在发酵工业中,为何常受噬菌体的危害,如何防治

噬菌体的污染和防治在许多发酵生产中，如氨基酸发酵、丙酮-丁醇发酵和抗生素发酵中常常遇到噬菌体〔bacteriaphage〕污染，引起溶菌，并随之出现发酵缓慢或停止发酵等异常现象。

本节主要介绍噬菌体污染的特征，检查方法及防治措施。

一噬菌体污染的特征1 发酵液光密度上升缓慢，甚至下降，肉眼可见发酵液逐渐变清；2 耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少或不增加，发酵液中残糖高；3产生大量泡末，发酵液呈粘稠状；4 菌体不规则，甚至出现畸形。

二噬菌体的检查方法1．双层琼脂平板法〔1〕双层琼脂平板的制备：先用7~8mL 2%的琼脂培养基作底层，凝固后，参加3~4mL 冷至45℃的1%琼脂上层培养基〔其中含0.2mL发酵菌种悬液和0. 1mL待检发酵液〕，让其平坦凝固；〔2〕在发酵菌的适宜温度下培养，假设是细菌，一般培养16~20小时。

〔3〕检查有无透明的噬菌斑。

2．液体培养检查法将培养基、发酵菌种及待检发酵液三者混合，培养后观察培养液是否变清。

3．斑点试验法先制备好涂布有发酵菌种的平板，再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种，培养后，观察是否有噬菌斑。

4．玻片快速法将发酵菌种、发酵液和少量琼脂培养基〔含0.5~0.8%的琼脂〕混匀后涂布于无菌载玻片上，经短期培养后，在低倍镜下观察是否有噬菌斑。

三噬菌体的防治发酵液中污染噬菌体，不外乎有两种原因。

1 菌种本身带噬菌体，特别是溶源性噬菌体，对这种菌种，一经发觉，应马上弃去。

2 生产的环境中有噬菌体。

因此，可采取相应的预防措施：1 决不使用可疑菌种；2 去除周围环境中存在的噬菌体。

能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，搞好清洁卫生工作；3 选育抗噬菌体菌株4 轮换使用菌株。

因为一个菌株用的时间一长，就有可能出现该菌种的噬菌体。

5 注意通气质量。

取风口应设在30~40米的高空，空气过滤器要保证质量；四发酵液污染噬菌体后的抢救措施如果一旦发觉噬菌体污染，应及时采取补救措施1．假设在发酵前期污染了噬菌体，因为此时耗糖还不多，常用以下措施〔1〕补加抗性种子，并依据发酵液中的营养多少，适当补加营养物质；〔2〕补加约50%的已培养至对数期的正常的发酵液，再进行发酵；〔3〕假设噬菌体轻度污染，菌体仍能较正常地生长，并累积代谢产物，则可照常进行发酵，假设污染严峻，则用加热法〔70~80℃〕灭活噬菌体，放罐后重消毒。

学生综述性论文题目：发酵过程中染菌的分析、检测及预防姓名：刘莉学号：2008132114专业：生物技术班级：083班课程名称：微生物工程指导教师：燕平梅课程学期：2010至2011学年第一学期发酵过程中染菌的分析、检测及预防姓名：刘莉指导老师：燕平梅（太原师范学院生物系083班学号：2008132114）摘要：通过分析发酵过程中染菌的各种原因，总结检测染菌的方法，并提出染菌后应采取哪些措施及预防染菌的方法。

关键词：发酵；染菌；危害；检查；预防前言：发酵工业生产中，污染杂菌造成发酵失败的事故时常发生，严重影响发酵生产，关于发酵过程是否污染杂菌，如何检测，染了菌后如何处理等等，这些问题的研究是十分有意义的。

内容：1发酵染菌的危害1.1不同种类的杂菌对发酵的影响青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大1.2不同染菌时间对发酵的影响1.2.1种子培养期染菌菌体浓度低、培养基营养丰富1.2.2发酵前期染菌杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成1.2.3发酵中期染菌严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成1.2.4发酵后期染菌如杂菌量不大，可继续发酵。

