筛选细胞株的方法

稳定株构建 FAQ转自微博思路迪慢病毒包装1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。

这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。

而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。

这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。

稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。

在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。

稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。

稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。

因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。

质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。

不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。

2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？∙答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：∙1)，外源插入片段的拷贝数。

多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。

∙2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。

∙3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。

最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。

∙4)，整合后的稳定性。

不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。

∙5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。

因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。

稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。

对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。

例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。

用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。

对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。

不同批次的药物活性有一定差异。

因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。

筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。

第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。

2、用G418筛选处理5-10天。

每2天观察细胞一次。

每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。

直到得到最佳浓度。

3、用嘌呤霉素处理4-7天。

每2天跟换新的有抗生素的培养基。

耐药细胞株的筛选
一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。

另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。

脂质体转染：在转染24小时后，消化XXX细胞并计数。

将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。

待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。

筛选时间和浓度视细胞而定。

一般G418（Geneticin,遗传霉素）作用一个星期，嘌呤霉素作用2-3天。

脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。

慢病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。

包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。

包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。

转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。

高表达抗PD-1抗体CHO细胞株的筛选及代谢分析梅文枫;朱一平;尹帮旗;许晓刚;方树彬【摘要】目的筛选高表达抗PD-1抗体的工程细胞株和较优的基础及补料培养基,并进行代谢分析. 方法分别在TPP摇管、摇瓶中通过流加培养的方式,从6株细胞株和5种商业培养基中筛选高表达抗PD-1抗体的GS-CHO细胞株和较优的基础及补料培养基.在流加培养过程中,检测葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸及氨等的浓度变化.同时为分析限制性营养因素,进一步对乳酸、氨及氨基酸代谢进行分析. 结果通过TPP摇管初步筛选,显示122和126两株细胞在HyCellCHO培养基中表现最好,表达量分别为1.945和1.989 g/L;在摇瓶中进一步验证显示122细胞在6株细胞中的最大活细胞密度图最高,达2.21×107 cells/mL,表达量＞2 g/L.代谢分析发现,乳酸代谢切换和谷氨酸及丙氨酸代谢相关.氨基酸分析发现,蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等必需氨基酸可能为122细胞株生长和(或)表达限制性成分. 结论筛选出高表达抗PD-1抗体的细胞株和较优培养基,同时代谢分析和氨基酸分析为后续细胞培养工艺开发及个性化培养基优化提供理性指导.【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2018(052)005【总页数】8页(P320-327)【关键词】GS-CHO细胞;培养基;细胞计数;代谢【作者】梅文枫;朱一平;尹帮旗;许晓刚;方树彬【作者单位】福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122;福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122;福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122;福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122;福建医科大学免疫治疗研究所,福州350122【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R341;R977.6程序性死亡蛋白1(programmed death 1，PD-1)信号通路成为肿瘤免疫治疗的热点之一，肿瘤细胞表面的程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)通过与PD-1的结合抑制了肿瘤特异性CD8+T细胞的免疫活性，介导了免疫逃逸，抗PD-1/抗PD-L1抗体通过阻断负性免疫调节信号，阻断免疫逃逸而杀伤肿瘤[1]。

G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。

外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。

极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。

细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。

由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。

一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。

细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。

是稳定转染最常用的选择试剂。

当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。

Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。

其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。

但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。

我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。

因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。

单克隆抗体‎制备过程中‎经过两次筛‎选单克隆抗体‎制备过程中‎，总共有两次‎筛选，第一次筛选‎出杂交瘤细‎胞，第二次筛选‎出能产生特‎异性抗体的‎杂交瘤细胞‎，两次筛选的‎原理和方法‎是不相同的‎。

第一次筛选‎的原理与方‎法：细胞融合后‎，杂交瘤细胞‎的选择性培‎养是第一次‎筛选的关键‎。

普遍采用的‎H A T选择‎性培养液是‎在普通的动‎物细胞培养‎液中加入次‎黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶‎核苷酸（T）。

其依据是细‎胞中的DN‎A合成有两‎条途径：一条途径是‎生物合成途‎径（“D途径”），即由氨基酸‎及其他小分‎子化合物合‎成核苷酸，为DNA分‎子的合成提‎供原料。

