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免疫组化操作步骤及原理嘿，咱今儿就来唠唠免疫组化这档子事儿！免疫组化啊，就像是一场神奇的探秘之旅。
先来说说操作步骤吧。
就好比要做一道特别的菜，得先精心准备食材一样。
第一步呢，得把要研究的组织标本准备好，这就像是挑选出最好的食材。
然后呢，要给这些标本进行固定，让它们乖乖地保持住形态，就跟给食材定个型似的。
接下来，就是切片啦，把组织切成薄薄的一片片，这就好像把食材切成合适的大小和形状。
切好片后，就得进行抗原修复啦，这就像是给食材来个特别的处理，让它能更好地展现出自己的特点。
再然后就是孵育一抗，这一抗就像是专门去找目标的小侦探，能准确地找到我们想要研究的那个东西。
孵育完一抗，还得洗一洗，把多余的去掉，就跟洗菜一样。
接着孵育二抗，这二抗就像是小侦探的助手，能让我们更清楚地看到小侦探找到的目标。
最后呢，进行显色，哇哦，这一步就像是魔法一样，让我们能清楚地看到结果啦！再说说原理吧。
免疫组化就像是一场精准的追踪游戏。
我们身体里的各种蛋白质啊，就像是隐藏在大森林里的各种小动物。
而抗体呢，就是专门去寻找这些小动物的猎人。
一抗就是那个最厉害的猎人，能准确地找到目标。
二抗呢，就是帮助一抗更好地发挥作用的伙伴。
通过这样的配合，我们就能在显微镜下清楚地看到我们想要研究的那些蛋白质啦，是不是很神奇呢？你想想啊，要是没有免疫组化，我们怎么能知道身体里这些小小的蛋白质在搞什么名堂呢？它就像是一把钥匙，能打开我们了解身体奥秘的大门。
比如说，医生要判断一个肿瘤是良性还是恶性，免疫组化就能帮上大忙啦！它能告诉医生这个肿瘤里都有哪些蛋白质，从而帮助医生做出更准确的诊断。
这可太重要了，关系到病人的治疗方案和未来呢！免疫组化还能帮助科学家们研究各种疾病的发生机制，就像是在黑暗中点亮一盏明灯，让我们能看清疾病的真面目。
这可不是一般的厉害呀！总之呢，免疫组化是个非常重要的技术，它让我们对身体的了解更加深入，也为医学和科学的发展做出了巨大的贡献。
二抗识别一抗原理
一、二抗和一抗概念介绍
二抗：次级抗体，又称多克隆抗体，是指对原免疫原特异性抗体所产
生的抗体。
即在免疫原被免疫后，机体产生针对免疫原特异性的一次
免疫反应，然后产生次级抗体来对抗这种抗体。
一抗：指反应免疫原的特异性抗体，也称主要抗体。
二、二抗与一抗原理
1、二抗的形成原理
当免疫原进入人体内，免疫系统将其识别为异物，并利用B细胞产生
特异性抗体进行抗体产生。
每个B细胞只能产生一种特定的抗体，这
是一次免疫反应。
次级抗体通常是通过免疫原来激活的，这会导致次
级抗体产生。
2、一抗与二抗的配对原理
通过将碳水化合物或蛋白质结合在特定的固相支持介质上并浸润进其
中相对硬化的样品，以实现介质上的打印，通过加入与所分析分子结
合的首先抗原——一抗，接着将一个干扰素作用物质——生物素标记
在该抗原上，然后，需要检测的样品处理期间，将该标记桥接至一份
与之结合的次级抗体上，从而完成检测。
3、二抗的优势
与直接测量一抗相比，使用次级抗体提供了一定的优势。
首先，次级
抗体可以被制备为人类免疫球蛋白（IgG）的特异性抗体，因此可以与
人类IgG （而不是最初的抗体）结合，从而提高了检测灵敏度。
其次，使用特异性次级抗体，能够最大限度地降低假阳性和假阴性的风险。
三、结论
二抗和一抗的应用相辅相成，二抗的识别可以极大地提高检测灵敏度，避免出现误差，是现代医学研究的重要工具。
免疫组化一抗二抗原理一、免疫组化技术原理免疫组化技术是一种重要的生物化学检测方法，通过使用一抗和二抗的相互作用，来检测目标物质在细胞或组织中的分布和定量。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 抗原表达和固定：首先，需要提取或制备出待检测物质的抗原，并将其固定在载玻片或微孔板上。
2. 样品处理：将待检测的细胞或组织样品处理，使其表达出目标物质。
3. 一抗处理：将经过特异性识别的一抗加入样品中，一抗能够与目标物质发生特异性结合，并形成抗原-抗体复合物。
4. 二抗处理：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗能够与一抗发生特异性结合，并进一步增强抗原-抗体复合物的信号。
5. 检测信号放大：通过连接二抗的酶标记物或荧光标记物，可以进一步放大信号。
