第一章2 各种光学显微镜技术

光学显微镜技术第一章概述第一节显微镜的作用人眼对微观世界观察的局限性光学显微镜是人类探索微观世界的光学精密仪器光学显微镜的发展在很大程度上决定了人们对生命现象的认识第二节显微镜的类型根据照明源的性质一、光学显微镜：利用可见光（或紫外光）为照明源，一般有单式及复式显微镜两类。

复式显微镜可分为：1.普通型：常规使用。

2.特种型：如荧光、相衬显微镜等；供专门观察和研究。

3.高级型：万能显微镜。

4.共焦激光扫描显微镜（Confocal）。

第三节光学显微镜的发展简史1625年法布尔提出显微镜的概念1610年伽利略制造出具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜1611年开普勒说明了显微镜的原理1665年虎克制造出放大140倍的显微镜，提出“Cell”的概念1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜19世纪阿贝提出显微镜的完整理论1902年艾夫斯建立了双目镜系统1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖20世纪60年代微分干涉衬显微镜问世20世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用第四节显微镜的基本光学原理一、折射与折射率光线的折射现象物质的折射率二、透镜的性能凸透镜可以会聚光线凹透镜可以发散光线三、透镜的成像质量象差：是指透镜所形成的象与理想象在形状、颜色等方面存在差异。

色差：由于不同的颜色光线折射率差异而形成的象差。

色差的校正（1）采用单色光为光源。

（2）利用透镜的性质。

四、显微镜的成象（几何成象）原理利用凸透镜成象原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立的放大的实象。

目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。

显微镜成象原理：第二章、显微镜的主要光学技术参数第一节数值孔径（Numerical Aperture，NA）数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体间介质的折射率（η）和孔径角（u）半数正弦的乘积。

用公式表示：NA= ηsin u/2数值孔径代表了物镜或聚光镜光通量的大小，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标。

最全的显微镜分类光学显微镜有多种分类方法：按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜; 按观看对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等；按光源类型可分为一般光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等。

常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。

1.双目体视显微镜双目体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，是一种具有正象立体感地目视仪器。

在生物、医学领域广泛用于切片操作和显微外科手术；在工业中用于微小零件和集成电路的观测、装配、检查等工作。

它利用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有肯定的夹角一一体视角（一般为12度一一15度），为左右两眼供应一个具有立体感的图像。

它实质上是两个单镜筒显微镜并列放置，两个镜筒的光轴构成相当于人们用双目观看一个物体时所形成的视角，以此形成三维空间的立体视觉图像。

目前体视镜的光学结构是：由一个共用的初级物镜，对物体成象后的两光束被两组中间物镜--------- 变焦镜分开，并成一体视角再经各自的目镜成象，它的倍率变化是由转变中间镜组之间的距离而获得的, 因此又称为连续变倍体视显微镜（Zoom-stereomicroscope）o随着应用的要求，目前体视镜可选配丰富的选购附件，如荧光，照相，摄象，冷光源等等。

