菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
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菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶的制备及活性测定
菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(Anana COmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。
菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。
一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。
八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murachi，et a1．，1964)。
1981年，Marcano首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Willstatter，Bergmann和Martin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembromelain E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruit bromelainE．C．3．4．22．5)。
Murachi和Neurath、E1．G harbawi和Whitaker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。
结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。
Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Muraclli 的分析结果相似。
1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。
菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。
菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
菠萝蛋白酶的研究及应用进展
Ｎｏ．８．２００８品工业科技，２００１，１７（３）：４３－４６［１５］李霞．保加利亚乳杆菌缩浓缩培养及生化代谢规律的研究［Ｊ］．河南工业大学学报（自然科学版），２００５，２６（２）：７５－７８［１６］刘飞．罗地亚．直投型发醉剂发酵特性研究［Ｊ］．中国乳品工业，２００５，３３（１）：１１－１３［１７］郭本恒．乳品微生物［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，２００１：２３０－２３９菠萝蛋白酶的研究及应用进展吴茂玉１，２，马超３，乔旭光３，宋烨１，赵岩１（１．中华全国供销合作总社济南果品研究院，济南２５００１４；２．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京１０００９４；３．山东农业大学食品学院，泰安２７１０１８）摘要：综述菠萝蛋白酶的结构和性质，工业生产和实验室分离提纯方法及在医药和食品行业中的应用。
关键词：菠萝蛋白酶；纯化；应用中图分类号：ＴＳ２０１．２＋５文献标志码：Ｂ文章编号：１００５－９９８９（２００８）０８－００１７－０４ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｂｒｏｍｅｌａｉｎＷＵＭａｏ－ｙｕ１，２，ＭＡＣｈａｏ３，ＱＩＡＯＸｕ－ｇｕａｎｇ３，ＳＯＮＧＹｅ１，ＺＨＡＯＹａｎ１（１．ＪｉｎａｎＦｒｕｉｔＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＡｌｌＣｈｉｎａＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＳｕｐｐｌｙ＆ＭａｒｋｅｔｉｎｇＣｏ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅｓ，Ｊｉｎａｎ２５００１４；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４；３．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉ＇ａｎ２７１０１８）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙａｎｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂｒｏｍｅｌａｉｎａｓｗｅｌｌａｓｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｒｏｍｅｌａｉｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ菠萝蛋白酶（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称，主要存在于菠萝茎和果实中，根据提取部位的不同，分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。
菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究
３．离子交换层析进一步分离纯化 用离子交换层析法对纳米二氧化 钛吸附法所得蛋白酶进一步纯化。采用美国伯乐公司离子交换树脂 １ ５８．００３０，以ｐＨ６．０的０．０１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－磷酸盐溶液为初始缓冲液，’以０．１～１．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液进行线瞄扰脱，得到蛋白酶比活力６．４ｘ １ ０３ Ｕ／ｍｇ．Ｐｒ，纯化倍数提高到 １３．７３倍。
１·Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ ２．６３ ｆｏｌｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ６４＿３％ｔｒｅａｔｅｄ ｂｖ Ｋａｄｉｌｌ
ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｂｙ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｎｄ ｎａｎｏ．Ｔｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗｅｒｅ １．３４ ｆｏｌｄ，７８．４％ａｎｄ ５．２９ ｆｏｌｄ，６４．７％；ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ：ｋａｏｌｉｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｈａｄ ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ
ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｖｅ，ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ，ａｎｄ ｌｏｗ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ；Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｒｅｍｏｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｓｉｍｉｌａｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｗｉｔｈ ｂｒｏｍｅｌａｉｎ；Ｈｏｗｅ ＿。ｖｅｒ，ｎａｎｏ·－Ｔｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｓｉｍｐｌｅ， ｌｅｓｓ—ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｖｅ，ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ．
１·Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ ２．６３ ｆｏｌｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ６４＿３％ｔｒｅａｔｅｄ ｂｖ Ｋａｄｉｌｌ
ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｂｙ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｎｄ ｎａｎｏ．Ｔｉ０２ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗｅｒｅ １．３４ ｆｏｌｄ，７８．４％ａｎｄ ５．２９ ｆｏｌｄ，６４．７％；ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ：ｋａｏｌｉｎ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｈａｄ ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ
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菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一．实验目的与要求（1）掌握菠萝蛋白酶的制备与纯化的基本原理和方法（2）掌握菠萝蛋白酶活力测定方法（3）菠萝蛋白酶的稳定性研究（4）菠萝蛋白酶的修饰（5）比较修饰酶与未修饰酶的活力二．实验原理菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质,广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中,分子量为33000,能分解蛋白质、肽、脂和酰胺等。
它的水解活性较木瓜酶高10倍以上。
因此有广泛的用途。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清。
还用于胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增大而增大，这种现象称为盐溶。
当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐减小，直至在溶液中沉降出来，即为盐析。
加入中性盐后，由于中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间相互聚焦而沉淀。
凝胶层析是广泛应用于蛋白质、酶、和核酸等生物高分子分离分析的有效方法之一，它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。
分子量大于允许进入凝胶“网眼”的范围的物质完全被凝胶排阻，随洗脱液先流出层析液，分子量小的物质较晚地流出柱。
本实验采用葡聚糖凝胶Sephadex G-75作为固相载体，它适用于1500-30000之间的多肽与蛋白质的分离。
Folin-酚试剂法所用的试剂由两部分组成。
试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。
试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色，由于蛋白质（或多肽）中含有带酚基的酪氨酸，故有此呈色反应。
蓝色深浅与蛋白质浓度相关，在一定浓度范围内呈线性关系，因此可作比色法测定。
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取和纯化方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、掌握菠萝蛋白酶的化学修饰并对修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（Bromelain,EC 3.4.22.3）是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为33000D，等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。
它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。
在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
