基因敲除⼩⿏的PCR鉴定基因敲除⼩⿏的 PCR 鉴定⼀、实验⽬的：通过PCR T增程序及琼脂糖凝胶电泳⽅法鉴定凝⾎因⼦IX基因敲除⼩⿏的基因型。
⼆、实验原理：真核⽣物的⼀切有核细胞（包括培养细胞）都能⽤来制备基因DNA真核⽣物的DNA是以染⾊体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋⽩质、脂类和糖类等分离，⼜要保持DNA分⼦的完整。
提取DNA勺⼀般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（⼗⼆烷基硫酸钠）和蛋⽩酶K的溶液中消化分解蛋⽩质，再⽤酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋⽩质，得到的DNA溶液经⼄醇沉淀使DNA从溶液中析出。
1.PCR原理：PCF技术的基本原理类似于DNA勺天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCF由变性-退⽕-延伸三个基本反应步骤构成：1）模板DNA的变性：模板DNA S加热⾄93C左右⼀定时间后，使模板DNA双链或经PCF T增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2）模板DNA与引物的退⽕（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降⾄55C 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3）引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作⽤下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成⼀条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退⽕-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，⽽且这种新链⼜可成为下次循环的模板。
每完成⼀个循环需2?4分钟，2?3⼩时就能将待扩⽬的基因扩增放⼤⼏百万倍2.琼脂糖凝胶电泳原理：在pH8.0~8.3 的缓冲液中，核酸分⼦带负电荷，向正极移动。
由于不同⼤⼩和构象的核酸分⼦电荷密度⼤致相同，因此在⾃由泳动时，各种核酸分⼦的迁移率相似，⽆法分开。
然⽽，在浓度适当的凝胶中，由于分⼦筛效应，使⼤⼩和构象不同的核酸迁移率出现差异，从⽽把它们分开。
转基因小鼠的鉴定一、剪鼠尾1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周耳朵已经长开时剪鼠尾较好,此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强;2.分辨小鼠的年龄a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时,此小鼠当天出生或前一晚出生；b当小鼠腹部有奶腹部有一小团白色物质,此小鼠出生2~3天；c当小鼠背部长出皮毛时,此小鼠出生3~4天；d当小鼠毛长全,但眼未开时,此小鼠出生10天左右；e当小鼠眼刚开,耳未开时,此小鼠出生12天左右；f当小鼠耳刚开时,此小鼠出生14天左右;3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法二、从鼠尾中提取DNA采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒康为世纪：cw2094提取DNA,操作如下：1.剪取小鼠长度为的尾巴,放入灭菌后的离心管中,加入180μL Buffer GTT;震荡混匀;2.加入20μL proteinase K,涡旋震荡,彻底混匀;3.置于56℃水浴,直到组织溶液完全清澈,一般需消化6-8h,赋予过程中涡旋震荡,使样品均匀分离;注意：1 如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质,必要时过夜消化再加入20μl proteinaseK消化,不会影响后续操作;2 如需去除RNA,可在上述步骤完成后,加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液,震荡混匀,室温放置5-10min;4.14000rpm 离心 1min,以消除未消化的类似于鼠毛等组织,将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中;5.加入200μl Buffer GL,涡旋震荡,充分混匀,加入200μl 无水乙醇,涡旋振荡,充分混匀,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底;注意：1加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀;2 如果多个样品一起操作,Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品;3加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀,不会影响后续操作;6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中,若以此不能加完溶液,可分多次转入;10000rpm 离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1使用前检查是否已加无水乙醇,10000 rpm 离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2使用前检查是否已加无水乙醇,10000 rpm 离心 1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;如需进一步提高DNA纯度,可重复步骤8;9.12000rpm 离心 2min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾干;注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除,乙醇的残留会影响后续的酶促反应酶切,PCR等;10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中,向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水,室温放置2-5min,10000rpm 离心 1min,收集DNA溶液,-20℃保存DNA;注意：1如果下游实验对PH值或EDTA敏感,可以用灭菌水洗脱,洗脱液的PH值对洗脱效率有很大影响,若用水作洗脱液应保证其PH值在直接,PH值低于时洗脱效率不高;2离心前室温孵育5min可增加产量;3用另外的50-200μL Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量;4如果需要提高DNA的终浓度,可以将步骤10所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上,重复步骤10；若洗脱体积小于200μL,可以增加DNA的终浓度,但可能会减少总产量;三、PCRPCR程序设定：1＝ 94.0℃ for 5:00 2＝ 94.0℃ for 1:00 3＝ 59.0℃ for 0:50 4＝ 72.0℃ for 1:00 