土壤微生物的分离-课件

（2）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。
（二）稀释涂布平板法 • 3.涂布
将每种培养基的一个平板底面分别用记号笔写上10-3、
10-4、和10-5 ，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、和10-5 三 管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入平板中央，用无菌玻 璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（三）培养
做好标记后，高氏I号和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养 3~5d，牛肉膏蛋白胨平板置37 ℃温室中培养2~3d。
（四） 挑菌落
菌苔长出后，检查特征是否一致，用显微镜检查是否为单一微生物， 若发现有杂菌，需要进一步分离、纯化，挑取单个菌落接种到斜面上。
（五） 计数
•
•
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是 极其丰富的，因此土壤是发掘微生物资源的重要基地。
三、器材
• 1.培养基
牛肉膏蛋白胨培养基 马丁氏培养基 高氏1号培养基
• 2.溶液或试剂
盛4.5ml无菌水的试管 盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶
• 3.仪器和用具
无菌玻璃涂棒 无菌吸管 无菌培养皿 土样
• 2.倒平板
将三种培养基加热溶化，待冷至55~60℃时，马丁 氏培养基中加入链霉素溶液（终浓度为30μg/ml），混均 匀后分别倒平板，每种培养基倒4皿。
（一）平板划线法
• 3.划线
左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-2的土壤悬液一环在平 板上划线。
两种划线方法：
（1）不连续划线:先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4次， 再转动培养皿，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线 部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三 次划线和通过第三次部.制备土壤稀释液

• 实验目的：
1、学会倒平板 2、了解土壤中微生物分离方法 3、学会稀释涂布平板计数法对微生物计数
微生物的分离及稀释平板法计数
（1）倾注平板法 (混合平板法)
（2）涂布平板法
稀释到适量浓度
倾注或涂布平板
培养
菌落计数
实验安排
• 10-710-610-5 稀释度为细菌培养,肉汤蛋白胨 培养基
• 10-5
• 10-510-410-3 稀释度为真菌培养,马丁氏培养 基
每个梯度3个平行，所以每种菌需要9块平板, 注意标记
• 培养 将细菌、真菌、放线菌培养基倒置于28度培养箱 中培养3-5d；统计所长出的菌落数；
• 挑菌（纯化） 将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进 行观察，分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离， 培养，检查菌落是否一致、单纯（也可以用显微镜 涂片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需 进一步纯化、分离。
一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示原 样品中的细胞数。
三、作业
• 利用涂布平板法对土壤样品进行活菌计数
菌落计数 ：
稀
10-4
释
度
10-5
10-6
平板中的 细 1 2 3 平 1 2 3 平 1 2 3 平
CFU数 菌
均
均
均
放 线 菌
真 菌
• 每克含菌样品中细菌/放线菌/真菌 活细胞数＝ （同一稀释度平板上菌落平均数× 10×稀释倍数× 10 ） 含菌样品克数

❖ 每克土壤含有多于109个微生物（Torscik et al.， 1990）。
❖ 虽然微生物本身仅占土壤有机质的很小部分，但它 是活着的有机体和物质转化的作用（Stevenson， 1986），有机质转化所需能量的95%以上来自微生 物的分解作用
目前已定种的微生物只有大约15万种，远较 动植物为少，但一般认为目前为人类所发现的微生 物还不到自然界中微生物总数的1%
5/1 6/1 10/1
11/1 23/1 9/1
第三节 土壤腐殖物质的形成和性质
２、化学组成
我国主要土壤腐殖酸的元素组成
元素（%） HA FA
C 50-60 45-53
H 3.1-5.3 4.0-4.8
O+S 31-41 40-48
N 3.0-5.6 2.5-4.3
习惯上以58%为其平均值，故计算有机质的含 量时，一般以1.724为折算系数。
微生物 动物来源 植物来源 工农业副产品
土壤有机质 5%
0.5%
0.5-2.0% 7%
第二节 土壤有机质的分解和转化
一、矿化过程与腐殖化过程
1、矿化作用(Mineralization)*** 土壤有机质在土壤微生物及其酶的作用下，分解成
二氧化碳和水，并释放出其中的矿质养分的过程。
酶 R—（C，4H，养分）+ 2O2
的养料和能量释放很少，对植物生长不利。
二、影响有机物质的分解和转化的因素：
（一）土壤生物的组成与活性 土壤动物促进植物残体的破碎和运输 真菌可促进木质素的分解 细菌和放线菌可促进碳水化合物的分解
（二）土壤特性
1、质地 粘粒含量越高，有机质含量也越高。
2、pH值 中性、钙质丰富较好，pH6.5-7.5。