2.金相显微镜金相显微镜是特地用于观看金属和矿物等不透亮物体金相组织的显微镜。

这些不透亮物体无法在一般的透射光显微镜中观看, 故金相和一般显微镜的主要差别在于前者以反射光，而后者以透射光照明。

在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观看物体表面，被物面反射后再返回物镜成像。

这种反射照明方式也广泛用于集成电路硅片的检测工作。

3.偏光显微镜（Polarizingmicroscope）偏光显微镜是用于讨论所谓透亮与不透亮各向异性材料的一种显微镜。

显微镜光学原理及技术参数详解目录1 第一章：显微镜简史 (2)2 第二章显微镜的基本光学原理 (2)2.1 折射和折射率 (2)2.2 透镜的性能 (2)2.3 影响成像的关键因素—像差 (2)2.3.1 色差（Chromatic aberration） (3)2.3.2 球差(Spherical aberration) (3)2.3.3 慧差(Coma) (3)2.3.4 像散（Astigmatism） (3)2.3.5 场曲（Curvature of field） (4)2.3.6 畸变（Distortion） (4)2.4 显微镜的成像（几何成像）原理 (4)2.5 显微镜光学系统简介 (5)3 第三章显微镜的重要光学技术参数 (5)3.1 数值孔径 (6)3.2 分辨率 (6)3.3 放大率 (7)3.4 焦深 (7)3.5 视场直径（Field of view） (7)3.6 覆盖差 (8)3.7 工作距离 (8)4 第四章显微镜的光学附件 (8)4.1 物镜 (9)4.2 目镜 (11)4.3 聚光镜 (11)4.4 显微镜的照明装置 (12)4.5 显微镜的光轴调节 (13)5 第五章各种显微镜检术介绍 (14)5.1 金相显微镜 (14)5.2 偏光显微镜（Polarizing microscope ） (17)5.3 体视显微镜（Stereo microscope） (19)1第一章：显微镜简史随着科学技术的进步，人们越来越需要观察微观世界，显微镜正是这样的设备，它突破了人类的视觉极限，使之延伸到肉眼无法看清的细微结构。

显微镜是从十五世纪开始发展起来。

从简单的放大镜的基础上设计出来的单透镜显微镜，到1847年德国蔡司研制的结构复杂的复式显微镜，以及相差，荧光，偏光，显微观察方式的出现，使之更广范地应用于金属材料，生物学，化工等领域。

2第二章显微镜的基本光学原理2.1折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现像，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。

显微镜的发展史流程第一章最早的显微镜早在17世纪，荷兰物理学家安东尼·范·李温霍克发明了第一台简单显微镜。

范·李温霍克使用双凸透镜和凸面聚光镜组成的简易显微镜观察了许多微观生物体，比如细胞、红血细胞和微生物。

他的发现为微生物学的诞生奠定了基础，也开启了显微镜的新时代。

之后，英国天文学家罗伯特·伏德发明了复合显微镜，用两个透镜组合的方式增强了放大倍数。

这种显微镜的放大倍数更高，观察更加清晰，成为后来显微镜发展的基础。

第二章光学显微镜的演进18世纪，显微镜的设计和制造技术得到了进一步的发展。

光学工匠们开始使用更高级的透镜材料，提高了透镜的质量和精度。

德国物理学家约瑟夫·冯·弗劳恩霍夫发明了用于观察透明物体的倒置显微镜，提高了显微镜的实用性和便捷性。

19世纪，英国物理学家埃尔南·冯·贝尔解决了透镜镇定的问题，设计出了高分辨率的近视镜显微镜。

这种显微镜的分辨率更高，可以观察更小的微生物体和细胞结构。

同时，冯·贝尔还开发了差衍射技术，使显微镜的成像更加清晰和精确。

第三章电子显微镜的诞生20世纪，随着电子技术的发展，电子显微镜成为一种全新的显微镜技术。

德国物理学家恩斯特·鲁斯卡和马克斯·克诺尔发明了第一台电子显微镜，使用电子束替代了光学透镜，使得显微镜的分辨率和放大倍数大幅提高。

电子显微镜可以观察更小的微生物体和更细微的细胞结构，对科学研究和医学诊断产生了巨大影响。

随着电子显微镜技术的不断革新和改进，现代的电子显微镜已经发展出了许多不同类型，比如扫描电子显微镜、透射电子显微镜等。

这些电子显微镜在原子级别的材料分析、生物医学研究等领域发挥着重要作用，成为现代科学研究的重要工具。

第四章显微镜在科学研究中的应用显微镜在科学研究中扮演着至关重要的角色，它帮助科学家观察和研究微观世界，揭示了许多自然界的奥秘。

高考总复习光学显微镜操作技术专题编稿：宋辰霞审稿：闫敏敏【考大纲求】1．说明光学显微镜的使用步骤2．掌握光学显微镜使用中一些注意事项3．总结教材中与光学显微镜使用有关的实验及实验注意事项【考点梳理】考点一、光学显微镜的使用1.显微镜的有关知识：（1）显微镜构造①机械构造：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、载物台、压片夹、物镜变换器②光学构造：目镜、物镜、粗准焦螺旋、细准焦螺旋、通光孔、遮光器、反光镜（2）注意事项：①显微镜的放大倍数 =目镜倍数×物镜倍数注意：放大倍数指直线距离放大倍数，即是对边长的放大倍数，而非对面积的放大倍数。

