稳定细胞株筛选流程

筛选细胞株的方法
细胞株筛选是利用细胞的生理特性，对各种变异体的细胞进行分类，最终得到满足要求的细胞株的方法。

一般细胞株的筛选方法有以下几种：
1、分子筛选：此方法利用分子生物学技术，将染色体上的变异体筛选出来，进行基因调控。

2、形态学筛选：此方法可以通过宏观形态变化，观察细胞株的外在特征，判断细胞株是否是想要的。

3、细胞行为学筛选：此方法可以通过观察细胞株的活动性、繁殖能力等指标，来过滤较低的细胞株。

4、生物反应筛选：此方法利用药物或其他物质对细胞株产生的影响，来判断该细胞株是否有较高抗性或特殊反应性，筛选出较高的细胞株。

5、酶学筛选：此方法利用一些特殊的酶反应，如乳糖酶分解、腺病毒应激反应等，来筛选出满足要求的细胞株。

6、生物免疫筛选：此方法利用抗原抗体反应，观察细胞完整性及能否活动，是否具有特殊的信号转导能力等，从而判断细胞株的优劣。

最后，需要指出的是，各种细胞筛选方法都有各自的优缺点，在实际筛选中，可以根据每个筛选项目的特性，结合多种筛选方法，从而得到满足要求的细胞株。

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稳定细胞株筛选流程稳定细胞株筛选的流程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：首先，需要构建表达目的基因的质粒载体。

该载体通常含有启动子、目的基因和选择标记基因等元件。

启动子可以控制基因的转录水平，目的基因可以是感兴趣的基因或报告基因，选择标记基因则用于筛选稳定细胞株。

2.细胞转染：将构建好的表达载体导入目标细胞中。

转染可以采用多种方法，如化学法、电穿孔法和病毒转染法等。

转染后，目标细胞中的外源基因片段将被导入细胞质。

3.选择压力：为了筛选稳定细胞株，需要加入选择压力。

选择压力可以是抗生素、毒素或药物等，只有在压力下能够存活的细胞才能继续生长和繁殖。

4.单克隆细胞筛选：经过选择压力后，细胞群体中可能存在不同的细胞克隆。

为了获得单克隆稳定细胞株，需要进行单克隆细胞筛选。

常用的方法有稀释分选法、限稀稀释法和流式细胞术等。

5.鉴定稳定细胞株：筛选出的单克隆细胞株需要进行进一步的鉴定。

可以通过PCR、Western blot、荧光显微镜观察等方法验证目的基因的稳定表达。

总结起来，稳定细胞株筛选的流程包括构建表达载体、细胞转染、选择压力、单克隆细胞筛选和鉴定稳定细胞株等步骤。

这个流程能够筛选出稳定地表达目的基因的细胞株，为基因功能研究和药物开发提供可靠的实验模型。

在实际操作中，稳定细胞株筛选的流程可能会因实验目的和细胞类型的不同而有所调整。

但总体而言，以上步骤是筛选稳定细胞株的基本流程。

通过稳定细胞株的筛选，可以获得稳定表达目的基因的细胞株，从而开展进一步的实验和研究。

稳定细胞株的筛选是基因功能研究和药物开发中必不可少的一步。

通过稳定细胞株的筛选，可以实现对目的基因的稳定表达，为研究基因功能和开发新药物提供有力支持。

因此，掌握稳定细胞株筛选的流程和方法对于科研人员和药物开发人员具有重要意义。

稳定株构建 FAQ转自微博思路迪慢病毒包装1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。

这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。

而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。

这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。

稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。

在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。

稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。

稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。

因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。

质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。

不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。

2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？∙答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：∙1)，外源插入片段的拷贝数。

