的含量存在差异，其中样品1的叶绿素含量最高，样品3的含量最低。

这可能与不同植物的生物学特性有关。

2.根据所得数据绘制柱状图或饼图等图形，可以直观地展示不同样品间的叶绿素含量差异。

这有助于我们进一步了解植物间的差异以及叶绿素在植物生长和发育中的作用。

叶绿素的提取和分离实验
叶绿素的提取：称取5 g的绿叶，剪碎，放入研钵中→加入少量二氧化硅、碳酸钙和10 mL无水乙醇→研磨→过滤→收集到试管内并塞严试管口。

准备过滤纸条：将过滤纸条剪成略小于试管长度和直径的过滤纸条，将滤纸条的一端剪去两角，在距离剪角一端1cm处用铅笔画一条细的横线。

画滤细线：用毛细管吸取少量滤液，并沿铅笔线均匀划出一条细线，待滤液干后再画1~2次。

叶绿素分离：在试管中倒入适量层析液。

得到滤纸上的四种颜色、不同宽度的色素带。

叶绿素提取注意事项：
准备滤纸时，要将滤纸的一端剪去两角，这样可使色素扩散到滤纸上，以便于观察实验结果。

过滤时不用滤纸过滤而用单层尼龙布过滤是因为滤纸对色素具有吸附作用，若用其过滤，会导致收集到的滤液色素含量少，使实验效果不明显或失败。

叶绿素提取、分离与测定曹志凡141140003一．实验目的1、了解叶绿体色素的构成；2、了解叶绿素的某些物理及化学性质，掌握提取叶绿素及分离叶绿素的原理；3、了解纸层析法分离色素的实验原理4、学会用纸层析的方法分离叶绿体色素；5、初步学习用分光光度计测定叶绿素ab含量。

二．实验原理1.植物叶绿体色素是吸收太阳光能,进行光合作用的重要物质.它一般由叶绿素a,叶绿素b,胡萝卜素和叶黄素组成，它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体。

2.绿色素（包括叶绿素a蓝绿色和叶绿素b黄绿色）和黄色素（包括胡萝卜素黄色和叶黄素橙黄色）这两类色素都很难溶于水，而易溶于有机溶剂,故可用乙醇,丙酮等有机溶剂提取。

3.由于光合色素位于叶绿体中的类囊体上，要把它提取出来必须破坏叶表皮、细胞壁和细胞膜、叶绿体的双层膜，所以要剪碎后加二氧化硅研磨，以便充分提取色素。

4.叶绿素是一种含镁的化合物，其中的镁易被H+、Cu2+、Zn2+等取代。

当被H+取代后，就形成去镁叶绿素，呈黄褐色。

虽然研磨过程中不发生产生大量H+的化学反应，但液泡中常含有多种有机酸。

一般认为，碳酸钙的作用在于中和研磨过程中产生的H+，以防止叶绿素被破坏。

5.纸层析法又称纸色谱法。

以纸为载体的色谱法，固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。

根据不同色素在层析液中的溶解度不同造成随层析液扩散速度不同这一原理进行分离。

6.当层析溶剂不断从纸上流过时,由于混合物(叶绿素提取液)中各种成分在固定相和流动相间溶解度和吸附能力不同而具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后,可将各种色素分开，其中胡萝卜素在层析液中的溶解度最高，扩散速度最快，其次是叶黄素、叶绿素a，叶绿素b溶解度最低，扩散得最慢。

7.分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度，样品的吸光值与样品的浓度成正比。

实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。

原理如下：1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。

2.皂化反应。

叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。

3.取代反应。

在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。

H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。

4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。

透射光下呈绿色，反射光下呈红色。

5.光谱分析。

叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。

三、主要仪器设备1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2.研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤1.定性分析a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。

b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。

加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和HO 1ml分层后观察。

2c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。

观察颜色变化。

2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。

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叶绿素的提取及含量测定实验报告1【实验目的】1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质的分离提纯与方法。

2、通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。

【实验原理】叶绿色存在两种结构相似的形式即叶绿素A(C55H77O5N4Mg)和叶绿素B（C55H70O6N4Mg）胡萝卜素是具有长链结构的共轭多烯，有三种异构体；叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物。

