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原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。
b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。
二、实验原理：详见讨论。
三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。
四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。
ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。
iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。
iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。
500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。
v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。
vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。
b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。
ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。
iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。
2.1．1植物细胞工程的基本技术--------植物体细胞融合技术学习目标1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。
2、尝试进行植物组织培养。
学习重点1、植物组织培养的原理和过程2、植物体细胞杂交的原理一、 植物体细胞杂交技术1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。
2．过程 不同的植物体细胞果胶酶纤维素酶−−−→−不同细胞原生质体−−−→−人工诱导原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。
3．植物体细胞杂交步骤：(1)去掉细胞壁，分离出有活力的 ，目前最常用的去细胞壁的方法是酶解法，也就是在温和条件下用 、 去除植物细胞的细胞壁。
(2)不同植物体细胞原生质体融合，必须通过 法和 法来诱导融合。
方法有： 等促使原生质体融合。
化学法是用(PEG)作为诱导剂来诱导融合。
融合后再生出 。
(3)用植物组织培养方法进行培育，可得到杂种植株。
如图在此过程中需要注意的问题有：①植物体细胞杂交过程中，植物体细胞融合所依据的生物学原理是 ；植物组织培养的理论基础是 。
②体细胞融合成功以后，既有AB 型杂种细胞，还能形成AA 型和BB 型两种融合细胞，但只有AB 型细胞是植物体细胞杂交所形成的杂种细胞，因此在杂种细胞形成后还应有一个 过程。
③目前常用的去除细胞壁的方法是 ，保证了原生质体活性。
植物体细胞融合完成的标志是新细胞壁的形成。
④植物体细胞杂交过程仍以植物组织培养为前提，通过植物组织培养完成杂种植株的培育过程。
⑤植物体细胞杂交的最大突破是克服远缘杂交不亲和的障碍，但是目前仍有许多理论和技术问题没有解决，离推广应用仍有一定距离。
【当堂检测】 1．不能．．用于人工诱导原生质体融合的方法是 （ ） A ．振动 B ．电刺激 C ．PEG D ．重压 2．与传统的有性杂交法相比，植物体细胞杂交的最大优点是 （ ） A ．可使两个亲本的优良性状组合到一起 B ．可以克服远缘杂交不亲和的障碍 C ．可以培育出高产性状明显的新品种 D ．可以降低生成成本，提高接济效益3．植物体细胞杂交的过程实质是 （ ）A ．细胞质融合的过程B ．细胞核融合的过程C ．细胞膜融合的过程D ．细胞原生质体融合的过程 4．原生质体融合后，需诱导产生细胞壁，参与此过程的细胞器是 （ ） A ．叶绿体、高尔基体 B ．线粒体、高尔基体 C ．叶绿体、线粒体 D ．线粒体、内质网 5．高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误．．的是 （ ）A ．该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的B ．该愈伤组织的细胞没有全能性C ．该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞D ．该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构 6．以下不能．．说明细胞具有全能性的实验是 （ ） A ．胡萝卜韧皮部细胞培育出植株 B ．紫色糯性玉米种子培育出植株 C ．转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株 D ．番茄与马铃薯体细胞杂交后培育出植株7．植物组织培养过程中的脱分化是指 （ ）A ．植物体的分生组织通过细胞分裂产生新细胞B ．未成熟的种子经过长期培养，培养出幼苗的过程C ．植物的器官、组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程D ．取植物的枝芽培育成一株新植物的过程8．在脱分化形成愈伤组织的过程中，下列各项为非．必要条件的是（）A．培养基需要消毒灭菌B．给予适宜的温度C．给予充足的光照D．给予适宜的养料和激素9．通过植物体细胞杂交，获得一个杂种植株需要的步骤是（）A．分离原生质体→诱导原生质体融合→组织培养→得到杂种植物B．分离原生质体→原生质体直接融合→组织培养→杂种植株C．获取细胞→原生质体融合→组织培养→杂种植株D．获取细胞→原生质体直接融合→组织培养→杂种植株10．胚状体是在植物组织培养的哪一阶段上获得的（）A．愈伤组织B．再分化C．形成完整植株D．取离体组织11．利用植物的茎尖、茎段、花药、花粉等，在无菌的条件下，放在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使它发育成完整的植株。