在此合成过‎程中，叶酸作为重‎要的辅酶参‎与这一过程‎，而HA T培‎养液中氨基‎喋呤是一种‎叶酸的拮抗‎物，可以阻断D‎N A合成的‎“D途径”。

另一条途径‎是应急途径‎或补救途径‎（“S途径”），它是利用次‎黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸‎核苷转移酶‎（HGPRT‎）和胸腺嘧啶‎核苷激酶（TK）催化次黄嘌‎呤和胸腺嘧‎啶核苷生成‎相应的核苷‎酸，两种酶缺一‎不可。

因此，在HA T培‎养液中，未融合的效‎应B细胞和‎两个效应B‎细胞融合的‎“D途径”被氨基喋呤‎阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在‎体外培养液‎中增殖的能‎力，一般10d‎左右会死亡‎。

对于骨髓瘤‎细胞以及自‎身融合细胞‎而言，由于通常采‎用的骨髓瘤‎细胞是次黄‎嘌呤—鸟嘌呤磷酸‎核苷转移酶‎缺陷型（HGPRT‎）细胞，因此自身没‎有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋‎呤阻断，所以在HA‎T培养液中‎也不能增殖‎而很快死亡‎。

惟有骨髓瘤‎细胞与效应‎B 细胞相互‎融合形成的‎杂交瘤细胞‎，既具有效应‎B细胞的“S途径”，又具有骨髓‎瘤细胞在体‎外培养液中‎长期增殖的‎特性，因此能在H‎A T培养液‎中选择性存‎活下来，并不断增殖‎。

第二次筛选‎的原理和方‎法：在实际免疫‎过程中，由于采用连‎续注射抗原‎的方法，且一种抗原‎决定簇刺激‎机体形成相‎对应的一种‎效应B淋巴‎细胞，因此，从小鼠脾脏‎中取出的效‎应B淋巴细‎胞的特异性‎是不同的，经HA T培‎养液筛选的‎杂交瘤细胞‎特异性也存‎在差异，所以必须从‎杂交瘤细胞‎群中筛选出‎能产生针对‎某一预定抗‎原快定簇的‎特异性杂交‎瘤细胞。

生物药是利用生物技术生产的药物，具有高效、低副作用等优点，受到越来越多的关注和重视。

而生物药的生产与监管也是非常重要的环节，其中细胞株的监管和筛选尤为关键。

本文将重点讨论生物药生产细胞株监管要求与筛选要点。

一、生物药生产细胞株监管要求1. 严格遵循相关法规法规生物药生产细胞株监管要求首先要符合国家相关的法规法规，比如《生物制品质量管理规范》等。

生物药生产企业应严格按照法规法规要求进行生物制品质量管理，确保生产过程和产品质量的合规性。

2. 建立健全的质量管理体系生物药生产企业要建立健全的质量管理体系，包括质量管理制度、质量控制标准、质量控制记录等，确保生产过程的合规性和产品质量的稳定性。

要对细胞株的来源、鉴定、保存等进行详细的记录和管理。

3. 进行定期的审计和验证生物药生产企业应定期进行内部和外部的审计和验证，确保质量管理体系的有效性和合规性。

内部审计主要包括对生产过程和质量管理体系的自查，外部审计主要是由相关监管部门进行的审计。

二、生物药生产细胞株筛选要点1. 细胞株的来源和鉴定生物药生产企业在筛选细胞株时，首先要确定细胞株的来源，确保细胞株的合法性和纯度。

要进行细胞株的鉴定，确保细胞株的身份和稳定性。

2. 细胞株的保存和传代生物药生产企业应建立细胞株的保存制度，确保细胞株的保存完整性和稳定性。

要建立细胞株的传代制度，确保细胞株的稳定性和一致性。

3. 细胞株的生物学特性在筛选细胞株时，生物药生产企业还需要对细胞株的生物学特性进行评价，包括细胞生长特性、代谢特性、表达特性等，确保细胞株适合用于生物药的生产。