6. 显色或荧光检测：通过加入适当的显色剂或荧光探针，可以将特定信号转化为可见的颜色或荧光。
7. 显微镜观察：使用显微镜观察和分析样品中的标记信号分布情况，从而确定目标物质的位置和数量。
二、免疫组化技术应用免疫组化技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
具体应用包括：1. 细胞和组织定位：通过标记特定抗原或蛋白质，可以确定其在细胞或组织中的定位，帮助研究者了解其功能和相互作用。
2. 疾病诊断：免疫组化技术可以检测疾病标志物，如癌症标志物、病毒抗原等，用于早期诊断和病情监测。
3. 药物研发：免疫组化技术可用于评估药物在细胞或组织中的靶点表达和药效。
4. 免疫组织化学：通过标记细胞或组织中的特定分子，可以帮助鉴定组织类型、识别病理变化以及评估治疗效果。
5. 免疫组化芯片：免疫组化芯片技术结合了高通量技术和多路复用的优势，可以快速、准确地检测多个标志物，有望在个性化医疗中得到广泛应用。
三、免疫组化技术的发展前景随着生物技术和分子生物学的不断发展，免疫组化技术也在不断创新和改进。
未来的发展方向主要包括：1. 自动化和高通量：通过引入自动化设备和流程，提高实验的标准化和效率，同时实现多个标志物的高通量检测。
一抗二抗分子杂交的原理
一抗二抗分子杂交的原理可以归纳为以下几点:
一、原理概述
一抗二抗分子杂交是利用一抗和二抗的特异性亲和作用,当一抗与对应的抗原结合后,再与标记的二抗结合,从而检测或定量目标抗原。
二、一抗的作用
一抗是针对目标抗原特异性设计的抗体,具有高亲和力,可以特异性识别并高效捕获对应的抗原分子。
三、二抗的作用
二抗是与一抗结合的抗体,常被标记成可以检测的物质,如酶、荧光素等。
二抗与一抗结合可以产生信号,指示一抗是否与抗原结合。
四、杂交反应过程
1. 一抗固定在固相载体上。
2. 当样品中的目标抗原存在时,会与固定的一抗结合。
3. 洗涤除去未结合成分。
4. 加入标记的二抗使其与一抗结合。
5. 再次洗涤。
6. 检测二抗的信号,判断一抗是否与抗原结合。
五、应用
主要应用于临床检测、食品检测、免疫组化等领域的抗原检测。
可以实现高灵敏度的抗原检测或定位。
综上所述,一抗二抗分子杂交利用两抗的亲和特性实现抗原的特异性检测,是一种重要的免疫学检测原理。
该原理应用广泛。
W e s t e r n b l o t一抗和二抗的选择Westernblot一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。
在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。
轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。
二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。
由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。
二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。
二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验是一种常见的细胞生物学研究方法，它可以用于检测细胞内的蛋白质表达水平、定位细胞器分布以及研究信号通路等。
在进行荧光双染实验时，一抗和二抗的选择是非常重要的，因为它们直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
本文将从理论和实践两个方面，详细介绍荧光双染实验中一抗和二抗选择的基本要求。
我们来了解一下一抗和二抗的概念。
一抗(Antibody 1)是指用于检测特定抗原的单克隆抗体，它可以与抗原结合并形成免疫复合物，从而实现对抗原的定量或定位。
二抗(Antibody 2)是指与一抗互补的单克隆抗体，它的特异性可以增强一抗的亲和力和信号强度，从而提高实验的灵敏度和特异性。
在荧光双染实验中，选择合适的一抗和二抗是保证实验结果的关键。
以下几点是进行一抗和二抗选择的基本要求：1. 一抗和二抗的特异性要强特异性是指一抗和二抗只能与目标抗原或靶蛋白结合，而不能与其他分子发生反应。
为了保证实验的准确性和可靠性，一抗和二抗的特异性必须很强。
这可以通过对比不同一抗和二抗对同一样本的检测结果来实现。
