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抗鸡球虫卵黄抗体制备及初步应用作者：钱玮霖指导老师：徐前明（安徽农业大学植保学院合肥 230061）摘要：本项目旨在研制抗鸡球虫卵黄抗体，为防治鸡球虫病提供一种新的手段。
利用对临床所分离的球虫，经超声波裂解制备粗抗原，然后将所得抗原分别于弗氏完全佐剂和不完全佐剂混合，经肌肉注射方式对鸡蛋进行免疫，收集免疫后的卵黄；采用饱和硫酸铵法分离卵黄中的抗体，并用聚乙二醇浓缩获得较高浓度的抗体；采用凝集试验确定其抗体水平，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法进行抗体纯度分析；最后将所分离的抗鸡球虫卵黄抗体用于鸡感染球虫保护试验。
结果表明：（1）临床所分离得球虫多为混合感染，达3种以上；（2）蛋鸡经免疫后，经凝集试验可证实其抗体水平可达1:28，SDS-PAGE电泳显示：纯化后抗体大小为67.0kD 和23kD，且纯度较高。
基于上述情况，认为本试验制备出抗鸡球虫卵黄抗体方法并初步阐明了其抗鸡球虫的基本功能。
关键词：鸡球虫病；卵黄抗体；保护试验引言鸡球虫病广泛存在于养鸡业中，常造成大批死亡，其死亡率可最高达80％，且病愈鸡生长严重受阻，抵抗力降低，易继发其他疾病。
每年，全世界因为鸡球虫病造成的损失高达数十亿美元[1]。
因此，鸡球虫病是养鸡业中危害最严重的疾病之一。
在我国，特别是在南方地区，由于气温高、湿度大，这种环境利于球虫卵囊的孢子发育，本病常常呈暴发性流行，危害更加严重。
然而，目前对鸡球虫病的防治措施绝大部分多依赖于药物的预防和治疗上,即化学合成药物和抗生素两大类，自从1936年首次出现专用抗球虫药以来，已报道的抗球虫药达40余种，但是因为球虫对药物极易产生抗药性，大量使用化学药物势必会造成严重的药物残留问题等，这也是当今养禽业所遇到最棘手的问题之一。
上述问题存在，为临床防治鸡球虫病提出紧迫任务。
卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用。
鸭病毒性肝炎的症状鸭病毒性肝炎的诊断及防控措施-养鸭技术鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种急性接触性传染病。
临床上以发病急、传播快、死亡率高，剖检肝脏有明显出血点和出血斑为特征。
由于病毒血清型较多,且易发生变异而难以有效地免疫预防,导致该病一直成为危害养鸭业健康发展的重要疾病。
下面具体来了解一下：鸭病毒性肝炎的症状鸭病毒性肝炎的诊断及防控措施。
1、流行特点该病主要是小于3周龄的雏鸭容易发生，其中易感性最高的是3～10日龄雏鸭，成年鸭具有抵抗力，且鹅和鸡等其他禽类无法自然感染发病。
该病的主要传染源是病鸭和带毒鸭，主要通过直接接触病鸭发生感染，还能够经由病鸭排出的粪便以及污染的饮水、食具等造成间接传播。
主要经由呼吸道和消化道感染。
饲养管理不当，摄取矿物质和维生素不足，舍内过于潮湿，饲养密度过大，都能够引起发病。
该病全年任何季节都能够发生，其中主要发生于孵化季节，且只要发生就会在雏鸭群中快速传播，发病率能够达到100%。
2、临床症状大多数雏鹅突然出现发病，体质虚弱，精神沉郁，停止采食，缩颈拱背，脚软而无法稳定站立。
独自离群呆立，眼睛半睁半闭，出现瞌睡或者处于嗜眠状态，双翅下垂，人为强行驱赶走动缓慢。
部分排出液状白色或者菜绿色稀粪。
发病后期，病鸭表现ILIJ神经症状，运动失调，躯体朝向一侧歪斜，全身抽搐，头颈后仰，甚至背部着地，两脚ILIJ现痉挛性踢蹬，临死前出现角弓反张。
在该病的流行高峰期，还有一些病鸭会大量流泪，单眼或者双眼出现失明，且往往在ILIJ现神经症状后经过几分钟或者几小时就发生死亡。
部分病鸭会突然倒地，没有表现出任何症状就发生死亡，病程只可持续几小时或者1~2天。
病鸭康复后，也会导致生长发育明显缓慢，即使提高饲养管理水平，也无法使体重达到上市标准。
3、病理变化对病死鸭进行剖检，主要是肝脏发生特征性病变。