4. 细胞株的安全性评估生物药生产企业还需要对细胞株的安全性进行评估，包括对细胞株的致病性、致突变性等进行评估，确保细胞株符合相关的安全性要求。

生物药生产细胞株监管要求包括严格遵循相关法规法规、建立健全的质量管理体系，进行定期的审计和验证；生物药生产细胞株筛选要点包括细胞株的来源和鉴定、细胞株的保存和传代、细胞株的生物学特性、细胞株的安全性评估，为确保生物药生产过程的合规性和产品质量的稳定性提供了重要的指导意义。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611209263.9(22)申请日 2016.12.23(71)申请人 浙江海隆生物科技有限公司地址 312000 浙江省绍兴市滨海新城马欢路398号科创中心2号楼5楼(72)发明人 钱泓　吴有强　卞广林　张强　徐玉兰　车影　吴素芳　查银河　(74)专利代理机构 北京乾诚五洲知识产权代理有限责任公司 11042代理人 付晓青　李广文(51)Int.Cl.C12N 5/10(2006.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 15/65(2006.01)(54)发明名称一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用(57)摘要本发明公开了一种CHO单克隆细胞株的筛选方法和应用，该方法包括以下步骤：1)在pEE12.4载体上面插入一种抗生素筛选标记基因；2)将目的基因插入1)中改造的pEE12.4的多克隆位点中；3)将2)中构建的重组质粒转染CHO细胞；4)加压筛选得到阳性CHO细胞；5)从阳性细胞中筛选得到高表达目的蛋白的CHO单克隆细胞株。

使用本发明的方法在CHO单克隆细胞株筛选时能够显著提高筛选效率，节约筛选时间；且在批量构建真核表达载体时能够显著提高工作效率和降低成本。

权利要求书1页 说明书8页 附图2页CN 107964535 A 2018.04.27C N 107964535A1.一种CHO单克隆细胞株的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)在pEE12.4载体上面插入一种抗生素筛选标记基因，以得到改造的pEE12.4的多克隆位点；2)将目的基因插入步骤1)中改造的pEE12.4的多克隆位点中，以获得构建的重组质粒；3)将步骤2)中构建的重组质粒通过转染试剂转染CHO细胞；4)加压筛选得到阳性CHO细胞；5)从阳性CHO细胞中筛选得到高表达目的蛋白的CHO单克隆细胞株。