多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。

∙2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。

∙3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。

最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。

∙4)，整合后的稳定性。

不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。

∙5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。

因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。

稳定细胞名词解释
稳定细胞（stable cells)又称静止细胞（quiescent cell)。

在生理情况下，这类细胞增殖细胞不明显，在细胞增殖周期中处于静止（G0），但受到组织损伤的刺激时，则进入DNA合成前期（G1），表现出较强的再生能力。

稳定细胞株筛选方法
1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系：
对大多数细胞转染效率较低。

对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。

但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。

另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。

2、病毒感染筛选稳定细胞株：
病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。

用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。

稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。

对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。

例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。

用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。

对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。

不同批次的药物活性有一定差异。

因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。

筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。

第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。

2、用G418筛选处理5-10天。

每2天观察细胞一次。

每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。

直到得到最佳浓度。

3、用嘌呤霉素处理4-7天。

每2天跟换新的有抗生素的培养基。

耐药细胞株的筛选
一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。

另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。

脂质体转染：在转染24小时后，消化XXX细胞并计数。

将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。

待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。

筛选时间和浓度视细胞而定。

一般G418（Geneticin,遗传霉素）作用一个星期，嘌呤霉素作用2-3天。

脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。

慢病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。

包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。

包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。

转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。

筛选单克隆细胞株流程英文回答：Screening for monoclonal cell lines is an essential process in biotechnology and biomedical research. It involves the identification and selection of individual cells that produce a specific protein or exhibit a desired phenotype. This process is crucial for the development of therapeutic antibodies, recombinant proteins, and cell-based assays.To begin the screening process, I first culture a heterogeneous population of cells, such as hybridoma cells or transfected cells. These cells are typically derived from a parent cell line and express a diverse range of proteins or phenotypes. I then treat the cells with a selective agent or apply a specific assay to identify the desired cells.One common method for screening monoclonal cell linesis fluorescence-activated cell sorting (FACS). In this technique, cells are labeled with fluorescently tagged antibodies or markers that specifically bind to the protein of interest. The cells are then passed through a flow cytometer, which detects and sorts the labeled cells based on their fluorescence intensity. The sorted cells can be collected and further analyzed or expanded for downstream applications.Another approach for screening monoclonal cell lines is limiting dilution. This method involves serially diluting the cell population to a low density, such that each wellin a microplate contains only one cell. The plates are then incubated, and wells with single-cell colonies areidentified and expanded. These colonies can be screened for the desired protein expression or phenotype using immunostaining, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), or other specific assays.In addition to these methods, genetic screening techniques such as CRISPR/Cas9-mediated knockout or knock-in can be employed to generate monoclonal cell lines withspecific genetic modifications. These genetically modified cells can then be screened using molecular techniques like polymerase chain reaction (PCR) or sequencing to confirm the desired genetic alteration.Once the monoclonal cell lines are identified and selected, they can be further characterized and validated for their stability, productivity, and functionality. This may involve assessing their growth characteristics, protein expression levels, and functional assays specific to the desired phenotype.Overall, the process of screening for monoclonal cell lines is a crucial step in biotechnology and biomedical research. It requires careful planning, optimization, and validation to ensure the selection of high-quality cell lines that meet the desired criteria.中文回答：筛选单克隆细胞株是生物技术和生物医学研究中的一个重要过程。