如果大部分样本都能被一种特定的一抗和二抗识别并结合，那么这种组合就是具有较强特异性的。
2. 一抗和二抗的亲和力要适中亲和力是指一抗和二抗与目标抗原或靶蛋白结合的能力。
亲和力过低会导致一抗和二抗无法结合到目标抗原或靶蛋白上，从而影响实验结果；亲和力过高则可能导致过度结合，使得信号强度降低，影响后续分析。
因此，在选择一抗和二抗时，需要找到一个适中的亲和力值，使得它们能够有效地结合到目标抗原或靶蛋白上，同时又不会导致信号强度过低。
3. 一抗和二抗的稳定性要好稳定性是指一抗和二抗在储存和使用过程中是否会发生结构变化或失活。
如果一抗和二抗不稳定，那么它们的性能就会受到影响，从而导致实验结果不准确。
因此，在选择一抗和二抗时，需要考虑它们的稳定性，尽量选择那些经过严格质控、储存条件稳定的产品。
4. 一抗和二抗的价格要合理虽然一抗和二抗的质量非常重要，但价格也是一个不容忽视的因素。
免疫组化IHC实验抗体选择在设计免疫组化IHC实验时，抗体的选择是相当重要的。
因为免疫组化试验的核心就是抗原与抗体的特异性结合,因此抗体的重要性就不言而喻。
下面我们就跟大家分享一下免疫组化IHC实验中一抗与二抗的选择要点与技巧。
一、选择单抗还是多抗单克隆和多克隆抗体的内在特征决定了它们用于免疫组化IHC时的优势和限制。
单克隆抗体由单个B细胞克隆产生，代表了同质群体，能够高亲和力高特异性地与单个表位结合。
这在检测蛋白家族的某个成员时特别有用，因为蛋白家族有着高比例的氨基酸同源性。
过去的鼠单抗灵敏度上要劣于多抗。
但是兔单抗的出现，大大的扭转了它的劣势。
也在免疫组化实验中表现出卓越性。
个人认为，在实验中特异性是至高无上，如果你的实验特异性无法保证，那么这个实验就不可信。
因此基于以上因素，推荐单克隆抗体更常用于免疫组化IHC实验。
尤其是兔单抗，以特异性强和灵敏度高，最适于免疫组化而著称。
二、抗体的应用范围一抗在选择时，要确定该抗体可以应用到免疫组化IHC。
也就说不是所有的抗体都可以用于免疫组化IHC。
所以在购买抗体时可以在详情页查阅一下，或者咨询一下销售客服了解该抗体详细应用范围（咨询销售客服的好处就是你还有可能获得一些意外惊喜）。
三、冰冻切片还是石蜡切片你实验做得是石蜡切片还是冰冻切片，这个在实际应用上，抗体也是有所区别的。
你要确认你所购买的抗体能否用于IHP(石蜡切片)或者IHF（冰冻切片）。
一般能做石蜡切片的抗体，基本上可以用来检测冰冻切片，但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。
四、species reactivity抗原分子表面存在着能与抗体相互作用的部位即抗原决定簇,一种抗原物质可以有两个或更多的决定簇。
研究表明,抗体是从抗原决定簇的立体结构而不是从抗原的全面分子排列来“认识”抗原的。
这样,有时一种抗体可以与分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应,这称为交叉反应。
如何选择WB实验抗体（一抗的选择原理及方法）？检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，在同一个抗体公司，可能会有好几种，甚至好几十种；在不同的抗体公司，那就更多了。
那怎样在琳琅满目的抗体中，选择自己实验需要的抗体呢？主要考虑如下几种因素：分析自己实验应用的实验方法是哪种？分析自己实验中标本的种属是哪种动物或人的？分析样本中的蛋白质的结构性质，分析抗体的标记和检测，分析抗体的宿主来源种属等等。
1.分析自己实验应用的实验方法是哪种？一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。
如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证。
为了避免实验风险，当说明书中没有提及的应用方法时，可向商家申请测试装，进行测试后，再决定是否购买。
如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。
2.分析自己实验中标本的种属是哪种动物或人的？一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种动物或人的标本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等动物的标本的实验。