如：当放大倍数计算为50 倍时，对面积的放大则是502倍）② 目镜上无螺纹，放大倍数越大，镜头越短；物镜上有螺纹，放大倍数越大，镜头越长，镜头离装片的距离越近。

以以下图：①②表示目镜，③④物镜。

③ 显微镜成像为倒立实像，注意目标的挪动方向：如：若需将视线中在左上方的物体移到视线中央，需持续向左上方挪动装片。

④左图是放大10 倍的物像，右图是放大20 倍时的物像放大倍数越大，视线越暗，视线越小（即察看到的物体数越少），但察看到的物体体积变大。

注意：由低倍镜转入高倍镜察看时，因视线变小（高倍物镜看到的不过低倍物镜视线的中心部分），需先将察看目标移至视线中央，而后再换上高倍物镜，又因视线变暗，需将视线调亮一些，可采用凹面反光镜或换上大光圈。

⑤ 视线中污点产生的原由：若察看时发现视线中有污点，可能是由目镜、物镜、载玻片上的污物造成。

可经过转动目镜，挪动载玻片，变换物镜镜头的方法来判断污物存在的地点。

2.光学显微镜的使用步骤：安置——对光——低倍镜察看——高倍镜察看——还原放回（ 1）取镜，安置增补知识，认识即可：取镜时，右手握镜臂，左手托镜座，免得破坏显微镜。

（ 2）对光安置时，显微镜应放在实验台的前面稍偏左，便于察看与记录。

①转动变换器，使低倍物镜瞄准通光孔；②使大光圈瞄准通光孔，左眼向目镜内凝视，右眼张开，同时转动反光镜，直至看到白亮的视线（ 3）低倍镜察看：①用压片夹压住标本，标本要正对通光孔中心。