三、实验器材
1、土壤样品（自带） 2、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基），牛 肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。 3、溶液和试剂：10％酚，链霉素，盛9ml无菌水的试 管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。 4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌 培养皿等。
四、操作步骤
五、实验报告
１、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材P34表II-5） ２、你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落？如果不 是，请分析其原因。 ３、在３种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简 述它们的菌落形态特征。
六、思考题
1、如何确定平板上单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。 2、如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样，分离培养基有何 特点？说明理由。 3、怎样判断稀释涂布平板计数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？ 4、为什么高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉 素？如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细 菌，你认为应如何做？ 5、某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-2种可行 的检测方法。
2、稀释土样
制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠 的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用 一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中， 吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取 1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、103、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、 酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以 说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”因此，土壤是 微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从 中分离、纯生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征 等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征 （产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等） 鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过 程称为微生物的分离与纯化。

微生物学实验
——土壤中微生物的分离纯 化、培养观察及保藏
实验流程
土 壤 分样 离品 纯中 化微 生 物 的
细菌 酵母菌 放线菌 霉菌
形态结构观察
生理生化反应
nisin效价测定
生长曲线测定
菌
种
形态观察
保
直接计数
藏
死活细胞鉴定
形态结构观察
土壤中微生物的分离、纯化 和培养
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后 者在强碱环境下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二 乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+） 反应。
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 1
细菌细胞的生理生化反应
吲哚实验- 2
细菌细胞的生理生化反应
其基本原理是选择适合于微生物生长的培养条件如营养成分酸碱度温度和氧等或加入某种抑制剂在平板上培养微生物当平板上长出单菌落后挑取得到纯种的微生物土壤中微生物的分离纯化培养观察及保藏试剂与器材1材料含大肠杆菌枯草芽孢杆菌乳酸乳球菌黑曲霉根霉青霉和放线菌的土壤样品牛肉膏蛋白胨培养基斜面液体半固体马丁氏培养基查氏培养基等2试剂10酚4水琼脂3器材盛9ml无菌水的试管盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶涂布器无菌吸管接种环酒精灯无菌培养皿显微镜细胞计数板等
细菌的革兰氏染色
试剂与器材
1、材料
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。
2、试剂
结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红等。
3、器材
显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内 装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水等。
Procedures of Gram Staining

3 实验分析。比较涂布平板法和稀释倒平板法两种操作方法 的结果？作为初学者更适合用什么方法？实验操作中存在 什么问题，应如何改进？
3 材料与方法
3.1 实验器材
3.1.1 土壤样品：按无菌操作要求有目的地取某一类型的土壤。 3.1.2 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，高氏一号培养基，马铃
薯培养基（上次实验成果） 3.1.3 无菌生理盐水。 3.1.4 其它物品： 无菌培养皿，无菌吸管，洗耳球，无菌玻
璃涂棒，无菌报纸，药勺，10％酚溶液。
实验二 从土壤中分离和纯化微生物
1 实验目的
1.1 掌握涂布平板法、稀释倒平板法、划线分离法分离微生物 的操作技术；
1.2 掌握微生物样品稀释法。 1.3 初步掌握无菌操作技术和平板菌落计数法。
2 实验原理
2.1 什么是微生物的纯培养,从固体培养基中分离微生物的方 法有哪些?
2.2 为什么可以根据菌落数目来计算样品中微生物的数量?
3.2 方法（A.稀释涂布平板法）
3.2.1 制备土壤稀释液
依次0.5mL，注意更换枪尖 振荡20 min
各管4.5mL无菌水 10-4、10-5、10-6；各平板0.1mL 取土壤过程中怎样减少杂菌污染?
三角烧瓶中为什么要加玻璃珠?
3.2.2 倒平板 将培养基加热熔化，冷至55－60℃，(在高氏1号培养基中加入 10%酚数滴)，(在马铃薯培养基中加入链霉素溶液至终浓度为 30ug/mL，)混匀后倒入平板。
（操作方法，教师示范）
每平板12 mL
3.2.3 涂布 标记浓度 取菌液 0.1mL
玻璃涂棒灭菌
涂布
静置5－10min
3.2.3 培养 细菌
37℃培养箱
倒置培养24-48h

