“HE 染色过程”
试验前准备: 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片
试剂名称:无水乙醇,氨水,冰乙酸,盐酸,二甲苯,中性树胶，HE 染液
配制试剂:
1%盐酸乙醇分化液配制：
36%—38%盐酸：1ml
75%乙醇：99ml
1、0.2%氨水配制:
25%—28%氨水：0.2ml
自来水：100ml
pH 值在7.5—8之间
试验过程：记录试验的具体步骤，
1，烤片：2小时，温度60℃（目的：使组织切片与载玻片贴合的更加紧密）
2.切片脱蜡至水：
①二甲苯Ⅰ：10min
②二甲苯Ⅱ：10min
③无水乙醇Ⅰ：5min
④无水乙醇Ⅱ：5min
⑤95%乙醇：2min
⑥90%乙醇：2min
⑦80%乙醇：2min
⑧70%乙醇：2min
⑨自来水洗：2min
3.染色：
①苏木精染色：10min
②自来水洗：1min
③1%盐酸乙醇分化：数秒
④自来水洗：1min
⑤0.2%氨水返蓝：30s±
⑥自来水洗：1min
⑦伊红染色：5min
⑧自来水洗：速洗
4. 37℃烘干0.5h以上，中性树胶封固。
骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。
2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。
4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。
5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。
6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。
7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。
免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。
2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min)。
3.PBS冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min,自然冷却至室温。
5.PBS冲洗3次，每次5min。
6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。
7.PBS冲洗3次，每次5min。
8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。
10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。
11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。
12.DAB显色5min。
13.自来水冲洗10min。
14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。
15.自来水冲洗10min。
16.常规脱水，透明，封片，镜检。
he染色步骤 HE实验步骤动物病理切片小结[样本处理]动物麻醉后，开胸，暴露心脏，头皮针插入左心室尖，打开37?生理盐水输液装置，从右心耳下沿剪开右心房，灌洗至流出的生理盐水无血(20min)，换4%多聚甲醛固定液灌注(约5min)[固定]4%多聚甲醛固定。
[石蜡切片]? 取样从固定中取出待切组织，用手术刀切成2mm厚度的小样，装入脱水小盒中，铅笔标号纸条同放入小盒后流水洗30min，蒸馏水浸洗? 处理Mice:脱水50%乙醇 2-3h170%乙醇 1-2h80%乙醇 1h95%乙醇 2h(1h+1h)100%乙醇 2h(1h+1h)透明二甲苯 35min+35min浸蜡 1h+1h+1h (62?蜡)[HE染色]脱蜡二甲苯? 15min二甲苯? 15min二甲苯:无水乙醇(1:1) 2min无水乙醇? 2min无水乙醇? 2min95%乙醇 2min85%乙醇 2min70%乙醇 2min50%乙醇 2min蒸馏水 5min(如果是DAB染色要抗原修复)HE染色? 苏木素 6-8min (时间可以延长，现在10-30min)? 冲洗 1min(反向将载玻片反向冲洗，注意不要脱片)2? 含1%盐酸的乙醇进行分色(用75%乙醇配)2-3s动作要快? 氨水反蓝 >10min? 伊红 10s? 冲洗固定脱水95%乙醇 2min100%乙醇? 2min100%乙醇? 2min二甲苯? 2min二甲苯? 2min 树胶封片组织浸蜡-常规石蜡切片制作组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65?左右熔化的石蜡中，于65?的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。
组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。
组织浸蜡时，由于诱导剂(二甲苯)的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。
当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里3面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。
HE染色步骤1．将于60℃烤箱中的烤片取出后立即放入二甲苯Ⅰ（透明）中15min，若切片已放置已久，则在浸二甲苯之前需将切片在60℃烤箱中烤2h以上；2．将切片于二甲苯Ⅱ15min，应观察到组织切片呈透明状，否则继续浸于二甲苯中；3．切片浸于1/2酒精+1/2二甲苯5min；4．将切片从二甲苯中取出稍甩掉二甲苯，于梯度乙醇中脱去二甲苯：无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min →95%酒精5 min→90%酒精5min→80%酒精5min→70%酒精5min；5．切片从70%酒精取出后稍冲洗：浸洗于蒸馏水Ⅰ5min →蒸馏水Ⅱ5min；6．蒸馏水浸洗后稍甩干水分用苏木精染色约15min；7．苏木精染色后用自来水冲洗(稍洗)；8．冲洗后用1%盐酸酒精（99毫升70%酒精+1毫升浓HCl）镜检分化，操作时可以按先浸10S后用自来水稍冲洗，吸水纸吸掉水珠后镜检，若观察到细胞质部分染色很浅而核仍较深则自来水冲洗约15分钟（时间可为几分钟至1小时不等，以充分洗掉HCl），否则分化不全时则继续学浸于盐酸酒精中至20S、30S等直至达到满意染色。
9．冲洗后判断染色，浸入1%氨水酒精（99毫升70%酒精+1毫升浓氨水）迅速（约几s至半分钟不等，不同的组织情况不同，需进行摸索）取出用蒸馏水冲洗后于蒸馏水Ⅰ(3min) →蒸馏水Ⅱ(3min)；10．甩干水分，1%伊红(水溶性伊红Y 1g溶于100毫升85%酒精)染色约3min，若着色困难可在每100毫升染液中加入1～2滴冰醋酸，使易着色且不易脱色；11．70%酒精稍冲洗切片将伊红洗掉，之后则梯度乙醇浸洗（脱水作用）：70%酒精(1 min) →80%酒精(1min) →90%酒精(3min) →95%酒精(2min) （此段时间应尽量缩短，因伊红易在95%酒精中脱色）→无水酒精Ⅰ(5min) →无水酒精Ⅱ(5min) ；12．1/2二甲苯+1/2酒精(5min) →二甲苯Ⅰ(5min) →二甲苯Ⅱ(15min)；13．将染色完成的切片取出，确保二甲苯未干燥，迅速用移液枪吸取树胶滴在组织上，盖上盖玻片，待凝固后观察结果。