光学显微镜技术知识点总结光学显微镜是一种利用光学原理来观察微小物体的仪器。

通过透射光和反射光的观察，可以放大对于人眼来说不可见的微小物体，以便进行观察和分析。

在生物学、医学、材料科学、化学等领域都有着重要的应用。

下面将对光学显微镜的相关知识进行总结。

1. 光学显微镜的工作原理光学显微镜是利用光学原理来观察微小物体的仪器。

其主要工作原理包括两个方面：放大和分辨。

首先是放大，即使微小物体在光学显微镜中被放大。

光学显微镜通过光学系统将物体投射到物镜上，经过物镜放大后进入目镜再放大，最终通过目镜形成一个虚像。

这样一次次放大，最终使得微小的物体在显微镜中呈现出清晰细节。

其次是分辨，光学显微镜分辨力的大小取决于光学系统的性能。

当两个微小物体距离足够近时，它们的像也会重叠在一起，无法区分。

通过改变显微镜的倍数、焦距等参数，可以提高光学显微镜的分辨力，使得更加微小的物体能够被清晰地观察到。

2. 光学显微镜的结构光学显微镜主要由以下几个部分组成：物镜、目镜、镜筒、载物平台、光源、调焦系统等。

物镜是光学显微镜的主要成像器件，它是显微镜最靠近样品的镜片。

物镜的主要作用是放大并成像，对于显微镜的放大倍数和分辨能力起着至关重要的作用。

目镜是显微镜的放大器，它起到放大物镜成像的作用，使其形成一个虚像。

通过观察目镜中的虚像，人们可以观察到被观察样品的细节。

镜筒是用来支撑目镜和物镜的部分，通常由金属或者塑料材料制成。

通过镜筒，物镜和目镜可以按照一定距离和角度进行固定，使得显微镜能够正常工作。

载物平台是用来支撑被观察样品的部分，通常由金属或者玻璃材料制成。

载物平台的位置可以通过显微镜的调焦系统来调整，使得样品能够处于适合观察的位置。

光源是用来提供光线的部分，通常包括反射光源和透射光源两种类型。

光源的光线是经过物镜成像后被目镜观察到的，因此对于显微镜的观察效果起着重要的作用。

调焦系统是用来调整物镜和目镜之间的距离，以便聚焦在被观察样品上。

第一篇组成人体的细胞第一章细胞形态的观察显微镜扩大了生物学研究的视野。

自从 18 世纪人们经过显微镜观察到细胞此后，生物学家利用各样各样的显微镜研究细胞的形态及其功能。

回顾细胞生物学的发展历程，我们能够看出显微镜的不断改良促进了细胞生物学的发展，而细胞生物学的发展对显微镜的性能又不断提出更高的要求。

第一节光学显微镜技术在细胞学研究中，光学显微镜技术（light microscopy ）发挥了重要作用。

当先人们将多种现代生物学技术、计算机技术融入光镜技术，使光学显微镜能显示出更细微、更清楚的细胞结构。

一、一般光学显微镜技术光学显微镜一般由光学部分、机械部分和照明部分组成，其中光学部分最为要点，它由目镜（ eyepiece）、物镜（ objective lens）组成。

一般光镜的最大辩白率为 0.2 μm。

由于动物细胞一般是无色与半透明的，所以样品在观察前要经过染色。

不同样的染料对某种细胞组分有特异的吸附，这样便能形成足够的反差以区分该种细胞组分。

如最常用的染色液苏木精对带负电荷的分子有较强亲和力，所以可揭穿出 DNA 、RNA 和酸性蛋白质在细胞中的分布；而伊红和美蓝能特异性地与不同样蛋白结合，从而显示出这些蛋白在细胞内的分布情况。

二、相差和微分干涉显微镜技术1932 年，德国物理学家Fritz Zernicke 研究发现光辉在经过生物标本时，除了波长和振幅的变化外，还有相位的差异，只有将这种相位差转变成振幅差时，才能被人眼分辨出来，即相差理论。

将这一理论应用于显微镜，从而发了然相差显微镜（phase contrast microscope）。

在实验中，常用的是倒置相差显微镜（inverted phase-contrast microscope），它的光源和聚光镜装在载物台上方，相差物镜在载物台下方，这样更便于观察培养瓶中的活细胞。

三、荧光显微镜技术荧光显微镜（ fluorescence microscope）是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到的各样颜色荧光的一种光学显微镜，它是研究特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具之一（图 1-1-1）。

薮枝螅Obeliatooth enamel formation flea tooth enamel formationpine staminate conecephalopodhuman epiglottis human tongue human epiglottis human tonguehuman fat human corpus luteumhuman whipworm (Trichuris trichiura). human whipworm(Trichuris trichiura)the crab megalops developmental stageLycra spandex fibers Lycra spandex fibersButterfly wingbryozoanCapsella embryo starfish。

以观察未经染色的标本和活细胞。

原理是用偏涉原种是利用偏光干涉原理的一种显微镜。

从偏振器出来的偏振光通过渥拉斯顿棱镜后，顿镜分成两束偏振光。

两束光分别在距离很近的两点上通过被检物体，两束光在相位上略有差别。

两路光通过物镜后，经第二组渥拉斯顿棱镜汇合。

在经过检偏镜后使它们震动方向一致而发生干涉。

从而形成较连续的明暗反差，Human erythrocytes HeLa cells海拉细胞Zygnema双星藻量研究的工具之一。

透射荧光显微镜：光源：高压汞灯或卤素灯。

聚光镜：使用暗场，使激发光聚光镜使激发光和荧光分离出来。

薄的标本观察，薄的标本比较适合。

Mi t i 微星藻Micrasterias荧光暗视野微相差分干涉特殊部件1.偏振器3.旋转载物台¾明反差。

几种特殊的光学显微镜（一）暗视野显微镜暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨0.004μm 以上的微粒的存在和运动。

