临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法汇总.
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PCR室标本处置规范简介
1. 血清/血浆等— -70℃ 2. 用于DNA测定的已纯化核酸样本— 4℃ 3. 用于RNA测定的已纯化核酸样本— -80℃ 4. 用乙醇沉淀的核酸样本— -20℃ 5. GITC处理的RNA标本在室温可保存7天
（五）标本的处理（核酸提取）
抑制物可能来源于： 标本本身（如血红素及其前体或降
解ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ物）。 核酸提取过程中残留的有机溶剂
（二）标本的稳定化处理
DNA：不需特殊稳定化处理。 RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使
DNA酶和RNA酶失活。
（三）标本的运送
可在常温下通过邮寄运送，如用于 DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于 RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。
未经稳定化处理，则必须速冻后，放 在干冰中运送。
（四）标本的贮存
PCR室标本处置规范简介
（一）标本的采集
临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、 血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。
EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素 抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。
玻璃器皿在使用前应高压处理，250°烘烤4小时 以上可使RNA酶永久性失活。
临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本 应尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。
（如酚、氯仿等）。 痰须液化处理。
PCR污染与对策
PCR污染分环境污染与反应液污染二种。 常见PCR污染源有三个：
第一、标本间的交叉污染； 第二、实验室中克隆质粒的污染； 第三、PCR产物的污染（Carryover）。
要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作：
（一）污染的预防 （二）污染源的追踪 （三）污染源的处理
。
（一）污染的预防
（五）标本的处理（核酸提取）
抑制物可能来源于： 标本本身（如血红素及其前体或降
解ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ物）。 核酸提取过程中残留的有机溶剂
（二）标本的稳定化处理
DNA：不需特殊稳定化处理。 RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使
DNA酶和RNA酶失活。
（三）标本的运送
可在常温下通过邮寄运送，如用于 DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于 RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。
未经稳定化处理，则必须速冻后，放 在干冰中运送。
（四）标本的贮存
PCR室标本处置规范简介
（一）标本的采集
临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、 血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。
EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素 抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。
玻璃器皿在使用前应高压处理，250°烘烤4小时 以上可使RNA酶永久性失活。
临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本 应尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。
（如酚、氯仿等）。 痰须液化处理。
PCR污染与对策
PCR污染分环境污染与反应液污染二种。 常见PCR污染源有三个：
第一、标本间的交叉污染； 第二、实验室中克隆质粒的污染； 第三、PCR产物的污染（Carryover）。
要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作：
（一）污染的预防 （二）污染源的追踪 （三）污染源的处理
。
（一）污染的预防
13!检验科PCR实验室标本采集、运送、接收、拒收及保存程序
标本采集、运送、接收、拒收及保存程序第一部分 HPV检测标本1 目的：保证HPV标本的质量。
2 范围：临床采集、运送、接收及实验操作人员。
3 内容：3.1 HPV标本采集标准操作流程3.1.1由经过宫颈脱落细胞标本采集专业培训的妇科医生用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈（取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）。
3.1.2将专用宫颈刷以适中力度接触于宫颈口，轻轻转动宫颈刷使其顺时针旋转3-5圈，并停留数秒钟。
3.1.3慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的专用标本管中，折断其刷柄，拧紧瓶盖。
3.2 HPV标本采集注意事项3.2.1月经期不可采集标本（减少给受检者的损伤）。
3.2.2月经正常妇女，在月经来潮后10～18天为最佳检查时间。
3.2.3不可在碘试验和醋酸试验之后采集样本（可能会抑制PCR反应）。
3.2.4取标本前48小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物（可能会抑制PCR反应）。
3.2.5取标本前48小时最好不要行性生活（可能出现一过性假阳性）。
3.2.6样本采集后，注意避免交叉污染。
3.3 HPV标本运送的标准操作流程所有临床标本在采集后立即送至实验室放在2~8℃保存。
3.4 HPV标本接收的标准操作流程3.4.1 HPV标本由实验室标本室进行接收，查对是否贴有标签、标本是否有洒落、破损，查对标本、申请单信息、刷卡信息是否相符，有异常情况的标本，视为拒收标本，应填写《标本拒收登记表》并根据情况处理。
3.4.2标本室实验人员对接收的标本进行编号，（此编号为样本唯一编号），然后与PCR实验室人员进行交接并实行严格登记制度。
3.4.3 PCR实验室人员对已接收的标本按正常标本、血性标本、粘液标本进行分类登记。
3.4.4 由指定人员对接收的标本进行常规涂片用显微镜查看是否有上皮细胞，细胞数量在每视野≥3个为可进行HPV检测的标本。
3.4.5对于特殊的样本（包括危重病人或急出报告的标本等），实行“首接”负责制，及时处理，并进行登记。
PCR实验室临床标本的处理核酸纯化程序
PCR实验室临床标本的处理核酸纯化程序
1.目的：标准临床标本的核酸提取、纯化等处理过程。
2.范围：进行PCR检测的临床标本。
3.职责：保证检测过程中，被检核酸不被破坏或损失。
4.程序：
4.1血清标本的DNA获取：
取待测样本血清100（11,分别加到离心管中；