实验结果
➢ 详细描述实验中各种微生物在斜面上、半固体和液体 培养基中的培养特征。
思考题
➢ 一个好氧的具周生鞭毛的菌株分别在斜面、半固体和 液体培养基中的培养特征。
➢ 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划 多条线或蛇形，而只要划一条直线？
➢ 接种环（针）接种前后灼烧的目的是什么？为什么在 接种前一定要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已 冷却？
法和步骤； ➢ 掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方
法。
培养基的种类
➢ 按成分不同分 天然培养基 合成培养基 半合成培养基
➢ 按培养基的物理状态分 固体培养基 半固体培养基 液体培养基
➢ 按培养基的用途分 基础培养基 营养培养基 鉴别培养基 选择培养基
培养基的配制方法和步骤
➢ 称量：按照配方正确称取各种原料置于搪瓷杯中； ➢ 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，补足水
（使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存 在），再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培 养皿中特定的选择性培养基内，最后根据在平板上长 出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。
实验器材 ➢ 土壤稀释液的三种不同培养基的培养平板 ➢ 菌种：大肠杆菌菌悬液 ➢ 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 ➢ 仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有
灭菌
干热灭菌 ➢ 火焰灼烧法 ➢ 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法） 湿热灭菌法 ➢ 加压蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌
火焰灼烧法
直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小 工具等的灭菌。
干热灭菌法
设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时 注意事项：

详细描述
化学分离法是一种通过化学试剂与土壤中的物质发生反应，使微生物与土壤颗粒分离的方法。该方法利用酸、碱、 盐等化学试剂与土壤中的物质发生反应，改变土壤的理化性质，使微生物与土壤颗粒分离，然后收集微生物并进 行培养。
04 土壤中微生物分离的实验 步骤
样品采集
01
02
03
采样点选择
选择具有代表性的土壤样 品，如不同区域、不同土 壤类型的土壤。
在分离过程中，选择合适的培养基和培养条件是关键， 这直接影响到分离的效果和后续的研究结果。
01Leabharlann 03土壤中微生物的分离还可以应用于微生物资源开发， 如发现新的微生物资源、开发微生物农药和生物肥料
等，为农业生产提供新的解决方案。
04
分离得到的微生物可以用于研究土壤微生物的多样性、 群落结构、功能和相互作用等方面，有助于深入了解 土壤生态系统的运行机制。
真菌
真菌是土壤中重要的分解者之一， 能够分解有机物和木质素等难分
解物质。
真菌的菌丝体能够深入到土壤中， 吸收养分并将其传递给植物根系。
真菌在土壤中的数量和种类也会 受到土壤类型、气候、植物等因
素的影响。
藻类
藻类是光合自养生物，在土壤 表面的水膜中生长，可以通过 光合作用产生氧气。
藻类的生长会受到光照、温度、 水分等因素的影响，在适宜的 条件下可以大量繁殖。
研究展望
01
02
03
04
随着分子生物学技术的发展， 未来可以采用高通量测序等 技术对土壤微生物进行更全 面、深入的研究，进一步揭 示土壤微生物的多样性和功
能。
土壤微生物与其他环境因素 之间的相互作用也是未来研 究的重点，如气候变化、土 地利用方式等对土壤微生物