如污染严重，可采取措施提前放罐1.3不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大1.4染菌对产物提取和产品质量的影响1.4.1对过滤的影响发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。

造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。

噬菌体与发酵工业噬菌体对实践的关系主要体现在对发酵工业的危害上。

当发酵液受噬菌体严重污染时，会出现：①发酵周期明显延长；②碳源消耗缓慢；③发酵液变清，镜检时，有大量异常菌体出现；④发酵产物的形成缓慢或根本不形成；⑤用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；⑥用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。

当出现以上现象时，轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。

这种情况在谷氨酸发酵、细菌淀粉酶或蛋白酶发酵、丙酮丁醇发酵以及各种抗生素发酵中是司空见惯的，应严加防范。

要防治噬菌体的危害，首先是提高有关工作人员的思想认识，建立“防重于治”的观念。

预防噬菌体污染的措施主要有：（1）决不使用可疑菌种认真检查斜面、摇瓶及种子罐所使用的菌种，坚决废弃任何可疑菌种。

（2）严格保持环境卫生。

（3）决不排放或随便丢弃活菌液环境中存在活菌，就意味着存在噬菌体赖以增殖的大量宿主，其后果将是极其严重的。

为此，摇瓶菌液、种子液、检验液和发酵后的菌液绝对不能随便丢弃或排放；正常发酵液或污染噬菌体后的发酵液均应严格灭菌后才能排放；发酵罐的排气或逃液均须经消毒、灭菌后才能排放。

（4）注意通气质量空气过滤器要保证质量并经常进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在30～40米高空。

（5）加强管道及发酵罐的灭菌。

（6）不断筛选抗性菌种，并经常轮换生产菌种。

（7）严格执行会客制度。

如果预防不成，一旦发现噬菌体污染时，要及时采取合理措施。

例如，①尽快提取产品，如果发现污染时发酵液中的代谢产物含量已较高，即应及时提取或补加营养并接种抗噬菌体菌种后再继续发酵，以挽回损失；②使用药物抑制，目前防治噬菌体污染的药物还很有限，在谷氨酸发酵中，加入某些金属螯合剂（如0.3～0.5％草酸盐、柠檬酸铵）可抑制噬菌体的吸附和侵入；加入1～2μg／ml 金霉素、四环素或氯霉素等抗生素或0.1～0.2％的“吐温60”、“吐温20”或聚氧乙烯烷基醚等表面活性剂均可抑制噬菌体的增殖或吸附；③及时改用抗噬菌体生产菌株。