参加50|il样本处理液，振荡混匀后，放入加热变性仪中，96°C处理10分钟。
取出离心管，12,000g离心lOmin,保存上清备用（如长期保存置于-20 °C）。
4.2血清标本的DNA/RNA的获取：
取50|ul待测血清，参加含吸附剂的离心管中；
每5分钟振摇一次，室温放置20分钟，10000转/分离心15秒钟；
弃上清，参加140以洗涤液，混悬，10000转/别离心15秒钟，尽量吸去上清；沉淀用140以重复洗涤液混悬，10000转/别离心15秒钟，尽量吸去上清；
沉淀用30|dl核酸洗脱液混悬,94°C加热5分钟，10000 转/分昌心15秒钟；
保存上清（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请立即进行后续步骤）。
4.3分泌物标本、痰液的DNA获取：
将分泌物（1ml）、尿液和培养液（400^1）参加1ml 离心管中，12000g离心5分钟；痰液需用lmol/1的NaOH 液化处理后再
离心。
向沉淀中参加50四1样本处理液，振荡混匀后，放入加热变性仪中，96°C处理10分钟；
取出离心管，12,000g离心lOmin,保存上清备用（如长期保存置于-20°C）o。
临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3
活检组织：检测DNA，2h内送检，检测RNA，立
即送检（30分钟内）
石蜡切片：24h内送检
标本保存&运输（病原体）
采血后不得长期存放于护士站过夜 病原DNA检测：不超过6h，2h内分离血浆/血清
短期保存：4℃
长期保存： -20℃
病原RNA检测：采血后尽快分离血浆&提取RNA
分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）
采样时要采到上皮细胞
充分洗涤拭子
切片组织标本采集
肿瘤组织>40%：直接提取核酸 肿瘤组织<40%：必须采用其它方式
标本保存&运输（人）
标本采集后不得存放于护士站过夜 血液标本/体液等：检测DNA，采集后1h内送检，
检测RNA，立即送检（30分钟内）
核酸提取的改良方法
旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法 玻璃粉吸附法 二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 微量全血核酸提取法 ：NaI 方法 其它方法：疏水性Immobilon-P膜 、全自动核酸纯 化仪
旋转离心柱（SPIN COLUMN）
属于硅吸附方法的一种。在原理上现行的旋转离心柱系统 通常可分为三个部分：第一部分是利用裂解液促使细胞破 碎，使细胞中的核酸释放出来；第二部分是把释放的核酸 特异地吸附在特定的硅载体上，当然这种载体只对核酸有 较强的亲和力和吸附力而对其它的生化组分如蛋白质、多 糖、脂类则不相亲和也不吸附；第三部分是把吸附在特定 载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。
不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑制物的敏感性不一样 。
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得靶DNA不能与 DNA聚合酶相互作用
即送检（30分钟内）
石蜡切片：24h内送检
标本保存&运输（病原体）
采血后不得长期存放于护士站过夜 病原DNA检测：不超过6h，2h内分离血浆/血清
短期保存：4℃
长期保存： -20℃
病原RNA检测：采血后尽快分离血浆&提取RNA
分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）
采样时要采到上皮细胞
充分洗涤拭子
切片组织标本采集
肿瘤组织>40%：直接提取核酸 肿瘤组织<40%：必须采用其它方式
标本保存&运输（人）
标本采集后不得存放于护士站过夜 血液标本/体液等：检测DNA，采集后1h内送检，
检测RNA，立即送检（30分钟内）
核酸提取的改良方法
旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法 玻璃粉吸附法 二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 微量全血核酸提取法 ：NaI 方法 其它方法：疏水性Immobilon-P膜 、全自动核酸纯 化仪
旋转离心柱（SPIN COLUMN）
属于硅吸附方法的一种。在原理上现行的旋转离心柱系统 通常可分为三个部分：第一部分是利用裂解液促使细胞破 碎，使细胞中的核酸释放出来；第二部分是把释放的核酸 特异地吸附在特定的硅载体上，当然这种载体只对核酸有 较强的亲和力和吸附力而对其它的生化组分如蛋白质、多 糖、脂类则不相亲和也不吸附；第三部分是把吸附在特定 载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。
不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑制物的敏感性不一样 。
IgG
IgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得靶DNA不能与 DNA聚合酶相互作用
5-临床标本采集、保存及核酸的提取-唐翠燕
• 总之，标本的收集及适当的预处理，对用 于PCR测定的核酸模板的成功提取，具有
决定作用。
二、核酸的提取
• 待检样品中的核酸是PCR反应的模板，由 于PCR具有高度的特异性和敏感性，一些 样品甚至简单到不需要任何处理便可用于 PCR。但是在大多数的情况下，还是需要 对样品作适当的处理才能用于PCR。
• 下列试剂是制备RNA的常规试剂:
• 裂解液：4mol/L GuSCN，25mmol/L柠檬 酸钠pH7.0，0.5%Sarkosyl， 100mmol/Lβ-巯基乙醇（用前加入）
• 饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1）
• 3mol/L NaAc pH5.2 • 无水乙醇 • 75%乙醇 • DEPC处理的无菌去离子水 • RNAasin(RNA酶抑制剂)
钟，待大块状物下沉后，取上清立即离 心，其后的沉淀即可用于DNA提取。如不 立即用于核酸提取，则需保存于-20℃下。
• 2.4 脓液
• 脓液的处理依情况而定，如用于分枝杆菌 （如结核杆菌）核酸测定的标本，粘稠的 脓液同痰标本的处理模式，先进行液化， 再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直 接离心，沉淀用生理盐水洗2～3次后，即 可用于DNA提取。
• 2.2 痰
• 痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌 DNA测定样本，由于痰中含有大量粘蛋白 和杂质，故在核酸提取时，需对样本进行 初步处理，用4%NaOH液化，需注意的 是，液化时不能加热，液化时间不能过 长。
• 液化标本如不立即用于核酸提取，可保存 于-20℃下。此外，对用于非结核杆菌如肺 炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬 浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大 块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉
5