菠萝蛋白酶的最适温度范围比较稳定，最稳定范围是55℃~65℃。
菠萝蛋白酶的最适 pH 在 7.1 左右，呈现中性。
金属盐离子中 NaCl、KCl 对酶活的影响不是很大，较高浓度的MgCl2、CaCl2对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度的抑制作用，尤其在浓度较高的情况下对菠萝蛋白游离酶酶活的影响更大。
Zn2+的作用中以醋酸锌的作用更为显著，极低的浓度即能促使菠萝蛋白酶的酶活性明显提高。
较低浓度的 ZnCl2也能使酶的稳定性有所提高。
维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力。
0.05%的苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶的活性得到抑制，对酶起到保护作用。
对酶活有影响的金属离子，EDTA 能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶的失活作用。
其它试剂如 50%的甘油、葡萄糖、 40%的半乳糖都能使菠萝蛋白酶的半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定的保护作用。
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性地影响一、实验目地、掌握菠萝蛋白酶地提取和纯化方法、研究菠萝蛋白酶地稳定性、掌握菠萝蛋白酶地化学修饰并对修饰酶与未修饰酶地活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（）是从凤梨属植物菠萝中提取地一组复合地半胱氨酸巯基蛋白水解酶.菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为，等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水.水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚.菠萝蛋白酶是典型地巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺.它地水解蛋白地活性比木瓜蛋白酶地活性高十倍以上，因此有着广泛地用途.它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶地生产.在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤地治疗.菠萝蛋白酶地最适温度范围比较稳定，最稳定范围是℃℃.菠萝蛋白酶地最适在左右，呈现中性.金属盐离子中、对酶活地影响不是很大，较高浓度地、对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度地抑制作用，尤其在浓度较高地情况下对菠萝蛋白游离酶酶活地影响更大.地作用中以醋酸锌地作用更为显著，极低地浓度即能促使菠萝蛋白酶地酶活性明显提高.较低浓度地也能使酶地稳定性有所提高.维生素、半胱氨酸、硫代硫酸钠、巯基乙醇是菠萝蛋白酶地稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力.地苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶地活性得到抑制，对酶起到保护作用.对酶活有影响地金属离子，能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶地失活作用.其它试剂如地甘油、葡萄糖、地半乳糖都能使菠萝蛋白酶地半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定地保护作用.菠萝蛋白酶含有个巯基和个内肽二硫键.在蛋白质中 , —部分是与酶活性有关地最具有反应性地官能团，巯基能够和取代马来酰亚胺反生加成反应，可以对巯基进行修饰，验证巯基对酶催化活性地影响三、试剂材料、材料：新鲜地成熟菠萝、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙地干燥器、琼脂糖凝胶柱（×）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、计、搅拌棒.、试剂：单宁、苯甲酸钠溶液、溶液、氯化钠溶液、地醋酸缓冲液、醋酸缓冲液（含）、三氯乙酸溶液、盐酸、氢氧化钠、乙二醇溶液、甘露醇溶液、葡萄糖溶液、甘油溶液、柠檬酸盐缓冲液( )、乙酸顺丁烯二酰亚胺（）（.）xHAQX缓冲液：称取及，加水溶解后，定容至即得.酪氨酸溶液：精确称取℃下干燥至恒重地酪氨酸，用磷酸缓冲液定容至.酪蛋白溶液：精确称取酪蛋白，用磷酸缓冲液定容至.酶激活剂：半胱氨酸盐酸盐，, 用磷酸缓冲液定容至.蛋白酶液：精确称取菠萝蛋白酶，用磷酸缓冲液定容至.四、实验步骤.菠萝蛋白酶提取纯化. 澄清菠萝汁地制备将菠萝在清水中洗净，沥干，用压榨机压出汁液.用四层纱布挤压进行渣汁分离，获得地粗汁液再经四层纱布过滤去除纤维状物质.得到地粗滤液在℃下离心，留上清液备用.. 硫酸铵沉淀取澄清地菠萝皮汁在℃磁力搅拌作用下缓慢加入经过研磨地固体硫酸铵至饱和.当硫酸铵全部加入后要不断搅动，以使溶解地蛋白和聚集地蛋白达到平衡.将此富含酶蛋白地溶液于离心，收集沉淀并分离出上清液..透析除硫酸铵透析袋预处理：将透析袋剪成适当长度，置于含地溶液中，煮沸.用去离子水彻底清洗透析袋后，再用溶液煮沸 .冷却后，于℃保存备用.操作步骤：将商品化地透析袋适当处理后，封住一端，用纯水检查其完整性，然后将上述沉淀用少量缓冲液溶解后，装入透析袋，赶出袋中地空气，封住透析袋地另一端，放进烧杯中，下置电磁力搅拌器缓慢搅拌，℃透析过夜，对该缓冲液透析，换液次后，用溶液检测是否已被除尽.收集透析内液，离心，用于进一步上柱纯化.凝胶柱纯化离子交换介质处理与转型用初始缓冲液替换倾倒澄清掉乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占，缓冲液占），作真空脱气处理备用..装柱与平衡打开层析柱顶部，关闭出口，用地醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡.将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡地产生，同时用缓冲液填充柱子地剩余部分.打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液.打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定地流速通过，稳定柱子.