5＝ Goto 2 2times6＝ 94℃ for0:507＝ 58℃ for 0:508＝72℃ for 1:009＝Goto 6 2times10＝ 94.0℃ for 0:50 11＝56.0℃ for 0:50 12＝ 72.0℃ for 1:00 13＝ Goto10 32times 14＝ 72.0℃ for 10:00 15＝ 4.0℃ for 5:00 16＝END目前实验室的双转基因小鼠AD体系采用：PCR反应的体系12μl：APPPrimer APP-1 μlPrimer APP-2 μlO 2μlddH2mixCW0682 6μlDNA 1μlPCR反应的体系12μl：PS1Primer PS1-1 μlPrimer PS1-2 μl内参-1 1μl内参-2 1μlmixCW06826μlDNA 1μl先在的EP管中加入总的体系再平均分装入各个PCR管中一般多加两小管的量,将移液器调到总量的1/3到1/2体积在EP管中缓慢抽吸若干次尽量避免产生气泡以便Taq酶混合均匀,最后再在各PCR管中依次加入DNA样品;引物处理方法：引物在安基生物有限公司合成后,EP管上会有标记,一般为x nmol,使用O,涡旋振动混匀,微型离心机离心,即可得前先用12000rpm 离心 1min,加入10x μl ddH2O稀释10倍,即加入90μl,混匀后即可得到到100μM的母液,取10μl 的母液,用ddH210μM的引物工作液;四、电泳1．配胶：鉴定用的胶板有大、中、小3种,分别用的梳子为50、25、11齿;分别用的TBE的量为90ml、45ml、25ml;用%的琼脂糖凝胶;2．点样：12μl的DNA,Marker加5μl;点样时注意逐个点样,不要点错,最好把中间的那个孔留着点Marker,这样可避免点样的出错;Marker的选择依基因片段大小而定;3．跑电泳：打开电源,150v电压,30min左右即可;4．照胶：看是否有目的条带,即可判断对应小鼠是阳性、阴性或是杂合子;5．保存;。
基因敲除小鼠的PCR鉴定一、实验目的,通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。
二、实验原理,真核生物的一切有核细胞,包括培养细胞,都能用来制备基因DNA。
真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS,十二烷基硫酸钠,和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
1.PCR原理,PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成, 1) 模板DNA 的变性,模板DNA经加热至93?左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备,2) 模板DNA与引物的退火(复性),模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55?左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合,3) 引物的延伸,DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2,4分钟,2,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍2.琼脂糖凝胶电泳原理,在pH8.0~8.3的缓冲液中,核酸分子带负电荷,向正极移动。
由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同,因此在自由泳动时,各种核酸分子的迁移率相似,无法分开。
然而,在浓度适当的凝胶中,由于分子筛效应,使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异,从而把它们分开。
核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度,与分子的碱基组成及电泳温度,4~30?之间,无明显关系。
碱法提取小鼠总DNA及基因鉴定：一、实验器材：加样枪（1ml、200ul、20ul、10ul）、枪头（大中小一套）、EP管（20ul、1.5ml、10ml）、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒二、实验试剂：A液、B液、引物、mix、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、TBE（5x、1x、回收液）、核苷酸染料、Marker三、母液配置：1.10M NaOH: NaOH 40g加双蒸水至90ml，待NaOH完全溶解冷却后定容至100ml2.0.5M EDTA：EDTA.Na2盐18.61g, NaOH 1.5g, 加双蒸水至80ml,逐滴加入10M NaOH至EDTA完全溶解后加双蒸水定容至100ml3.1M TrisHCl（pH8.0）：Tris碱12.1g，加水至70ml，边搅拌边加入浓盐酸4ml，然后边逐滴加入1M HCl边测PH值，直至PH升至8.0（+\-0.05），定容至100ml（pH=8.8的TrisHCl中边加入浓盐酸边测PH值至PH=8.0（+\-0.05）为止）四、实验步骤：1.剪取鼠尾（约芝麻大小）储存于-20度冰箱（-20度冰箱，主要是防止DNA降解，4度不行）2.提取DNA：1)配置工作液——20ml体系A液：50ul 10M NaOH 加双蒸水至20ml8ul 0.5M EDTAB液：800ul 1M TrisHCl（pH8.0）加双蒸水至20ml2)加150ulA液（液体应完全浸没标本），95度水浴锅煮1.5h（将EP管插入浮标中后用胶布缠好防止EP管在加热过程中爆开）3)加150ulB液，混匀（上下颠倒3-5下）4)12000r/min 4度离心5分钟（可储存于-20度冰箱）3.PCR（冰上操作）：P1 0.5ul（P为AC3I，G为AAA）1)配置PCR体系——15ul体系P2 0.5ulMix 7.5ul三蒸水4.5ulDNA 2ul2)加2ul上述离心后的上清液至PCR体系，瞬离3)PCR仪扩增，参数设定：预变性：94度——3min变性：94度——30s退火：55度——30s 30个循环延伸：72度——24s72度——5min4度——∞4.琼脂糖凝胶电泳：1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方：总体积（ml）20 30 40 50 60 120琼脂糖（g）0.4 0.6 0.8 1 1.2 2.4TBE 1x（ml）20 30 40 50 60 120Tris-base 13.6gTBE 5x配方：硼酸 6.56gEDTA 0.73g双蒸水up to 250mlEg：50孔大胶的配置：琼脂糖2.4g 微波炉加热5min左右冷却至适温后加染料7.5ulTBE 1x 150ml（需考虑蒸发量）2)加样——Marker 0.5ul，样品8ul（加样前吹打2次，从右向左加样）3)电泳——150V，300mA，20min（加样孔在近负极侧）5.成像分析：Image lab 新建核酸凝胶（第一项）最后一项滤光片拨至中间放置凝胶运行保存图像编辑拍照保存6.结果及分析：1)AAA分子量为700+？2)AC3I分子量为400+？3)AAA型——只出现AAA一条带AC3I型——只出现AC3I一条带双阳型——两条带都出现野生型——AAA型老鼠没出现AAA条带或AC3I型老鼠没出现AC3I条带或双阳型两条带均未出现4)出现浅带的原因？判定为阴性还是阳性？我觉得阴性更多。