因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。

暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。

暗视野显微镜的基本使用方法如下：1．安装暗视野聚光器（或用厚实的黑纸片制成遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方，也能得到暗视野效果）。

2．选用强光源，一般用显微镜灯照明，以防止直射光线进入物镜。

3．在聚光器和玻片之间加一滴香柏油，避免照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。

4．进行中心调节，即水平移动聚光器，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。

升降聚光器，将聚光镜的焦点（图2 中圆锥光束的顶点）对准待检物。

5．选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，按普通显微镜的方法操作。

（二）体视显微镜体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间影像，并具有立体感强、成像清晰宽阔、长工作距离（通常为110 mm）以及连续放大观看等特点。

生物学上常用于解剖过程中的实时观察（附图13）。

普通光学显微镜的光源为平行光，因而形成的是二维平面影像；而体视显微镜采用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束具有一定的夹角体视角（一般为 12o15o），因而能形成三维空间的立体图像。

体视显微镜与普通光学显微镜的使用方法相近，但更为便捷。

二者的主要区别在于：1.体视显微镜的镜检对象可不必制作成装片。

2.体视显微镜载物台直接固定在镜座上，并配有黑白双面板或玻璃板，操作者可根据镜检的对象和要求加以选择。

3. 体视显微镜的成像是正立的，便于解剖操作。

4. 体视显微镜的物镜仅一只，其放大倍数可通过旋转调节螺旋连续调节。

（三）荧光显微镜荧光显微镜是利用细胞内物质发射的荧光强度对其进行定性和定量研究的一种光学工具。

细胞内的荧光物质物质有两类，一类直接经紫外线照射后即可发荧光，如叶绿素等；另有一些物质本身不具这一性质，但如果以特定的荧光染料或荧光抗体染色，经紫外线照射后亦可发荧光。

显微镜的种类及其使用方法一、光学显微镜光学显微镜是一种精密的光学仪器。

当前使用的显微镜由一套透镜配合，因而可选择不同的放大倍数对物体的细微结构进行放大观察。

普通光学显微镜通常能将物体放大1500～2000 倍(最大的分辨力为0.2μm)。

（一）光学显微镜的基本结构（附图1）1．光学部分包括目镜、物镜、聚光器和光源等。

（1）目镜通常由两组透镜组成，上端的一组又称为“接目镜”，下端的则称为“场镜”。

两者之间或在场镜的下方装有视场光阑（金属环状装置），经物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面上，所以其上可加置目镜测微尺。

在目镜上方刻有放大倍数，如10×、20×等。

按照视场的大小，目镜可分为普通目镜和广角目镜。

有些显微镜的目镜上还附有视度调节机构，操作者可以对左右眼分别进行视度调整。

另有照相目镜(NFK)可用于拍摄。

（2）物镜由数组透镜组成，安装于转换器上，又称接物镜。

通常每台显微镜配备一套不同倍数的物镜，包括：①低倍物镜：指1×～6×；②中倍物镜：指6×～25×；③高倍物镜：指25×～63×；④油浸物镜：指90×～100×。

其中油浸物镜使用时需在物镜的下表面和盖玻片的上表面之间填充折射率为1.5 左右的液体（如香柏油等），它能显著地提高显微观察的分辨率。

其他物镜则直接使用。

观察过程中物镜的选择一般遵循由低到高的顺序，因为低倍镜的视野大，便于查找待检的具体部位。

显微镜的放大倍数，可粗略视为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。

（3）聚光器由聚光透镜和虹彩光圈组成，位于在载物台下方。

聚光透镜的功能是将光线聚焦于视场范围内；透镜组下方的虹彩光圈可开大缩小，以控制聚光器的通光范围，调节光的强度，影响成像的分辨力和反差。

使用时应根据观察目的，配合光源强度加以调节，得到最佳成像效果。

（4）光源较早的普通光学显微镜借助镜座上的反光镜，将自然光或灯光反射到聚光器透镜的中央作为镜检光源。