• 2.3 75%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余 的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为 SDS在75%的乙醇中保持溶解状态，不与 DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种 去污剂,避免对以后PCR反应的影响。
临床样本的采集、运输和保存及核酸提取
2）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发 出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析（1-5ng）
EB与DNA的结合
纯度鉴定
紫外分光光度法：
在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA A260与A280之比 应在1.80 (1.60~1.80)，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高 于此值表明有RNA的残留量
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结 果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA 抗凝(严禁使用肝素)全血标本，抗凝后6小 时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽 快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2 周）保存可在-20℃下，较长期保存应在70℃下
肝素的作用机理
肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑 制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过 程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上
研究背景
二、核酸的提取
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分， 亦是手式操作的主要部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
（一）、提取核酸总的原则
保证核酸一级结构的完整性； 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应
日期、时间及相关临床信息
全血
以全血作为待测标本时，必须注意抗凝剂 的选择，一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠，不 可使用肝素
全血样本如用于DNA提取检测，可4℃下短 期保存,如用于RNA检测，则应在取血后， 尽快提取RNA
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序， 对测定影响不大
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤
临床基因扩增检验标本的采集、处理、保存和核酸提取方法
体液
• 体液标本包括胸水、腹水、脑脊液、
尿液等，可按水样标本的方式离心 处理。 • 沉淀标本的 保存-70 ̊C 。
组织
• 组织有新鲜组织块和石蜡切片。 • 新鲜组织块的处理，首先用生理盐水
洗2次，将组织研碎，加入生理盐水震 荡混匀，离心，取沉淀，用蛋白酶K消 化后，提取核酸。新鲜组织可保存于 50% 50 %乙醇中。 • 石蜡组织切片，需先用辛烷或二甲苯 脱蜡，蛋白酶K消化后，提取核酸。
标本的运送
• 原则 原则：标本采集后必须尽快送至实验室。 ：标本采集后必须尽快送至实验室。 • 需要转送的标本 需要转送的标本： ：用于RNA检测的标本，如果未
经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。 • 经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄 运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及 用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本，通 常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。
二、标本的前处理
• 标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测
成败的关键性步骤。 • 通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去 除不完全所致，抑制物可能来源于标本本 身（如血红素及其前体或降解产物）或核 酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯 仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应 步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核 酸的扩增测定。
RNA提取常用方法
• 经典方法：胍盐提取结合酚-氯仿
抽提。 • 商品化试剂盒。
三、靶核酸提取质量
• 纯化靶核酸的完整性：使用凝胶
电泳将样品的核酸提取物与核酸 marker比较
三、靶核酸提取质量
• 靶核酸的浓度：可在A260读数测定, • DNA浓度可按以下公式计算：
[DNA]=(A260 [DNA]=(A 260)*( )*(0 0.05μg/μl) *稀释倍数
临床PCR检验标本的采集处理保存及核酸提取方法共66页文档
临床PCBiblioteka 检验标本的采集处理保存及 核酸提取方法
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法共59页
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
Hale Waihona Puke 56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
Hale Waihona Puke 56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法66页PPT
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及 核酸提取方法
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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临床标本的采集、验收、保存及核酸的提取
石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡， 再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。
三、核酸的提取方法
待测标本中的核酸是PCR反应的模板，由 于PCR具有高度的特异性和敏感性,一些样本简 单到不需要任何处理即可用于PCR。但大多数 情况下还需对样本进行适当的处理，其目的为： 1）纯化样本中的核酸，除去杂质，2）使待扩 增的靶序列暴露及核酸模板得到浓缩3）有利于 评价扩增体系的灵感度。
3、RNA的提取
异硫氰胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取RNA方法。