也就是说应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高。
如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过。
为了避免实验风险，尽量不要使用说明书中没有提及的标本的种属的抗体。
或者通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy和NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。
如果比对结果，证明同源性比较高的，也可以选择。
3.分析样本中的蛋白质的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。
Westernblot一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。
在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。
轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。
二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。
由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。
二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。
二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
二抗识别一抗原理在免疫学中，抗体是一类由人体免疫系统产生的蛋白质，用于识别和抵御入侵的病原体。
抗体有不同的类型，包括一抗和二抗。
一抗是指直接与抗原结合的抗体，而二抗则是与一抗结合并起到辅助作用的抗体。
在免疫诊断和实验中，二抗的识别作用非常重要。
二抗的识别作用是基于特定的免疫反应机制。
当一个抗原进入人体后，免疫系统会产生一种特定的抗体来与之结合。
这个抗体可以与抗原结合在一起，形成免疫复合物。
然而，由于抗原分子通常比较小，很难直接观察到。
因此，为了更好地观察和检测抗原，研究人员发展了二抗的识别方法。
二抗的识别原理主要基于抗体的结构和特性。
抗体分为两个重链和两个轻链，其中重链有两个部分：Fab和Fc。
Fab部分负责与抗原结合，而Fc部分则可以与其他抗体结合。
当一个抗原与一抗结合时，二抗的Fc部分可以与一抗的Fab部分结合，形成一个双抗体复合物。
这个复合物的形成可以增强抗原的识别和检测。
二抗的识别作用可以通过间接免疫荧光法和酶联免疫吸附试验（ELISA）来说明。
在间接免疫荧光法中，一抗与抗原结合后，二抗与一抗结合形成复合物。
二抗中通常带有荧光染料，可以通过显微镜观察到。
在ELISA中，一抗与抗原结合后，二抗与一抗结合，并与酶反应产生颜色变化，可以通过光谱仪来检测。
二抗的识别作用在免疫学和生物医学研究中具有广泛的应用。
它可以用于检测抗原的存在和浓度，例如在疾病诊断和药物研发中。
此外，二抗还可以用于分离和纯化抗原，以及观察免疫反应的动态过程。
二抗的识别作用是基于抗体的结构和特性。
它通过与一抗结合形成复合物，增强了抗原的识别和检测。
二抗在免疫学和生物医学研究中具有重要的应用价值，为疾病诊断和药物研发提供了重要的工具和方法。
通过进一步研究和发展，二抗的识别作用将在未来得到更广泛的应用和推广。
Westernblot一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。
在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。
轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。
二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。
由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。
二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。
二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