细胞系和细胞株细胞系和细胞株是细胞生物学中的两个重要概念。

细胞系是指一组同源或同种细胞，它们来自于同一个原始细胞并在体外不断传代，形成了一个稳定的细胞种群。

而细胞株则是指从一个细胞系中分离出的单个细胞，经过培养和传代后形成的单一细胞种群。

细胞系的建立是细胞生物学的重要研究方向之一。

早期的细胞系建立主要是通过原代培养，即将组织或细胞分离后在培养皿中进行培养，随着时间的推移，细胞会不断增殖并形成一定规模的细胞种群。

这种方法的缺点是细胞的生长状态不稳定，容易产生突变和异质性，难以保证细胞的同质性。

因此，现代的细胞系建立主要采用有限稀释法，即将细胞以一定的比例稀释后分配到多个培养皿中，每个培养皿中只有一个细胞。

经过多次传代后，每个培养皿中的细胞都来自于同一个细胞，形成了一个同质的细胞系。

细胞系的建立对于细胞生物学的研究至关重要。

首先，细胞系可以用于研究细胞的生长、分化、转化和凋亡等生物学过程，探究其机制和调控方式。

其次，细胞系可以用于研究人类疾病的发生和发展机制，例如癌症、心血管疾病等。

通过建立癌细胞系，可以研究癌细胞的生物学特性、药物敏感性和耐药性等，为癌症的治疗提供新的思路和方法。

细胞株是细胞系中的单个细胞。

它们在体外的培养条件下可以不断生长和增殖，形成一个稳定的细胞种群。

细胞株的建立通常是通过原代培养或单细胞克隆法。

原代培养是指将组织或细胞分离后在培养皿中进行培养，直到细胞生长到一定密度后，再将其分离成单个细胞，进行单细胞克隆。

单细胞克隆法是指将细胞分离成单个细胞，然后将每个细胞分别种植到培养皿中，等到细胞生长到一定密度后，挑选生长良好的细胞进行传代，最终形成一个同质的细胞株。

细胞株的建立对于细胞生物学的研究也具有重要意义。

首先，细胞株可以用于研究细胞的生长、分化、转化和凋亡等生物学过程，探究其机制和调控方式。

其次，细胞株可以用于研究药物的毒性和效果，对药物的筛选和评价具有重要意义。

此外，细胞株还可以用于生产生物制品，例如疫苗、抗体等，为生物医药产业的发展提供了重要的技术支持。

菌种的筛选方法及步骤（二）引言：菌种的筛选是微生物学研究中的重要环节之一，它可以帮助科研人员确定具有理想特性和功能的微生物菌株。

本文将继续介绍关于菌种筛选的方法和步骤，以帮助读者更好地理解和应用。

概述：菌种筛选是通过一系列实验步骤来评估和选择微生物菌株的过程。

这些步骤包括初步的预筛选、进一步的生理特性和功能评估、细胞分析以及最终的筛选和鉴定。

正文内容：一、初步的预筛选1.核酸检测：使用PCR技术对菌株进行DNA提取和扩增，通过与目标靶标的比对来初步筛选具有相关基因组的菌株。

2.形态学和生理特性观察：通过显微镜观察菌株的形态特征，并进行一系列生理特性的初步评估，如生长速度、耐受性等。

二、进一步的生理特性和功能评估1.生长优势评估：在不同培养条件下比较菌株的生长速度和优势，以确定最适宜的培养条件。

2.代谢特性评估：通过测定菌株对特定有机物的降解能力和产生的代谢产物来评估其代谢特性。

3.生物活性评估：测定菌株对不同病原微生物的抑制活性，评估其潜在的生物控制能力。

4.耐受性评估：将菌株暴露在不同的胁迫条件下，如高温、低温、酸碱等，评估其对环境胁迫的耐受能力。

三、细胞分析1.细胞形态观察：通过扫描电镜和透射电镜观察菌株的细胞形态结构。

2.细胞代谢产物分析：使用色谱质谱等技术对菌株的代谢产物进行定性和定量分析，以了解其代谢能力。

四、最终的筛选和鉴定1.生物学特性分析：通过菌株的生长特性、生理学、遗传学等方面的综合分析，确定其是否具备所需的特性。

2.16SrRNA鉴定：通过比对菌株的16SrRNA序列和已知菌株的数据库，进行菌株的分类和鉴定。

总结：菌种的筛选是一个复杂的过程，需要利用多种方法和步骤来评估和选择最合适的菌株。

初步的预筛选可以帮助缩小范围，进一步的生理特性和功能评估可以深入了解菌株的能力。

细胞分析可以提供对菌株的细胞结构和代谢能力的了解，最终的筛选和鉴定可以确定菌株的分类和特性。

通过这些方法和步骤，科研人员可以获得高质量的菌株，为微生物学研究和应用提供坚实的基础。

筛选微生物的步骤（一）引言概述：筛选微生物是微生物研究的关键步骤之一，通过合理的筛选步骤可以提高筛选效率和准确性。

本文将介绍筛选微生物的步骤，包括样品收集、预处理、培养基选择、培养条件优化和鉴定分离。

正文：1. 样品收集a) 确定样品类型，如土壤、水样、动物组织等。

b) 选择合适的采样工具和采样区域，确保采样的代表性。

c) 使用无菌容器采集样品，并尽快送至实验室进行处理。

2. 预处理a) 对样品进行处理，如过滤、离心、稀释等，以去除杂质和减少微生物数量。

b) 对不同样品进行不同的处理方法，确保样品的完整性和可用性。

c) 注意预处理过程中的无菌操作，避免外源性微生物的污染。

3. 培养基选择a) 根据所要筛选的微生物类型，选择合适的培养基，如富集培养基、选择性培养基等。

b) 考虑微生物的生长需求，如温度、pH值、营养成分等。

c) 添加适当的抑制剂或选择剂，以抑制非目标微生物的生长。