细胞株构建cld细胞株构建是生物学研究中不可或缺的一环，它为科学家提供了大量可重复使用的细胞系。

细胞株构建的过程包括选择细胞来源、细胞分离与培养、筛选与扩增细胞株以及检测与鉴定细胞株。

在这篇文章中，我们将详细介绍细胞株构建的流程及其相关注意事项，以期为广大研究者提供实用的参考。

一、细胞株构建简介细胞株构建是指从原始细胞中分离出具有特定性质的细胞系，这些细胞系可以在体外持续传代并保持稳定的生长特性。

细胞株在生物医学研究、药物筛选和疾病模型等领域具有广泛的应用。

二、细胞株构建流程1.选择细胞来源细胞株构建的第一步是选择合适的细胞来源。

细胞来源可以是正常组织、肿瘤组织、细胞系等。

选择时需考虑研究目的、实验需求以及细胞来源的稳定性等因素。

2.细胞分离与培养细胞分离是将细胞从组织中脱离并进入培养液的过程。

常用的分离方法有消化法、刮擦法等。

细胞培养则是在适当条件下，使细胞在体外继续生长和繁殖。

培养过程中需要密切关注细胞密度、营养代谢、pH值、温度等因素。

3.筛选与扩增细胞株筛选细胞株是将具有特定性质的细胞挑选出来的过程。

常用的筛选方法有抗生素筛选、荧光标记筛选等。

筛选出目标细胞后，需进行扩增以获得足够数量的细胞株。

扩增方法包括传代培养、细胞悬浮培养等。

4.检测与鉴定细胞株检测细胞株的特性和鉴定细胞株的纯度是构建细胞株的关键环节。

常用的检测方法有形态观察、生长曲线测定、细胞周期分析等。

鉴定细胞株的纯度可采用荧光染色、免疫组化等方法。

三、细胞株构建注意事项1.无菌操作：细胞株构建过程中需严格遵循无菌操作规程，防止外源性污染。

2.细胞密度控制：适当控制细胞密度，避免细胞过度拥挤或过度稀释。

3.营养代谢调控：根据细胞类型提供适当的营养代谢物质，如糖、氨基酸、脂肪酸等。

4.避免细胞接触抑制：适时更换培养皿或采用悬浮培养，以避免细胞接触抑制现象。

5.观察细胞状态：定期观察细胞形态和生长状况，及时发现并处理异常情况。

四、应用与展望随着生物科技的发展，细胞株构建在多个领域发挥着重要作用。

稳定过表达细胞株的鉴定
鉴定稳定过表达细胞株是确保实验结果准确可靠的重要步骤。

通常，稳定过表达细胞株被构建来表达外源基因，这些基因可以编码蛋白质、RNA或其他生物分子。

在构建过程中，细胞株被转染并在筛选过程中选出表达外源基因的细胞株。

然而，仅仅检测外源基因的表达并不足以证明细胞株是稳定的。

为了鉴定稳定过表达细胞株，需要进行以下步骤：
1. 稳定性测试：通过连续培养稳定过表达细胞株多代，观察外源基因表达是否稳定。

通常，细胞株需要在稳定条件下培养至少20代，以确保表达稳定。

2. 比较分析：与野生型细胞株进行比较分析，例如测量细胞增殖速率、形态学、细胞周期等。

如果稳定过表达细胞株与野生型细胞株存在显著差异，则该细胞株可能存在异常。

3. 稳定性标记：将可观察的标记或标签引入到外源基因表达系统中，以确定细胞株是否稳定。

例如，可以将荧光蛋白或其他荧光标记引入到外源基因中，观察标记的表达是否稳定。

通过以上步骤鉴定稳定过表达细胞株，可以确保实验结果的准确性和可靠性。

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G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418 浓度：1、由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418 有效成分的比重不同，一般1g 的粉剂中有效的G418 含量大约为。

2、G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418 对细菌和真核细胞都起作用。

neo 就是编码3 ‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418 。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4 ，G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418 的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000 个细胞/ml ，在100ug/ml~1mg/ml 的G418 浓度范围内进行筛选，选择出在10~14 天内使细胞全部死亡的最低G418 浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x10 6个细胞电转后，分别接种1/4000 ，1/1000 ，1/300 细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300 细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000 孔内应有4% 的汇合度。

筛选9 天后，观察1/4000 孔内有两三个克隆，按比例1/300 孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染之后才开24 小时始加G418 筛选。

质粒稳转株的建立与筛选
1基因质粒稳定转化
基因质粒稳定转换是指将一段含有一定基因序列文件经过质粒表达转化到潜在性受体（宿主）细胞中，使其具有持续的表达能力和可存活在细胞内的特性的技术研究。