氨基酸发酵生产噬菌体的防治噬菌体是病毒的一种, 是一种极微小的生物, 体积是细菌的1/1000左右, 它可以通过细菌过滤器, 只有在电子显微镜下才能看到.氨基酸生产菌的噬菌体, 一般在25~35℃、pH5～9时较为稳定,但易受热变性(60～70℃,10～15min),对氧化物敏感,可被酸碱致死.此外,凡能引起蛋白质变性的化学药品(如0.5%甲醛、1%新洁尔灭、0.5%苯酚或漂白粉等)都可使噬菌体失活.需要值得注意的是:噬菌体在干燥状态比湿润状态稳定, 能长时间(有的可达半年以上)以活性状态浮游于空气中, 这是氨基酸发酵生产受噬菌体污染的一个重要原因.噬菌体的防止是一项系统工程, 从原料与原辅材料、消毒灭菌、种子检查、空气净化系统、严格活菌体排放、环境卫生、设备管路有无死角、车间布局及职工责任心等诸多方面,都必须分段检查把关,才能做到根治噬菌体的危害.1.严格活菌体排放,切断噬菌的“粮源”：噬菌体是专一性的活菌寄生体,具有严格的寄生范围.噬菌体没有细胞结构,缺乏独立代谢的酶体系,不能脱离寄主而自行生长繁殖.噬菌体只能在活的、正处于生长繁殖阶段的细胞中进行繁殖,而在死的、老的或休眠状态的细胞中以及代谢产物上都不能繁殖.因此,如果我们能够不让活的氨基酸(丝氨酸)生产菌在环境中生长蔓延, 也就切断了噬菌体的食物来源, 破坏了噬菌体的滋生场地和繁殖条件.(1) 摇瓶液、测样后废液、洗罐后所废弃的菌体、种子及带菌器皿洗涤水等,应集中起来灭菌后再俳放,严防不加任何处理的随意排放,以杜绝隐患.(2) 取样液、试验后的废弃菌液或发酵液,要密闭、集中起来,灭菌后再经管道或阴沟向远处排放.切忌取样时连个接的桶也没有,菌液四处飞溅,污染环境.(3) 排气、发酵跑液要经管道集中于楼外的密闭水封池中,或通入贮有药剂的容器设备中经灭菌后通过管道或密闭阴沟向远处排放(与空压车间相反的方向和下风方向送出100~200米远后再排放), 这一点很重要, 必须引起高度重视.(4) 噬菌体不耐热, 对甲醛敏感, 感染噬菌体的发酵罐或种子罐, 放罐前须加热至80~100℃,杀死噬菌体后再往远处排放或送往提取车间.放罐后, 空罐及各路管道消毒时加甲醛熏蒸. 有时还要煮罐, 用pH11~13稀碱液搅拌煮沸4~6小时, 消除死角后, 再用甲醛熏蒸.2.环境卫生, 消灭噬菌体与杂菌：噬菌体的最初来源, 一种是菌体本身带有噬菌体, 一种是生产环境的自然条件中存有噬菌体, 或由相近噬菌体经过变异而侵染. 因此, 采取以环境净化为中心的综合性防治方法, 建立工厂环境卫生制度, 消灭或减少环境中的噬菌体与杂菌, 清除噬菌体赖以生存的发展的条件, 是防止噬菌体的基本措施之一.(1)建立工厂环境卫生制度(以发酵车间为中心, 包括空压车间), 定期清扫, 定期消毒, 定期简查. 对车间四周有严重污染噬菌体的地点, 应及时利用药剂或其它方法处理.(2) 定期(每1~2周一次) 用消毒灭菌剂喷雾, 消灭空气中的噬菌体与杂菌. 如用次氯酸钙烟雾剂、新洁尔灭、漂白粉液或氯化苄叉毒芹稀释液喷雾等.喷雾地点除发酵车间室内外之外,也应包括空压机房内外及进风口周围等.(3)车间四周、角落及楼周围要保持清洁,定期清扫、冲刷,撒漂白粉或石灰等.(4)车间周围要尽量扩大混凝土地面,以利冲洗和消毒.并且,通往车间的路面应尽量采用水泥等光滑路面.3.严防噬菌体进入种子罐或发酵罐内：(1) 不使用本身带有噬菌体的菌种.种子纯化时, 应以确保不带噬菌体为选种的主要依据, 不能只看产酸高低. 经确认不是溶源菌的生产用菌, 要经常用双层琼脂平板检查, 保护生产用菌不受噬菌体感染.(2) 要经常性的对菌种进行平板分离, 挑选一定数量的单菌落传斜面进行培养, 而后进行摇瓶发酵初筛和复筛, 挑选没有被噬菌体污染且产酸较高的斜面单菌株制成安瓿管保藏. 并传子斜面作为母斜面准备上罐用. 并且,1~2月应再开一支安瓿管传斜面作为母斜面,之后传子斜面并摇瓶考察;或再次分离经摇瓶考察后传母斜面和子斜面准备上罐用.(3) 种子室与发酵车间分开、远离,使种子工作不处于有噬菌体和杂菌污染的环境中,以确保种子进行的第一环不染噬菌体.(4)严格无菌操作:①加强种子室灭菌、无菌操作及安全卫生措施.感染噬菌体的培养物不得带入无菌室、摇瓶间(因噬菌体可透过纱布棉塞飞扬),种子室应尽量减少与外界接触.②消灭设备死角.③认真进行培养液、发酵设备、空气净化系统及管路的灭菌工作.(5)较好的空气净化系统:高空采风(高20～40米、背向采风,并且上面有冒子,下面有放水阀)------预过滤(金属丝、玻璃纤维棉和无纺布三道粗滤)------空压机------管道加热(150℃以上)------保温管道输送------大贮气罐保温(100～200T罐)------冷却器------油水分离------冷冻水冷却------油水分离------去雾器------贮气罐------预热器(预热空气60～70℃)------总过滤器(二只并联、轮换使用,每10～15天蒸汽灭菌一次)------分过滤器(用一次灭菌一次)。