4. 培养条件优化a) 优化培养条件，如温度、氧气含量、搅拌速度等。

b) 考虑微生物的生长特性和环境因素，调整培养条件以提高筛选效率。

c) 定期检测培养基的菌落数和生长情况，优化培养条件和筛选方法。

5. 鉴定分离a) 根据菌落形态、颜色、质地等特征进行初步鉴定。

b) 制备纯培养物，并进行进一步的生理和生化鉴定。

c) 若需要，可以进行分子生物学鉴定，如16S rRNA测序等。

总结：筛选微生物是一个复杂的过程，包括样品收集、预处理、培养基选择、培养条件优化和鉴定分离等多个步骤。

合理的筛选步骤可以提高筛选效率和准确性，对于微生物研究具有重要意义。

产量突变株的筛选方法
筛选植物产量突变株的方法主要有以下几种：
1.结实筛选：根据植株生长状况及其结实情况进行筛选；
2.细胞分裂染色体筛选：根据细胞分裂后产生的染色体来筛选；
3.生长曲线特征筛选：根据植物生长曲线及其变化特征来筛选；
4.遗传因子分析筛选：根据植物遗传因子的变化模式来筛选；
5.植物分子标记筛选：根据植物分子标记的结果来筛选；
6.生物信息学筛选：根据植物种群的基因型分布以及植物的生态条件及发育状况进行筛选。

puromycin筛选原理puromycin 使用使用步骤：（哺乳动物细胞筛选）?嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。

所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线（kill curve）。

（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。

细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。

嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。

（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。

?嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。

）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。

）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。

孵育。

（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP 表达的水平及所占比例。

在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。

嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。

注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。

在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。

细胞株开发中单克隆形成率的计算细胞株的开发是生物技术研究中常见的一项工作，而单克隆形成率则是评估细胞株开发效果的重要指标之一。

本文将对单克隆形成率的计算方法进行详细介绍，并探讨影响单克隆形成率的因素。

一、什么是单克隆形成率？单克隆形成率是指在细胞株开发过程中，成功形成单个细胞克隆的比例。

在细胞株开发过程中，通过细胞分离、培养和筛选等步骤，可以得到单个细胞的克隆。

单克隆形成率的高低直接影响到细胞株的纯度和稳定性。

二、单克隆形成率的计算方法单克隆形成率的计算方法是通过统计成功形成克隆的细胞数量与总细胞数的比值来得到的。

具体计算公式如下：单克隆形成率 = 成功形成克隆的细胞数 / 总细胞数× 100%其中，成功形成克隆的细胞数是指在细胞株开发过程中，通过细胞分离、培养和筛选等步骤，最终成功形成克隆的细胞数量；总细胞数是指细胞株开发过程中所使用的总细胞数量。

三、影响单克隆形成率的因素1. 细胞分离效果：细胞分离是细胞株开发中的第一步，分离效果直接影响到单克隆形成率。

如果细胞分离不完全或过度分离，都会降低单克隆形成率。

2. 培养条件：细胞在培养过程中需要适宜的培养基、温度、湿度和气体环境等条件来维持其正常生长和分裂。

不良的培养条件会导致细胞生长缓慢或死亡，从而影响单克隆形成率。

3. 细胞筛选方法：细胞筛选是细胞株开发中的关键步骤，常用的筛选方法有限稀稀释法、克隆形成法和细胞团聚法等。

不同的筛选方法对单克隆形成率有不同的影响，选择合适的筛选方法可以提高单克隆形成率。

4. 细胞的遗传稳定性：细胞的遗传稳定性直接影响到细胞的克隆性。

如果细胞存在遗传变异或突变，会导致细胞株不稳定，从而降低单克隆形成率。

5. 携带病原体的污染：细胞株开发过程中，如果细胞携带病原体，会导致细胞生长异常或死亡，从而影响单克隆形成率。

四、提高单克隆形成率的方法1. 优化细胞分离方法：采用适当的细胞分离方法，确保细胞的完整性和活力，提高单克隆形成率。