这种技术对研究生物工程，分子生物学，微生物学，转基因以及其他基因工程技术具有十分重要的意义。

2质粒稳转建立
基因质粒稳转转中，质粒构建占据着很重要的地位。

基因工程研究中，一般由DNA克隆实现。

由宿主和转变机物质和非机物构成的酶体系统对DNA质粒的合成，提供了一种把一段DNA片段文件转化到宿主细胞中的有效途径。

由于质粒大部分处于稳定态，因此适合作为转染的媒介。

3质粒稳定筛选
针对不同的实验目的，建立的质粒稳定转换需要经过正确的筛选才能实现所期望的效果。

常用的基因技术有药物筛选法，荧光素酶报告基因筛选法，DNA粘合剂筛选等方法。

通过上述基本方法，筛选出有转染能力，高表达稳定性和抗药性良好的细胞株。

因此，基因质粒稳定转换是一种有效的转染技术，可以有效降低实验成本和时间节省。

不仅可以有效的把DNA片段文件转化到宿主细
胞中，还可以通过不同的筛选方法筛选出有效的转染株，为实验提供了可靠的基础。

嘌呤霉素（Puromycin）筛选稳定细胞株的步骤及方法Puromycin 是来源于Streptomyces alboniger 的一种氨基核苷类抗生素，中文名为嘌呤霉素，常用于筛选能够表达pac 基因（puror）的细胞。

pac 基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果该基因表达，就会对嘌呤霉素产生抗性，这一特性目前普遍应用于筛选表达pac 基因的哺乳动物稳定细胞株。

目前，很多商业化的慢病毒载体都携带pac 基因(一般在质粒图谱上标记为puror)，可以利用嘌呤霉素的筛选，得到特定基因稳定表达的细胞株。

嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac 基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。

Puromycin 不仅能用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。

Puromycin 的作用特点是快速作用于细胞，一般2 天内可以杀死99%的不表达pac 基因的细胞。

本产品浓度为10mg/ml，已过滤除菌，可以直接用于细胞培养。

使用说明：一、推荐工作浓度：推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为1-10μg/ml，但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。

二、嘌呤霉素剂量反应曲线的确定( 以shRNA ）转染或者慢病毒感染为例）：：嘌呤霉素的有效筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。

为了筛选到稳定表达的shRNA或感染病毒的细胞株，确定杀死未转染/感染细胞的最低浓度嘌呤霉素非常重要。

对于初次使用的细胞，一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)。

1、第一天：24 孔板中以5~8×10 4 cells/孔的密度接种细胞，接种够量的孔以便进行后续的剂量梯度实验。

细胞培养箱内培养过夜。

2、第二天：在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基，该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml 等)，更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。