免疫组化步骤及原理一、前言免疫组化是一种常用的实验技术，它可以用来检测组织或细胞中的蛋白质表达及其分布情况。
本文将详细介绍免疫组化的步骤及原理。
二、免疫组化的步骤1. 取材首先需要取得需要检测的样本，可以是活体组织或固定后的切片。
对于固定后的切片，需要进行脱水、透明化和包埋等处理。
2. 制备切片将取得的样本制备成厚度为4-6μm的切片，并将其放置在载玻片上。
然后进行脱蜡和再水化处理，以便后续步骤的顺利进行。
3. 抗原修复抗原修复是为了恢复经过固定和包埋处理后被破坏或掩盖了的抗原性位点，使其能够被抗体识别。
抗原修复方法有多种，如高温加压法、微波辅助法等。
4. 阻断非特异性结合位点在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点以减少假阳性结果。
常用的方法是使用牛血清白蛋白、小鼠IgG等。
5. 抗体孵育将特异性的一抗加入载玻片上，在恰当的条件下孵育一段时间，使其与靶分子结合。
然后用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
6. 二抗孵育加入与第一抗体来源物种不同的二抗，使其结合到第一抗体上。
通常二抗会标记有荧光素、辣根过氧化物酶等标记物，以便于检测。
7. 洗涤在每个孵育步骤之后都需要进行洗涤，以去除未结合的分子和杂质。
洗涤缓冲液可以是PBS、TBST等。
8. 显色对于标记有辣根过氧化物酶等标记物的二抗，需要使用底物进行显色。
底物包括DAB、VIP等，在加入底物之前需要在载玻片上加入过氧化氢等催化剂。
9. 盖片封装最后将载玻片盖上盖片，并使用透明胶水进行封装。
这样可以保持样本的湿度和防止样本污染。
三、免疫组化的原理免疫组化的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够被免疫系统识别并引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽等。
抗体是由B细胞分泌的一种具有特异性结合能力的分子，可以识别和结合到相应的抗原上。
在进行免疫组化实验时，首先需要选择一种特异性较高的一抗，使其与靶分子结合。
然后加入来源于不同物种的二抗，使其与第一抗体结合。
免疫组化应注意什么原则免疫组化是一种广泛应用于生命科学领域的实验技术，用于检测、定位和鉴定细胞、组织和生物分子中的特定抗原。
在进行免疫组化实验的过程中，需要注意以下原则：1. 选择合适的抗原修复方法：组织固定和包埋的过程会使细胞或组织中的抗原发生变性或不可逆变化，因此需要对抗原进行修复操作。
常用的抗原修复方法包括热修复、酶解修复和酸性修复等。
选择适当的抗原修复方法可以恢复抗原的免疫反应性，提高实验的准确性和可重复性。
2. 合理选择一抗和二抗：在免疫组化实验中，一抗是检测目标抗原的抗体，二抗是针对一抗产生的抗体。
合理选择适合的一抗和二抗对实验结果的准确性和特异性至关重要。
一抗的选择应考虑抗原亲和力、特异性和交叉反应性等因素。
二抗则应选择与一抗来源物种不同的抗体，以避免非特异性反应的干扰。
3. 控制染色反应的时间和条件：染色反应时间和条件的控制直接影响实验结果的准确性和可靠性。
染色反应时间过长可能导致背景染色过度，影响抗原的可视化观察；染色反应条件温度过高或过低可能导致抗体与抗原结合的非特异性结构破坏或抑制，影响染色反应的特异性。
4. 注意负对照和阳性对照的设置：负对照用于评估实验过程中非特异性反应的背景水平，通常使用未与一抗进行反应的样本作为负对照。
阳性对照则用于评估一抗和二抗的有效性和敏感性，通常使用已知含有目标抗原的样本作为阳性对照。
合理设置负对照和阳性对照可以帮助准确判断实验结果和消除可能的假阳性或假阴性结果的干扰。
5. 实验结果的观察和分析：免疫组化实验结果的观察和分析应充分考虑细胞或组织的形态特征和染色强度等信息。
观察时应留意光线和显微镜的调节，结合已有的形态学知识进行判断和分析，避免主观因素对结果的干扰。
6. 实验参数的优化和标准化：实验参数的优化和标准化对于免疫组化技术的准确性和可靠性至关重要。
通过合理优化实验参数，如抗体浓度、抗原修复时间和温度、染色剂浓度和反应时间等，可以提高实验结果的准确性和可重复性。
一抗二抗的那些事儿二抗为什么只要种属对即可？如果一抗是鼠的瘦素抗体，是有订货现制的，而二抗每个公司都有很多期货，二抗不是一抗的抗体吗，为什么不像一抗那样要求特异性高？这涉及到抗体识别抗原的原理和抗体的结构。