肝脏发生肿大，呈淡红色或者土黄色、黄白色、褐黄色，质地较脆，容易撕裂，表面存在不同大小的深紫色出血点、斑状条纹或者坏死病灶；胆囊也发生肿大，含有大量质地稀薄的胆汁，胆汁呈淡红色或者草青色；脾脏呈斑驳状花纹样，也发生肿大；大部分病鸭的肾脏呈树枝状充血，也出现肿胀；胰脏呈粉红色，出现充血；心肌质地柔软，脑部发生水肿、充血；其他器官没有发生明显变化。
高免血清制作方案
免疫对象：最好是准备淘汰的经产母猪
免疫剂量：4mL/头口蹄疫合成肽苗
免疫程序：首免后15天二免，二免后15天三免，三免后28天取血。
血清制备：三免后28天后，先将猪只消毒，再倒挂起来，在脖子动脉处取血，下面用消毒好的大盆接着，放到室温
（18℃-25℃）过夜，次日将盆中的血块用消毒好的铲子
铲出来，此时可能有少量的溶血，这没关系。
最后1mL
血清中加入2000单位的青霉素和200单位的链霉素。
分装：将制备好的血清放入500 mL或250 mL的消毒好的葡萄瓶。
贮存：-20℃保存，或制备好直接使用。
注射剂量：2mL/kg。
使用对象：各日龄的仔猪。
注意事项：1、铲子、刀子、盆子可先用消毒液消好毒，最后一定要用酒精消毒。
2、采血时母猪可先用乙醚将其麻醉，猪只也应消毒，最
后也用酒精消毒。
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911133973.1(22)申请日 2019.11.19(71)申请人 西安咸辅生物科技有限责任公司地址 710000 陕西省西安市高新区丈八街办锦业路69号创业研发园A区8号一期205室(72)发明人 黄威权 张学 田超 高琪 岑磊 (74)专利代理机构 北京众达德权知识产权代理有限公司 11570代理人 刘杰(51)Int.Cl.C07K 16/42(2006.01)C07K 16/02(2006.01)(54)发明名称一种抗独特型卵黄抗体的制备方法(57)摘要本发明公开了一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，涉及抗体制备技术领域，通过制备免疫原；采用所述免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后，按照第一预设条件皮下注射免疫小鼠后，获得小鼠抗抗原的抗体；采用所述小鼠抗抗原的抗体和不完全弗氏佐剂混合后，注射免疫产蛋鸡，按照第二预设条件免疫预定次数；采集所述产蛋鸡当天产的蛋；按照第四预设条件进行高免鸡蛋的采集；对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的破碎；对卵黄液进行处理之后，收集滤液，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化；分别对所述抗独特型卵黄抗体进行效价检测、特异性检测以及竞争抑制试验。
权利要求书3页 说明书8页 附图1页CN 110724196 A 2020.01.24C N 110724196A1.一种抗独特型卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括：步骤1：制备免疫原；步骤2：采用步骤1中获得的所述免疫原和不完全弗氏佐剂混合，搅拌均匀后，按照第一预设条件皮下注射免疫小鼠后，获得小鼠抗抗原的抗体；步骤3：采用步骤2中获得的所述小鼠抗抗原的抗体和不完全弗氏佐剂混合后，肌肉注射免疫产蛋鸡，并按照第二预设条件免疫预定次数；步骤4：在第二次免疫后第3～5天，采集所述产蛋鸡当天产的蛋，并利用ELISA法检测抗独特型抗体的效价，判断所述产蛋鸡是否满足第三预设条件；步骤5：当所述产蛋鸡满足所述第三预设条件时，按照第四预设条件进行高免鸡蛋的采集；步骤6：对所述高免鸡蛋进行卵黄分离、保存以及卵黄组织的破碎；步骤7：对卵黄液进行处理之后，静置以使杂蛋白继续沉淀，经过第一预设时间后，用吸管吸取第一上清，将底部混浊部分离心后再次吸取第二上清，将所述第一上清和所述第二上清混合、并过滤后，收集滤液，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；步骤8：根据冷酒精沉淀法，对步骤7中获得的所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化；步骤9：分别对所述抗独特型卵黄抗体进行效价检测、特异性检测以及竞争抑制试验。