稳转细胞系筛选注意事项一、实验步骤1. 实验前准备：实验前要穿戴好防护服、手套、口罩等防护用品，确保实验室安全。

2. 细胞复苏：将冷冻保存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动冻存管，使其迅速融化。

然后打开冻存管，将细胞悬液转移至15ml离心管中，加入适量培养基，吹匀后离心。

3. 细胞计数：将离心后的细胞悬液加入血球计数板，在显微镜下观察并计数。

4. 细胞接种：将细胞悬液接种到培养皿中，放入培养箱中培养。

5. 药物处理：根据实验需要，向培养皿中加入不同浓度的药物，观察细胞的生长情况。

6. 细胞收获：当细胞生长到一定数量时，用胰酶消化并收集细胞。

7. 基因检测：将收集的细胞进行基因检测，验证稳转细胞系的筛选是否成功。

8. 数据分析：对实验数据进行统计分析，得出结论。

二、注意事项1. 实验操作过程中要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。

2. 在处理细胞时要轻柔操作，避免对细胞造成损伤。

3. 在加入药物时要准确控制浓度和作用时间，避免对细胞造成毒性作用。

4. 在进行基因检测时要确保引物和探针的特异性，避免假阳性或假阴性结果。

5. 在数据分析时要考虑到实验的重复性和可重复性，避免误差和偏差。

6. 在实验过程中要保持实验室的清洁卫生，及时清理废弃物和垃圾。

7. 在实验结束后要及时记录实验数据和结果，并进行总结和归纳。

8. 在进行稳转细胞系筛选时要注意选择合适的筛选标记物，以确保筛选结果的准确性和可靠性。

9. 在进行基因检测时要注意选择合适的检测方法和技术，以确保检测结果的准确性和可靠性。

10. 在进行稳转细胞系筛选时要注意控制细胞的生长条件和环境因素，以确保细胞的生长和表型特征的稳定性。

G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。

外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。

极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。

由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。

一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。

是稳定转染最常用的选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。

Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。

其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。

但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。

G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。

有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。

但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。

neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。

理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。

筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。

所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。

随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。

生物药是利用生物技术生产的药物，具有高效、低副作用等优点，受到越来越多的关注和重视。

而生物药的生产与监管也是非常重要的环节，其中细胞株的监管和筛选尤为关键。

本文将重点讨论生物药生产细胞株监管要求与筛选要点。

一、生物药生产细胞株监管要求1. 严格遵循相关法规法规生物药生产细胞株监管要求首先要符合国家相关的法规法规，比如《生物制品质量管理规范》等。

生物药生产企业应严格按照法规法规要求进行生物制品质量管理，确保生产过程和产品质量的合规性。

2. 建立健全的质量管理体系生物药生产企业要建立健全的质量管理体系，包括质量管理制度、质量控制标准、质量控制记录等，确保生产过程的合规性和产品质量的稳定性。

要对细胞株的来源、鉴定、保存等进行详细的记录和管理。

3. 进行定期的审计和验证生物药生产企业应定期进行内部和外部的审计和验证，确保质量管理体系的有效性和合规性。

内部审计主要包括对生产过程和质量管理体系的自查，外部审计主要是由相关监管部门进行的审计。

二、生物药生产细胞株筛选要点1. 细胞株的来源和鉴定生物药生产企业在筛选细胞株时，首先要确定细胞株的来源，确保细胞株的合法性和纯度。

要进行细胞株的鉴定，确保细胞株的身份和稳定性。

2. 细胞株的保存和传代生物药生产企业应建立细胞株的保存制度，确保细胞株的保存完整性和稳定性。

要建立细胞株的传代制度，确保细胞株的稳定性和一致性。

3. 细胞株的生物学特性在筛选细胞株时，生物药生产企业还需要对细胞株的生物学特性进行评价，包括细胞生长特性、代谢特性、表达特性等，确保细胞株适合用于生物药的生产。

4. 细胞株的安全性评估生物药生产企业还需要对细胞株的安全性进行评估，包括对细胞株的致病性、致突变性等进行评估，确保细胞株符合相关的安全性要求。

生物药生产细胞株监管要求包括严格遵循相关法规法规、建立健全的质量管理体系，进行定期的审计和验证；生物药生产细胞株筛选要点包括细胞株的来源和鉴定、细胞株的保存和传代、细胞株的生物学特性、细胞株的安全性评估，为确保生物药生产过程的合规性和产品质量的稳定性提供了重要的指导意义。

稳定细胞株筛选实验本实验使用过表达human Oct-4—EGFP的慢病毒感染HeLa细胞。

该病毒的表达框为pLenti—CMV-Oct—4-EGFP-3FLAG—PGK—Puro： CMV启动子驱动Oct-4—EGFP基因的表达，同时由PGK启动子驱动puromycin抗性基因的表达。

在感染HeLa细胞72h后，通过加入并维持2μg/μL的puromycin杀死未被有效感染的细胞。

从而在puromycin药物的维持下最终获得Oct-4-EGFP稳定表达的混合稳定株。

关键词:Oct—4—EGFP,稳定细胞株，HeLa，慢病毒一、实验原理外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达(永久表达）.前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。

后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因。

建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。

最常用的抗性标记基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素(puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选.传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选，最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株, 该方法阳性率低，周期长，工作量大。

慢病毒是一种RNA病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。

利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。

筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白,用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。

[晶莱生物]二、实验目的通过慢病毒感染配合药物筛选的方法获得稳定表达Oct-4-EGFP的HeLa稳定细胞株。