（1）试剂 1) 裂解液：4mol /L GuSCN,25mmol /L柠檬酸钠 pH7.0,0.5% Sarkosyl,100mmol /Lβ-巯基乙醇 2) 饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1） 3mol /LNaAc pH5.2 3) 无水乙醇 4) 75%乙醇 5) DEPC处理的无菌去离子水 6) RNasin（RNA酶抑制剂）
经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管， 离心管等基本上无RNase，可以不经预处理直接 用于制备和储存RNA。实验室用的普通玻璃器皿 经常有RNase污染，使用前必须于180℃干烤8小 时以上，或用1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液 浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于 37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并 于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。 上述处理可除去器皿上痕量的DEPC以防DEPC通过 羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
对于全血标本制备单个核细胞主要有两个途 径：1）使用淋巴细胞分离液分离。2）使用红细 胞裂解液,裂解红细胞后经生理盐水洗涤可得单 个核细胞,单个核细胞如不提取核酸可保存于70℃以下。
三、核酸的提取方法
待测标本中的核酸是PCR反应的模板，由 于PCR具有高度的特异性和敏感性,一些样本简 单到不需要任何处理即可用于PCR。但大多数 情况下还需对样本进行适当的处理，其目的为： 1）纯化样本中的核酸，除去杂质，2）使待扩 增的靶序列暴露及核酸模板得到浓缩3）有利于 评价扩增体系的灵感度。
3、RNA的提取
异硫氰胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取RNA方法。
（1）试剂 1) 裂解液：4mol /L GuSCN,25mmol /L柠檬酸钠 pH7.0,0.5% Sarkosyl,100mmol /Lβ-巯基乙醇 2) 饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1） 3mol /LNaAc pH5.2 3) 无水乙醇 4) 75%乙醇 5) DEPC处理的无菌去离子水 6) RNasin（RNA酶抑制剂）
经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管， 离心管等基本上无RNase，可以不经预处理直接 用于制备和储存RNA。实验室用的普通玻璃器皿 经常有RNase污染，使用前必须于180℃干烤8小 时以上，或用1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液 浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其他用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于 37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并 于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。 上述处理可除去器皿上痕量的DEPC以防DEPC通过 羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
对于全血标本制备单个核细胞主要有两个途 径：1）使用淋巴细胞分离液分离。2）使用红细 胞裂解液,裂解红细胞后经生理盐水洗涤可得单 个核细胞,单个核细胞如不提取核酸可保存于70℃以下。
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法共66页文档
1
0
、
倚
南
窗
以
寄
傲
，
审
容
膝
之
易
安
。
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
文 家 。汉 族 ，东 晋 浔阳 柴桑 人 （今 江西 九江 ） 。曾 做过 几 年小 官， 后辞 官 回家 ，从 此 隐居 ，田 园生 活 是陶 渊明 诗 的主 要题 材， 相 关作 品有 《饮 酒 》 、 《 归 园 田 居 》 、 《 桃花 源 记 》 、 《 五 柳先 生 传 》 、 《 归 去来 兮 辞 》 等 。
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
临床PCR检验标本的采集、处理、保 存及核酸提取方法
6
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露
凝
无
游
氛
，
天
高
风
景
澈
。
7、翩翩新 来燕，双双入我庐 ，先巢故尚在，相 将还旧居。
8
、
，
于
我
若
浮
烟
。
9、 陶渊 明（ 约 365年 —427年 ），字 元亮， （又 一说名 潜，字 渊明 ）号五 柳先生 ，私 谥“靖 节”， 东晋 末期南 朝宋初 期诗 人、文 学家、 辞赋 家、散
样本采集及保存-PPT文档资料
取5ul用于PCR检测
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使 用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使 用肝素。
全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节
解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。
RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
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ຫໍສະໝຸດ 痰
痰属于分泌物 , 临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定 标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用 1 mol/L NaOH 或变 性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取 , 可保存于 -70℃ 下。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 ,充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清 加入裂解液50ul，60℃温育30min 90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物 取5ul用于PCR检测
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
痰标本处理的基本模式
通用模式
简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液 , 裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸 , 可保存 于-70℃下.