微生物课堂练习（一）一、选择题：1．细菌属于原核细胞型微生物的主要依据是A．以简单的二分裂方式繁殖B．染色体区没有核膜包绕，也无核仁C．单细胞、结构简单D．较其它生物小得多E．以上都不是2．质粒是细菌的A．核质DNAB．胞浆中的rRNAC．附加体D．胞浆颗粒E．核质外DNA（或称染色体外DNA）3．非细胞型微生物A．衣原体B．支原体C．立克次氏体D．放线菌E．病毒4．关于菌毛的叙述下列哪一项是错误的？A．多见于革兰氏阴性菌B．有普通菌毛和性菌毛两种C．不能用普通显微镜现察D．是细菌的运动器官E．普通菌毛与细菌的致病力有关5．细菌芽孢内能使芽孢中的酶类具有很高稳定性的特有物质是A．脂肪酸B．粘肽C．磷壁酸D．二氨基庚二酸E．吡啶二羧酸DPA-Ca6．用普通光学显微镜的油镜镜头观察细菌的总放大倍数常为A．100倍B．400倍C．600倍D．1000倍E．10000倍7．细菌的革兰氏染色不同是因为A．形态不同B．细胞壁结构不同C．营养需要不同D．致病性不同E．生理功能不同8．衣原体与细菌的不同点是A．有由肽聚糖组成的细胞壁B．严格的细胞内寄生C．以二分裂方式繁殖D．含有DNA和RNA两种核酸E．对抗生素敏感9．具有多种繁殖方式的微生物是A．衣原体B．螺旋体C．真菌D．细菌E．立克次氏体10．能独立生活的最小微生物是A．细菌B．支原体C．衣原体D．病毒E．立克次氏体11．细菌细胞壁的主要成分是A．脂蛋白B．肽聚糖C．几丁质D．胆固醇F．脂多糖12．关于革兰阴性菌细胞壁的叙述，下列哪项是正确的? A．肽聚糖含量多B．肽聚糖为三维立体结构C．含脂类少D．缺乏五肽交联桥E．有磷壁酸13．关于革兰阳性菌细胞壁的叙述，下列哪项是正确的? A．肽聚糖含量少B．肽聚搪为三维立体结构C．缺乏五肽交联桥D．含脂类较多E．有外膜14．细菌哪种结构的功能类似真核细胞的线粒体？A．核蛋白体B．中间体C．胞质颗粒D．质粒E．核质体15．关于荚膜的叙述，下列哪项是正确的?A．与细菌的致病力有关B．与细菌的分裂有关C．与细菌的运动有关D．与细菌的接合有关E．与细菌的染色有关16．鞭毛的主要作用是A．与细菌的抵抗力有关B．与细菌的分裂繁殖有关C．与细菌的运动有关D．与细菌的粘附有关E．与细菌的变异有关17．革兰阳性菌细胞壁与致病有关的化学组分是A．N—乙酰胞壁酸B．磷壁酸C．壁磷壁酸D．膜磷壁酸E．N—乙酰葡糖胺18．革兰阴性菌细胞壁与致病有关的组分是A．外膜B．脂多糖C．脂蛋白D．核心多糖E．特异性多糖19．革兰染色所用试剂的顺序是A．番红→碘液→酒精→结晶紫B．结晶紫→酒精→碘液→番红C．结晶紫→碘液→酒精→番红D．番红→酒精→结晶紫→碘液E．番红→结晶紫→碘液→酒精20．关于芽胞的叙述，下列哪项是错误的?A．芽胞的形态、大小、位置有助于细菌的鉴定B．一般在机体外细菌才能形成芽胞C．芽胞是所有细菌生活周期中的一种生命形式D．芽胞不是细菌的繁殖方式E．芽胞一旦污染周围环境，其传染性可保持多年21．在自然界，纤维素、半纤维素和木质素的主要分解者是：A．放线菌B．霉菌C．酵母菌D．细菌22．对青霉素不敏感的微生物是：A．支原体B．衣原体C．立克次氏体D．金黄色葡萄球菌23．酵母菌细胞壁是由特殊成分组成，其外层、中层、内层分别是：A．甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖B．葡聚糖、蛋白质、甘露聚糖C．几丁质、蛋白质、葡聚糖D．纤维素、甘露聚糖、葡聚糖二、填空题：1．酵母菌细胞内液泡可能起着__________贮存库的作用，同时还有________的功能。