适用专业：1、微生态制剂2、精制制品3、共熔点4、标记抗体5、多价疫苗二、单项选择题（每小题1分，共30分）1、贴附型细胞不能采用的培养方法是（）。
A.静置培养B.转瓶培养C.悬浮培养D.中空纤维培养2、下列佐剂中，能够帮助抗原刺激机体产出明显的细胞免疫的是（）。
A.脂质体B.白油佐剂C.氢氧化铝胶D.结核杆菌3、鸡传染性法氏囊病琼扩反应抗原所涉及的诊断方法是（）。
A.沉淀反应B.间接血凝反应C.补体结合反应D.琼扩反应4、生产高免血清时，用于制备免疫原的菌种属（）。
A.免疫用菌种B.加工用菌种C.工具菌种D.检定用菌种5、采用同胞兄妹交配，连续繁育20代以上所培育的动物为（）。
A.封闭群动物B.混杂群动物C.近交系动物D.突变系动物6、以鸡胚增殖病毒时，若采用卵黄囊途径接种应选择（）日龄胚。
A.5-8B.9-10C.10-12D.9-117、下列诊断制剂中，不属于变态反应抗原的是（）。
A.结核菌素B.鼻疽菌素C.布鲁氏菌素D.炭疽沉淀反应抗原8、下列方法中，不可用于活菌计数的是（）。
A.微量点板计数法B.比浊计数法C.倾注平板培养法D.平板表面散布法9、制备细菌种子液时，应选择在（）收获。
A.迟缓期B.对数期C.稳定期D.衰退期10、关于冷冻真空干燥，下列叙述中不正确的是（）。
A.预冷的温度应当低于共熔点B.制品的干燥是在真空状态下进行的C.从制品中抽出的水汽被冷凝器接收D.制品的装量没有特定要求11、新城疫油乳剂灭活疫苗不需要进行的检验项目是（）。
A.无菌检验B.真空度检查C.安全检验D.效力检验12、制备类毒素，适合选用（）对外毒素进行脱毒。
A.甲醛B.β-丙内酯C.二乙烯亚胺D.N-乙酰乙烯亚胺13、下列描述中，与杂交瘤细胞特征不相符的是（）。
A.能够分泌抗体B.能在体外无限生长繁殖C.寿命短D.能用两种途径合成DNA14、下列微生物中，能在血平板上生长的是（）。
A.禽流感病毒B.传染性法氏囊病病毒C.多杀性巴氏杆菌D.新城疫病毒15、检验制品中是否污染有需氧菌通常选用（）。
高免血清及卵黄抗体的制备技术
免疫血清
1.动物的选择可作为免疫用的动物多为哺乳类和禽类，主要有家兔、绵羊、马、猪、驴、豚鼠和鸡等，其中实验常用家兔、绵羊、鸡和豚鼠。
选择动物时要注意以下几个方面：
a.抗原与动物种系动物性抗原的免疫原性，随动物种系远近而有差别。
近缘动物的蛋白质免疫原性弱，反之则强。
因此选择动物时应选用亲缘关系较远的动物。
b.免疫血清的用量所需要的免疫血清，如是经常大量地使用，选择免疫动物时则应选择大动物；如所需的免疫血清量不大，则以选择小动物为宜。
c.动物的个体状态用于免疫的动物必须是适龄、健壮、无感染的动物。
免疫过程中应特别注意营养和卫生管理。
注射抗原1个月后，动物仍无良好的抗体反应，或在规定注射日程后抗体效价不高，可再注射l～2次，若仍不佳者立即弃去．
2.抗原制备与接种制造抗血清，根据产品不同,所用抗原、制法亦有所不同。
病毒性抗血清，一般是用本动物的含毒组织作抗原，首先把强毒接种本动物，使其发病，采取其含毒性组织作为抗原，注射于免疫动物。
细菌性血清，是用抗原性好的强毒或弱毒菌种，接种于规定培养基内，于37℃培养，细菌发育良好者，以纯粹检验后用作抗原。
抗原接种：动物在免疫过程中分为基础免疫及高度免疫。
基础免疫一般是注射疫苗，然后连续多次注射强毒进行高度免疫，每次注射剂量，要随着注射次数的增加而增加。
接种抗原的次数和剂量，应根据制造抗血清的品种和动物健康情况加以调整。
为了获得效价高的抗血清，动物饲养条件必须保持良好。
3.血清抗体的检测免疫程序接近结束时，测定血清的抗体效价，如果效价已达规定的要求，即可视作免疫成功，开始采血。
若经试血，血清效价不合格，则可继续增加注射抗原次数或剂量，如再试血仍不合格，应将动物淘汰。