原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。
原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功。
2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。
（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
植物细胞工程实验一 培养基母液的制备一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。
当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。
二、实验器材电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。
三、实验药品NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。
四、实验步骤每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制表1 MS 培养基大量元素母液制备序号 药品名称培养基浓度（mg/L ）扩大20称量(mg)备注1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml2 KNO3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 44004 MgSO 4·7H 2O 370 37005 KH 2PO 41701700各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。
后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。
第1篇一、实验目的1. 理解植物细胞的基本结构和功能；2. 通过模型制作，加深对植物细胞结构的认识；3. 培养学生的动手操作能力和团队协作精神。
二、实验原理植物细胞是构成植物体的基本单位，具有典型的真核细胞结构。
细胞膜是细胞的边界，控制物质进出；细胞壁位于细胞膜外，起保护和支持作用；细胞质含有各种细胞器，如叶绿体、线粒体、内质网等，负责细胞的生命活动；细胞核是遗传信息的储存和复制中心。
三、实验用品1. 模型材料：PVC管、透明胶带、剪刀、彩色卡纸、彩色笔、透明胶、泡沫塑料、橡皮筋等；2. 实验工具：尺子、直尺、铅笔、量角器等；3. 实验药品：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、叶绿体、线粒体、内质网等模型材料。
四、实验步骤1. 制作细胞壁：取一段PVC管，剪成适当长度，用透明胶带封口，作为细胞壁；2. 制作细胞膜：取一段透明胶带，剪成适当宽度，包裹在细胞壁上，模拟细胞膜；3. 制作细胞质：取一段泡沫塑料，剪成适当大小，贴在细胞膜上，模拟细胞质；4. 制作细胞核：取一段彩色卡纸，剪成适当形状，涂上黑色，贴在细胞质上，模拟细胞核；5. 制作叶绿体、线粒体、内质网等细胞器：分别取不同颜色的彩色卡纸，剪成适当形状，贴在细胞质上，模拟各种细胞器；6. 制作液泡：取一段透明胶带，剪成适当宽度，包裹在细胞壁上，模拟液泡；7. 组装细胞模型：将所有部件组装在一起，形成一个完整的植物细胞模型。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过制作植物细胞模型，我们成功模拟了植物细胞的基本结构和功能，包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、液泡、叶绿体、线粒体、内质网等；2. 实验分析：通过本次实验，我们加深了对植物细胞结构的认识，了解了各种细胞器的功能和分布。
同时，培养了我们的动手操作能力和团队协作精神。
六、实验总结本次实验通过制作植物细胞模型，让我们更加直观地了解了植物细胞的结构和功能。
在实验过程中，我们学会了如何利用实验用品和工具制作模型，提高了自己的动手操作能力。
第1篇一、实验背景植物细胞作为生物学研究的重要对象，其结构、功能和生命周期的研究对于理解生命现象具有重要意义。
本实验旨在通过观察植物细胞的结构，了解其有丝分裂的过程，并分析实验过程中遇到的问题及改进措施。
二、实验目的1. 观察植物细胞的基本结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、叶绿体、液泡和线粒体等。
2. 学习植物细胞有丝分裂的过程，观察分裂各期的特点。
3. 分析实验过程中遇到的问题，并提出改进措施。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱根尖、菠菜叶、辣椒表皮细胞、显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、盐酸、酒精、碘液等。
2. 实验仪器：显微镜、烧杯、试管、酒精灯、镊子、剪刀等。