比如你要检测的蛋白为A，它有a, b, c, d 四个表位(epitope)，可以被抗体特异性认识。
制作针对A的抗体是将蛋白A的一段，比如包含b+c段，打入兔子（最常见）或其他动物（山羊goat，大鼠rat，鸡chicken，仓鼠hamster），由于这是外来入侵物，动物自身的免疫系统会生产针对它的抗体来清除这个异物，而产生的抗体有些会识别b位点，有些则识别c位点。
之所不用完整的蛋白，是因为全长通常会太大。
然后收集被免疫了的动物的血清，这个含有针对蛋白A的的多克隆抗体（因为是识别c+d的混合抗体）就称为抗血清（antiserum)。
有的产品卖的直接就是抗血清，有的则再一步将抗体纯化出来。
这种多克隆抗体一般会便宜一些。
而通过体外刺激小鼠的B细胞和肿瘤细胞的杂合体，分离出单克隆进行培养，可以产生出只针对一个表位b的单克隆抗体（monoclonal antibody），这种抗体的特异性更高，但价格也更贵。
但具体到用单抗还是用多抗，则要具体情况具体分析。
比如你要测的蛋白浓度很低，用多抗检测到的可能性会比用单抗高。
又或者待测蛋白会被加工切割成两段，要想两段都检测到，显然应该用针对两段表位的多抗。
由此可见，一抗都是特异性针对你要检测的蛋白，你要测A，他要测B，我要测C,所以产量就不可能太大，因为需求量没有那么大。
而二抗是个什么情况呢？首先要了解抗体的结构。
抗体结构就像一个Y字形，两个丫的部分称为可变区（Fab)，正是这个区域特异性地识别抗原的表位。
就像一把钥匙配一把锁一样，表位b只被含有b'可变区的抗体识别。
而抗体Y字形下面的主干部分称为恒定区(Fc)，所有人的抗体的Fc都是一样的，不同的只是Fab区，可以是b'，可以是c'。
生物医学实验入门（11）：免疫组化（一）原理童鞋们应该还记得western中提到的检测原理，蛋白-一抗-二抗三个小伙伴手拉手，如果可以用试剂检测到二抗，那么就能够间接地检测到蛋白。
其实免疫组化（包括免疫荧光，也包括ELISA）的原理与之类似，也是先用一抗识别蛋白，然后用二抗识别一抗，最后用底物与二抗上连接的酶反应并显色（免疫荧光的二抗自带荧光，所以不用与底物反应显色；有些ELISA的识别过程会稍微繁琐一点点）。
但是，与western不同的是：1.western中的蛋白通过“转膜”被结合在一张膜上，而免疫组化的蛋白是在组织上，因此免疫组化中所要检测的蛋白无需提取，只需要将组织进行简单处理即可。
免疫组化的这一特点同时也成就了它被很多人青睐的原因，就是“眼见为实”，通过免疫组化的方法可以在组织“原位”将蛋白现形，免去了组织和细胞处理、蛋白提取等诸多过程对样本外形的破坏，起到“定位”的效果；2.western中用到的蛋白样本是经过“变性”处理的，也就是我们要把从组织或细胞中提到的蛋白与loading buffer混合后“煮一煮”的（非变性电泳除外），所以western中的蛋白样本没有蛋白质高级结构，但是免疫组化中的蛋白样本是具有高级结构的，这将对一抗的选择有一定要求，详情请参见“小贴士”第1点。
操作总体上，免疫组化的操作包括7个步骤：组织固定（可选）、石蜡包埋（做石蜡切片的选择做，做冰冻切片的请跳过）、切片、蛋白复性（未固定的冰冻切片请跳过）、封闭、抗体孵育、显色。
细心的你可能发现了一个问题，做免疫组化可以有石蜡切片和冰冻切片两种选择，那究竟该怎么选择？首先我们先来解释一些基本问题：既然免疫组化是在组织上做的，那么这个组织得把它盛放到一个载体（或者你豪放地理解为容器也行）上才能操作，因为我们不能生猛地用手或者用镊子拿着组织来做免疫组化，这个载体就是一张载玻片，但不是普通载玻片，而是防脱玻片（请参见“小贴士”第2点），一般就是用多聚赖氨酸处理过的普通玻璃载玻片。
一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西.一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。
这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。
如果一抗自己带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），则不需要二抗。
但这样成本很高，因为一种一抗只识别一种底物。
所以现在的设计一般是二抗带上可检测标记，再来检测一抗。
而一抗识别底物。