微生物课堂练习（一）一、选择题：1．细菌属于原核细胞型微生物的主要依据是A．以简单的二分裂方式繁殖B．染色体区没有核膜包绕，也无核仁C．单细胞、结构简单D．较其它生物小得多E．以上都不是2．质粒是细菌的A．核质DNAB．胞浆中的rRNAC．附加体D．胞浆颗粒E．核质外DNA（或称染色体外DNA）3．非细胞型微生物A．衣原体B．支原体C．立克次氏体D．放线菌E．病毒4．关于菌毛的叙述下列哪一项是错误的？A．多见于革兰氏阴性菌B．有普通菌毛和性菌毛两种C．不能用普通显微镜现察D．是细菌的运动器官E．普通菌毛与细菌的致病力有关5．细菌芽孢内能使芽孢中的酶类具有很高稳定性的特有物质是A．脂肪酸B．粘肽C．磷壁酸D．二氨基庚二酸E．吡啶二羧酸DPA-Ca6．用普通光学显微镜的油镜镜头观察细菌的总放大倍数常为A．100倍B．400倍C．600倍D．1000倍E．10000倍7．细菌的革兰氏染色不同是因为A．形态不同B．细胞壁结构不同C．营养需要不同D．致病性不同E．生理功能不同8．衣原体与细菌的不同点是A．有由肽聚糖组成的细胞壁B．严格的细胞内寄生C．以二分裂方式繁殖D．含有DNA和RNA两种核酸E．对抗生素敏感9．具有多种繁殖方式的微生物是A．衣原体B．螺旋体C．真菌D．细菌E．立克次氏体10．能独立生活的最小微生物是A．细菌B．支原体C．衣原体D．病毒E．立克次氏体11．细菌细胞壁的主要成分是A．脂蛋白B．肽聚糖C．几丁质D．胆固醇F．脂多糖12．关于革兰阴性菌细胞壁的叙述，下列哪项是正确的? A．肽聚糖含量多B．肽聚糖为三维立体结构C．含脂类少D．缺乏五肽交联桥E．有磷壁酸13．关于革兰阳性菌细胞壁的叙述，下列哪项是正确的? A．肽聚糖含量少B．肽聚搪为三维立体结构C．缺乏五肽交联桥D．含脂类较多E．有外膜14．细菌哪种结构的功能类似真核细胞的线粒体？A．核蛋白体B．中间体C．胞质颗粒D．质粒E．核质体15．关于荚膜的叙述，下列哪项是正确的?A．与细菌的致病力有关B．与细菌的分裂有关C．与细菌的运动有关D．与细菌的接合有关E．与细菌的染色有关16．鞭毛的主要作用是A．与细菌的抵抗力有关B．与细菌的分裂繁殖有关C．与细菌的运动有关D．与细菌的粘附有关E．与细菌的变异有关17．革兰阳性菌细胞壁与致病有关的化学组分是A．N—乙酰胞壁酸B．磷壁酸C．壁磷壁酸D．膜磷壁酸E．N—乙酰葡糖胺18．革兰阴性菌细胞壁与致病有关的组分是A．外膜B．脂多糖C．脂蛋白D．核心多糖E．特异性多糖19．革兰染色所用试剂的顺序是A．番红→碘液→酒精→结晶紫B．结晶紫→酒精→碘液→番红C．结晶紫→碘液→酒精→番红D．番红→酒精→结晶紫→碘液E．番红→结晶紫→碘液→酒精20．关于芽胞的叙述，下列哪项是错误的?A．芽胞的形态、大小、位置有助于细菌的鉴定B．一般在机体外细菌才能形成芽胞C．芽胞是所有细菌生活周期中的一种生命形式D．芽胞不是细菌的繁殖方式E．芽胞一旦污染周围环境，其传染性可保持多年21．在自然界，纤维素、半纤维素和木质素的主要分解者是：A．放线菌B．霉菌C．酵母菌D．细菌22．对青霉素不敏感的微生物是：A．支原体B．衣原体C．立克次氏体D．金黄色葡萄球菌23．酵母菌细胞壁是由特殊成分组成，其外层、中层、内层分别是：A．甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖B．葡聚糖、蛋白质、甘露聚糖C．几丁质、蛋白质、葡聚糖D．纤维素、甘露聚糖、葡聚糖二、填空题：1．酵母菌细胞内液泡可能起着__________贮存库的作用，同时还有________的功能。