四、实验方法与步骤1. 植物细胞临时装片制作a. 将洋葱根尖、菠菜叶、辣椒表皮细胞等材料切成薄片。
b. 将薄片置于载玻片上，用吸水纸吸去多余水分。
c. 滴加适量盐酸和酒精，进行解离。
d. 用吸水纸吸去解离液，滴加碘液进行染色。
e. 盖上盖玻片，用显微镜观察。
2. 观察植物细胞有丝分裂过程a. 观察洋葱根尖压片，找到分裂相细胞。
b. 观察分裂各期的特点，包括间期、前期、中期、后期和末期。
c. 比较洋葱根尖细胞和马蛔虫受精卵细胞的有丝分裂过程。
五、实验结果与分析1. 植物细胞基本结构观察通过观察洋葱根尖压片，发现植物细胞具有以下基本结构：a. 细胞壁：位于细胞最外层，起到支持和保护作用。
b. 细胞膜：位于细胞壁内侧，控制物质的进出。
c. 细胞质：液态的，可以流动，含有各种细胞器。
d. 细胞核：位于细胞中央，贮存和传递遗传信息。
e. 叶绿体：位于细胞质中，进行光合作用的场所。
f. 液泡：位于细胞质中，含有细胞液，维持细胞渗透压。
g. 线粒体：位于细胞质中，进行呼吸作用的场所。
2. 植物细胞有丝分裂过程观察通过观察洋葱根尖压片，发现植物细胞有丝分裂过程包括以下五个阶段：a. 间期：细胞进行生长、代谢和准备分裂。
b. 前期：染色体开始凝缩，核膜逐渐消失，出现纺锤体。
【实验目的】1.了解动物细胞融合的常用方法2.学习化学融合和电融合的基本操作3.观察动物细胞融合过程中的行为和变化【实验原理】1.病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。
这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可以介导病毒同宿主细胞融合，也可以介导细胞与细胞的融合。
用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2.化学诱导融合很多化学试剂都能诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG），二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂，磷脂酰丝氨酸等。
这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。
在恢复的过程中相接处的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。
化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。
PEG是被广泛使用的化学融合剂。
3.电击诱导融合包括电诱导、激光诱导等。
其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力作用，两细胞发生融合。
电诱导方法具有融合过程易控制，融合概率高，作用机制明确，可重复性高等优点。
【实验材料】1.材料鸡血红细胞2.试剂 50%PEG、0.85%氯化钠溶液、GKN缓冲溶液3.器材倒置显微镜、离心机、量筒、注射器、载玻片、盖玻片、离心管等【实验步骤】1.取离心管，加入冷藏的鸡血1ml，加入4ml 0.85%氯化钠溶液，摇匀2.将离心管放入离心机中，以1000-1200r/min的速度离心5分钟左右。
取出离心管，弃掉上清液，再加入4ml氯化钠溶液，重复以上操作。
3.取离心管，弃掉上清液后，按照红细胞沉积的体积，加入1-2mlGKN溶液，摇匀。
4.取以上溶液1ml，加入3mlGKN溶液，再次摇匀5.取以上溶液1ml，加入0.5mlPEG，先静置1-2min，再将溶液摇匀后，静置1-2min。
细胞融合实验一、实验目的：1、了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2、了解溶血现象及其发生机制。
3、了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
二、实验原理：细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择性屏障。
它是一种半透膜，可选择性进行物质进出细胞。
各种物质进出细胞的方式是不同的。
水是生物界最普遍的溶剂，通透性高（肾小管、肠上皮、植物根细胞更高）水快速穿膜之谜：水孔蛋白水分子可以由渗透压低的一侧向渗透压高的一侧扩散，这种现象称为渗透。
将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。
因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。
本实验选用红细胞作为细胞膜通透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。
溶血（Hemolysis）红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，简称溶血。
可由多种理化因素和毒素引起。
在体外，如低渗溶液、机械性强力振荡、突然低温冷冻（-20℃～—25℃）或突然化冻、过酸或过碱，以及酒精、乙醚、皂碱、胆碱盐等均可引起溶血。
哺乳动物血浆的等渗溶液为0.9%NaCl 溶液，红细胞在低于0.45%NaCl 溶液中，因水渗入，红细胞膨胀而破裂，血红蛋白逸出。
在体内，溶血可为溶血性细菌或某些蛇毒侵入、抗原-抗体反应（如输入配血不合的血液）、各种机械性损伤、红细胞内在（膜、酶）缺陷、某些药物等引起。
溶血性细菌，如某些溶血性链球菌和产气荚膜杆菌可导致败血症。
疟原虫破坏红细胞和某些溶血性蛇毒含卵磷脂酶，使血浆或红细胞的卵磷脂转变为溶血卵磷脂，使红细胞膜分解。
物质穿膜运动符合物理化学规律：物质扩散速率除依赖于浓度梯度的大小外，还同物质的油水分配系数和分子大小有关。