测定免疫血清效价是及时掌握采血时机的重要步骤。
常用的有环状沉淀反应(包括抗原稀释法和抗体稀释法)和双向琼脂扩散试验。
用琼脂扩散试验测定血清效价时，如果在抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线者，即为阳性。
最高稀释倍数血清孔出现沉淀线，即为该血清的抗体效价。
琼脂扩散试验的效价通常比环状沉淀反应稍低。
4.血清采集与提取免疫后，经试血，抗体滴度达到要求后可采血。
动物采血应在上午空腹时进行，禁食一夜，可避免血中出现乳糜而获得澄清的血清。
不论免疫动物是大动物或小动物，采血方法均分一次放血和多次放血法两种。
a.一次放血绵羊或其他大动物可用颈动脉放血，家兔、豚鼠和鸡则可通过心脏直接采血。
b.多次少量放血法大动物可通过静脉采血，家兔、豚鼠和鸡等小动物可通过心脏采血。
免疫血清的分离应在无菌条件下进行，并应尽量防止溶血。
采血用的器械、容器等用前要进行灭菌，以无菌操作采血，注入斜放的大试管或三角瓶内，待凝固后分离血清，将多份分离出的血清混合，待检。
5.免疫血清的检验免疫血清的检验包括无菌检验、安全检验和效力检验。
无菌检验按成品检验的有关规定进行；安全检验通常用体重18～22g的健康小白鼠5只，各皮下注射血清0.5ml，用体重250～450g的健康豚鼠2只，各皮下注射血清10ml，观察10天，均应健活，效力检验则按各种抗血清规定方法进行。
卵黄抗体
免疫血清和卵黄抗体是紧急预防和早期治疗相应传染病的有效制剂。
为了降低成本，增加产量，提高治疗效果，对健康母鸡进行法氏囊病高度免疫，取其卵黄来防治法氏囊病,不但省去杀鸡分离血清的麻烦，而且具有产量高、效果好、价格便宜等优点。
现以法氏囊病为例，简要阐明高免卵黄抗体的制备。
1.制造用鸡的选择选择健康的蛋鸡，隔离饲养观察l周后无特殊反应者，方可免疫。
2.疫苗免疫通常使用组织灭活苗，其制备过程如下：
a.制备鸡的选择选40～50日龄SPF鸡，用通过SPF鸡传代的野毒滴鼻、点眼，每只鸡接种0.2～0.3ml，在48～72h左右死亡的鸡，无菌采集其法氏囊，并作病变观察，将病变典型的法氏囊低温保存备用。
b.制苗取10g病料加100ml0.5％甲醛生理盐水，匀浆、冻融、过滤，滤液加8％甘油，置37℃18～24h灭活，即为水剂灭活苗，也可加白油等佐剂，制成油乳剂灭活苗。
c.无菌检验取灭活苗0．5ml接种于普通琼脂斜面及厌氧肉汤培养基各一支，于37℃培养48h，应无菌生长。
d.安全试验及保护试验经无菌检验合格的灭活苗，给40～50日龄SPF鸡或未经法氏囊疫苗免疫过的健康鸡，肌肉注射、滴鼻、点眼、接种0.3～0.5ml，观察半月，无法氏囊病发生者，可用1：10强毒0.5ml ／只攻毒，观察l0～14天，无发病者为安全有效。
免疫程序第一次免疫，每只鸡肌肉注射lml，经7～10天后进行第二次免疫，每只鸡2ml，7天后用琼脂扩散方法测定卵黄抗体效价，如已达到1：64以上，即可收集高免蛋，如效价不高，可隔7～l0天进行第三次加强免疫。
3.高免卵黄抗体的制备
a.高免蛋的处理高免蛋用0.1％新洁尔灭溶液浸泡5min，洗涤干净，放入无菌室晾干备用。
b.分离卵黄无菌操作，打破蛋壳，分离蛋黄。
c.卵黄匀浆收集的蛋黄置无菌的组织匀浆器中，加等量灭菌生理盐水，并按每毫升加入青霉素、链霉素各1000单位，硫柳汞1.0／万，匀浆、过滤,分装消毒瓶内，4℃冷藏备用。
4.高免卵黄抗体的检验
a.无菌检验取0.5ml高免卵黄抗体，分别接种于普通琼脂斜面和厌氧肉肝汤培养基，37℃培养24～48小时，应无细菌生长。
b.安全检验取30日龄健康鸡10只，每只鸡肌注卵黄抗体2ml，观察5～7天，应无任何不良反应。
c.中和试验取30日龄健康鸡20只，随机分成2组。
试验组每只鸡皮下或肌肉注射野毒和卵黄抗体（1：10)混合液1ml，观察饲养10～15天，应全部存活，对照组每只鸡皮下或肌肉注射野毒1ml，观察10～15天，应部分或全部死亡，剖检后出现典型病变。
d.卵黄抗体效价测定用琼脂扩散反应测定，抗体效价应在1：64以上。