1、什么是缺壁细菌？试简述4 类缺壁细菌的形成、特点及实践意义。

2 、发酵工业为何常遭噬菌体的危害？如何检验、预防和治理它？3 、什么是EMB 意味着基？试述其主要成分、作用原理及实用价值。

4 、试列表比较低频转导（LFT ）和高频转导（HFT ）的异同。

5 、试图示并简介IgG 的构造。

6 、当今在国内市场上大量流行的“微生态中服液”主要含哪两类菌（写出其拉丁属名）？试从微生物学家的角度设计一项辩别其质量高低和真伪的实验方案。

7、何对一株细菌进行种属鉴定? 请写出主要鉴定内容.8 、画出抗体的结果模式简图，标明各个组成部分; 人体的抗体主要分为哪几种类型?9 、为什么在自然界清洁淡水水体中主要存在一些光能自养型和化能自养型微生物? 请用微生物生态学原理简单说明。

10 、画出T4 噬菌体的形态结构简图，标明各部分名称；简述其生物学特征。

11 、在微生物的培养过程中，如果要缩短其生长的延迟期，可以在菌种、培养基和其它方面采取哪些措施。

12 、画出大肠杆菌乳糖操纵子模型简图，标明各个部分，并简述各部分的功能。

13 、细菌荚膜依据其存在特点可分为几种类型? 分别简述其特点。

14 、写出固氮微生物的固氮反应式，简述固氮酶的结构组成和催化特点。

15 、详细说明原核微生物与真核微生物在细胞结构方面有何异同。

16 、什么叫做营养缺陷型菌株? 在实验室中如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株? 请设计一个具体实验方案。

17、述革兰氏阳性细菌和阴性细菌在细胞壁的结构和化学组成上的异同点，并指出与此相关的主要特性。

18、试从分子水平上探讨嗜热菌的嗜热机理，并列举二个极端嗜热菌的菌名。

19、用来测定细菌生长量的直接计数法和间接计数法包含哪些具体的方法？并从实际应用、优点、使用的局限性三个方面加以具体分析。

20、设计一个筛选酿酒酵母营养缺陷型的科研方案，并加以必要的说明（要求写出酿酒酵母的基本培养基和完全培养基）21、简要叙述工业微生物研究和实验中的微生物培养基必须具备的要素和对于大规模生产时对培养基的基本要求。