它们在土壤中的功能多样，包 括分解有机物、固氮、促进植 物生长等。
细菌的种类繁多，包括革兰氏 阳性菌、革兰氏阴性菌、芽孢 杆菌等。
真菌
真菌在土壤中的数量相对较少， 但它们在土壤生态系统中的作用
非常重要。
真菌主要通过分解有机物来获取 营养，同时它们也与植物形成共 生关系，帮助植物吸收水分和养
分。
常见的土壤真菌包括霉菌、酵母 菌和蘑菇等。
土壤微生物的生理功能
物质循环与转化
碳循环
氮循环
微生物通过呼吸作用将土壤中的有机碳转化 为二氧化碳，同时也可以通过光合作用将二 氧化碳固定为有机碳。
微生物参与土壤中的氮素转化，包括氨化作 用、硝化作用、反硝化作用等，实现氮素在 土壤中的循环和利用。
磷循环
硫循环
微生物通过分解含磷有机物和矿化作用，将 土壤中的磷素释放出来，供植物吸收利用。
促进植物生长的微生物
氮固定菌
将大气中的氮气转化为植物可利用的 氨态氮，如根瘤菌与豆科植物共生， 固定空气中的氮气。
磷细菌
分解含磷化合物，使土壤中的磷元素 转化为植物可吸收的状态。
钾细菌
分解含钾矿物，释放出钾元素供植物 吸收。
有益真菌
如菌根真菌，与植物根系形成共生体， 增加植物对水分和养分的吸收能力。
微生物生态学技术
荧光原位杂交技术（FISH）
利用特异性荧光标记的寡核苷酸探针与土壤微生物细胞内的靶序列进行杂交，通过荧光显微 镜观察杂交信号，可以对土壤微生物进行原位鉴定和定位。
稳定同位素探针技术（SIP）
利用稳定性同位素标记的底物喂养土壤微生物，通过追踪同位素标记物在微生物体内的转化 和分布，可以了解土壤微生物对特定底物的利用情况和代谢途径。

技术瓶颈限制
高效筛选、培养及应用技术尚不成熟，影响微生物资源的有效利用。
生态环境风险
不当的微生物利用可能引发新的生态问题，如生物入侵、基因污染 等。
未来发展趋势及展望
加强微生物资源调查与保护
发展高效筛选与培养技术
建立完善的土壤微生物资源库，保护珍稀濒 危微生物物种。
利用组学技术、高通量筛选等手段，提高目 标微生物的获得效率。
确定微生物的种类。
生理生化特征分析
综合生理指标和生化反应试验结 果，对微生物进行更准确的分类
和鉴定。
分子生物学鉴定法
基因序列分析
01
通过测定微生物的基因序列，与已知数据库进行比对，确定其
种类和遗传特点。
PCR扩增技术
02
利用PCR技术扩增微生物的特定基因片段，提高检测灵敏度和
准确性。
分子生物学特征分析
拓展微生物在农业与环境领域的应用
加强国际合作与交流
开发新型微生物肥料、生物农药、土壤修复 剂等，促进农业可持续发展及生态环境保护。
共享微生物资源与技术成果，推动全球土壤 微生物研究与应用的发展。
THANKS
硫循环
微生物参与硫元素的氧化还原反应，影 响土壤中硫的形态和有效性。
微量元素循环
微生物对铁、锰、铜、锌等微量元素的 转化和有效性也有显著影响。
土壤微生物与土壤结构的关系
03
微生物与土壤团聚体的形成
微生物通过分泌多糖等胶结物质，促进土 壤颗粒的团聚，形成良好的土壤结构。
微生物与土壤孔隙的关系
微生物活动产生的气体和分泌物有助于土 壤孔隙的形成和保持，影响土壤的通气性 和透水性。
土壤微生物PPT课件
目录
• 土壤微生物概述 • 土壤微生物与土壤肥力 • 土壤微生物的培养与分离技术 • 土壤微生物的鉴定与分类方法 • 土壤微生物的应用前景与挑战