是胡萝卜素的羟基衍生物。

当提取时，从上到下颜色依次为：黄绿色，蓝绿色，黄色和橙色。

【实验仪器】研钵，色谱柱，丙酮，乙醇，乙醚，中性氧化铝，菠菜叶，烧杯，漏斗，玻璃棒，滤纸，剪刀，脱脂棉，纱布。

【实验步骤】1、称取30g洗净后用滤纸喜感的新鲜菠菜叶，用剪刀剪碎，放入研钵中研磨，研磨时放入少量碳酸钙，防止研磨过猛破坏叶绿素结构，研磨至烂。

2、将研磨碎的菠菜叶转入小烧杯中，加入30mL配好的乙醇乙醚溶液，盖上表面皿，防止有机溶剂蒸发。

按小组成员分别浸泡10,15,20,25,30,35,40,45,50,55分钟。

3、浸泡期间，填充色谱柱，在最下面垫入脱脂棉，再盖上一个小滤纸片，装入氧化铝至4/5处，再盖上一层滤纸片。

4、将烧杯中的菠菜叶连带着有机溶剂用纱布挤入漏斗中，转入分液漏斗，加入10mL水洗涤，除去水层（下层），再用10mL水洗涤一次。

5、将分页漏斗中的溶液慢慢倒入色谱柱中，加几滴丙酮既可以看到颜色变化。

6、洗净仪器，收拾实验室，打扫卫生。

【注意事项】1.过滤时不能用滤纸，而是用脱脂棉。

原因是滤纸能吸收色素，降低滤液中色素的含量，使实验效果不明显。

2.加入丙酮后要迅速、充分研磨，以防止丙酮挥发，使更多的色素溶解在丙酮中。

叶绿素a 、b 含量测定含量测定【实验目的】熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a 和b 的方法及其计算。

的方法及其计算。

【实验原理】 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer 定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。

到两种组分的含量。

如图3-3叶绿素a 和b 的吸收光谱曲线，叶绿素a 的最大吸收峰在663nm ，叶绿素b 在645nm ，吸收曲线彼此又有重叠。

，吸收曲线彼此又有重叠。

根据Lambert-Beer 定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C 与光密度OD 之间有如下的关系：之间有如下的关系：OD 1=C a ·k a1+C b ·k b1 （1）OD 2=C a ·k a2+C b ·k b2 （2）式中：C a 为组分a 的浓度，g/L ；C b 为组分b 的浓度，g/L ；OD 1为在波长λ1（即组分a 的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD 值；值；OD 2为在波长λ2（即组分b 的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD 值；值；k a1为组分a 的比吸收系数，即组分a 当浓度为1g/L 时，于波长λ1时的光密度OD 值；值；k b2为组分b 的比吸收系数，即组分b 当浓度为1g/L 时，于波长λ2时的光密度OD 值；值；k a2为组分a （浓度为1g/L ），于波长λ2时的光密度OD 值；值；k b1为组分b （浓度为1g/L ），于波长λ1时的光密度OD 值；值；从文献中可以查到叶绿素a 和b 的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L 时，比吸收系数k 值如下：值如下：波 长（nm ）叶绿素a 叶绿素b 66382.04 9.27 645 16.75 45.60将表中数值代入上式（1）、（2），则得：），则得：OD 663=82.04×=82.04×C C a +9.27×+9.27×C C bOD 645=16.75×=16.75×C C a +45.60×+45.60×C C b经过整理之后，即得到下式：经过整理之后，即得到下式：C a =0.0127 OD 663-0.00269 OD 645C b =0.0229 OD 645-0.00468 OD 663如果把C a ，C b 的浓度单位从原来的g/L 改为mg/L ，则上式可改写为下列形式：，则上式可改写为下列形式： C a =12.7 OD 663-2.69 OD 645 （3）C b =22.9 OD 645-4.68 OD 663 （4）C T = C a + C b =8.02 OD 663+20.21 OD 645 （5）（5）式中C T 为总叶绿素浓度，单位为mg/L 。