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%
痰属于分泌物 , 临床上常用作为结核杆菌 DNA 测定 标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时, 需对样本进行初步处理，即用 1 mol/L NaOH 或变 性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标 本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀， 促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉 淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取 , 可保存于 -70℃ 下。
沉淀标本的保存条件同样为-70℃。
体液
临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊
棉拭子
在使用 PCR 方法检测性病病原体时 , 临 床标本一般为棉拭子 , 可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置 5 ～ 10 分钟 , 待大块状物下沉后 , 取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。 如不立即用于核酸提取 , 则需保存于 70℃下.
脓液
脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核 杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本 的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取 DNA；水样的脓液则直接离心 ,沉淀用生理盐水 洗2～3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本 ,如过于粘 稠 , 则加入适量生理盐水 ,充分振荡后 , 静置 , 取上 清立即离心 , 沉淀用于 DNA 提取 ; 如为水样 , 则按 上述直接离心取沉淀即可。
标本运送
样本一经采集，则应尽可能快的送至检测 实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA 测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA 测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或 邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种 临床样本的运送条件作出相应的规定。
临床标本的处理和保存
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
50ul痰 6000g离心10分钟，弃上清 加入裂解液50ul，60℃温育30min 90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物 取5ul用于PCR检测
一定体积的痰 1.5倍体积的USP溶液,震荡30-40s 10-15ml蒸馏水，室温放置5-10min 5000g室温离心10-15min，弃上清 500ul无菌0.05%Tween80溶解或重悬
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织
血清（浆）
DNA测定，可按照一般的血清标本处理程 序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定 结果，可能有决定性影响。最好是使用 EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制， 且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝 后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则 需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期 （1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存 应在-70℃下。
过晚都可能会出现假阴性结果）
标本采集部位的准备（适度消毒） 标本的类型和采集量 （衣原体 上皮细胞） 采样质量的评价（评价方法：肉眼观察、显微镜下观察和化
学分析）
采样及运输容器（一次性无菌器材,防腐剂,抗凝剂） 标本采集中的防污染（一次性无菌容器，防止混入操作
者头发，表皮等，如玻璃容器要高压灭菌）
正确采集、运送、保存临床标本 的重要性
质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方 法之一
核酸提取的重要性
核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分
核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确 与否
临床PCR检验操作中最易出问题的环节
标本采集
标本采集时间对扩增检测结果的影响（过早或
痰标本处理的基本模式
通用模式
简单模式
痰标本处理通用模式
（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP） 溶液： 4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl） 50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5 25 mmol/L EDTA 0.5%十二烷基肌酸钠（Sarkosyl ） 0.1~0.2 mol/L β-巯基乙醇。 （2）0.05%Tween 80。 （3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)
全血
以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的 选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可 使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期 保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽 快提取RNA 。
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主 要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液 分离制备；二是使用红细胞裂解液 , 裂解全 血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得 到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸 , 可保存 于-70℃下.
临床PCR检验标本的采集、处 理、保存及核酸提取方法
江西省肿瘤医院 陈文学
检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。 2007年，这位专家又进行了类似的统计，结果 显示，检验前期的误差发生率仍高达61.9%