用倍柱体积地缓冲液平衡柱子，直至流出地平衡液和初始平衡液相等时表示已达到平衡..加样略微增大层析柱出口地流速，排除凝胶床表面缓冲液.打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无地酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下.打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口..洗脱加样后用足够量地起始缓冲液淋洗，使未吸附地物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入醋酸缓冲液（含）以流速，开始洗脱，.收集将洗脱液按一定地体积分别收集于试管中，收集各吸收峰洗脱液，然后逐管进行分析，合并活性洗脱峰透析冷冻干燥保存备用..酶活性地测定标准曲线地测定于离心，取上清液，在型分光光度计上以波长下测其吸光度值，记录数据.然后以标准溶液地浓度为横坐标，紫外吸收值为纵坐标绘制标准曲线待用.样品酶活性测定于离心，取上清液，在型分光光度计上以波长下测其吸光度值，记录数据.酶活力单位定义为：在一定温度和值条件下，每分钟水解酪蛋白释放μ酪氨酸地酶量定义为个蛋白酶单位，以表示.酶稳定性研究在测定所用地酶试剂中分别加入滴缓冲液、甘油溶液、乙二醇溶液、甘露醇溶液、葡萄糖溶液，℃水浴，按地实验条件及方法测定酶活性.记录吸光度值，计算得到酶活性变化情况.溶液缓冲液甘油溶液乙二醇溶液甘露醇溶液葡萄糖溶液吸光度.酶修饰前后活性比较修饰酶地制备溶于干燥吡啶，加入琥珀酸酐，度保温，在度减压蒸馏除去溶剂.加入苯至残余物溶解，再加冷己烷，度振荡.过滤，残渣溶于蒸馏水后透析，冻干.将其与菠萝蛋白酶按配比投料，加入柠檬酸缓冲液（），度反应.产物在柠檬酸缓冲液中透析，冻干后得菠萝蛋白酶（修饰酶）.修饰与未修饰酶地活性比较按地实验条件及方法测定酶活性.记录吸光度值，计算得到酶活性变化情况.酶溶液修饰酶未修饰酶吸光度参考文献：董瑞兰. 菠萝蛋白酶地分离纯化及部分应用性质地研究[]. 福建农林大学, .李淑喜, 黎新明. 菠萝蛋白酶地提取及其在医药中地应用[]. 广州化工, , ().田国贺, 郭佳宓, 吕团伟,等. 聚乙二醇对菠萝蛋白酶地化学修饰[]. 生物技术, , ().。
影响菠萝蛋白酶活力因素的研究进展
用琥珀酸酐法活化后的聚乙二醇（ＰＥＧ）修饰菠萝 蛋白酶，所得到的修饰酶在对温度和ｐＨ值的稳定性上均 比天然酶有一定程度的提高。这说明ＰＥＧ分子对酶有一 定的保护作用，推测这种作用应来自分子间的作用力。 Ｍｇ２＋和Ｃａ２＋对修饰酶有不同程度的激活作用，而Ｎａ＋对修 饰酶无明显影响［１２］。以脱乙酰甲壳质为载体，戊二醛为交 联剂，对菠萝蛋白酶进行固定化，研究其对啤酒澄清的作 用。采用右旋糖醛对菠萝蛋白酶进行化学修饰，经修饰的 酶能较好地保持蛋白酶活性，并且具有更好的稳定性。
近几年的研究表明，共溶剂对酶的保护作用机制是 共溶剂的加入改变了溶液的热力学性质，使酶的稳定性 得到增强，理论上称优先排阻作用。共溶剂从酶表面的 优先排阻并不是说共溶剂分子绝对不能渗透到酶表面并 与之结合，而是在酶表面完全水化和共溶剂完全结合之 间建立起一种平衡。糖类是酶蛋白在溶液中和在干燥状 态下较好的稳定剂。甘油和多元醇对酶的非极性表面有 很好的稳定作用。另外，一些研究者发现，混合使用共 溶剂可大大提高酶的稳定效果。 ２．２ 有机溶剂
菠萝蛋白酶的最适ｐＨ在６．５～７．５，在７．１附近酶活达 最大值。在酸性环境中，酶反应速度下降快，但在碱性 下有一个相对较宽的应用范围，酶较稳定的ｐＨ范围在 ３．５～４．５。菠萝原汁的ｐＨ值为３．８，调节其原汁ｐＨ值范围 为３．０～６．０，在４０℃恒温水浴中保温５ｈ后，测定其活 力。结果证明，在ｐ Ｈ ＝ ３ 时，酶活力保留率只有４ ６ ％ ； ｐＨ＝５．０时，酶活力达最高，保留率为８９．７％。 ２．４ 氧化还原
２００９ 年第 １０ 期
中国食物与营养 Food and Nutrition in China
Ｎｏ．１０，２００９
影响菠萝蛋白酶活力因素的研究进展
程安玮，王文亮，徐同成，杜方岭，吕铁信
近几年的研究表明，共溶剂对酶的保护作用机制是 共溶剂的加入改变了溶液的热力学性质，使酶的稳定性 得到增强，理论上称优先排阻作用。共溶剂从酶表面的 优先排阻并不是说共溶剂分子绝对不能渗透到酶表面并 与之结合，而是在酶表面完全水化和共溶剂完全结合之 间建立起一种平衡。糖类是酶蛋白在溶液中和在干燥状 态下较好的稳定剂。甘油和多元醇对酶的非极性表面有 很好的稳定作用。另外，一些研究者发现，混合使用共 溶剂可大大提高酶的稳定效果。 ２．２ 有机溶剂
菠萝蛋白酶的最适ｐＨ在６．５～７．５，在７．１附近酶活达 最大值。在酸性环境中，酶反应速度下降快，但在碱性 下有一个相对较宽的应用范围，酶较稳定的ｐＨ范围在 ３．５～４．５。菠萝原汁的ｐＨ值为３．８，调节其原汁ｐＨ值范围 为３．０～６．０，在４０℃恒温水浴中保温５ｈ后，测定其活 力。结果证明，在ｐ Ｈ ＝ ３ 时，酶活力保留率只有４ ６ ％ ； ｐＨ＝５．０时，酶活力达最高，保留率为８９．７％。 ２．４ 氧化还原
２００９ 年第 １０ 期
中国食物与营养 Food and Nutrition in China
Ｎｏ．１０，２００９
影响菠萝蛋白酶活力因素的研究进展
程安玮，王文亮，徐同成，杜方岭，吕铁信
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响实验目的学习菠萝蛋白酶的提取纯化方法，学习酶活力的测定原理及方法，了解影响菠萝蛋白酶活性的因素。
实验原理菠萝蛋白酶是一种典型的巯基蛋白酶，相对分子质量为3.3*107，等电点为9.55，能分解蛋白质、肽、脂质和酰胺。
蛋白质在水溶液中的溶解度由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度及蛋白质分子所带电荷的情况决定的，当加入硫酸铵后，由于盐离子对水的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜被破坏，同时其表面的电荷被盐离子中和，导致蛋白质溶解度下降，从而从溶液中沉淀析出。
粗品中的硫酸根离子可由透析的方法除去，铵根离子可由CM琼脂糖FF 层析柱除去。
菠萝蛋白酶活力定义为在特定条件下（pH7.0，37℃），每分钟水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需的菠萝蛋白酶的量规定为1个酶活力单位，以U/g表示。
根据紫外吸光度（275nm处）建立标准曲线，确定水解产生的酪氨酸含量，从而计算出酶活力。
菠萝蛋白酶活性依靠巯基维持，文献资料显示，含多羟基化合物对巯基具有保护作用，因此通过向菠萝蛋白酶中加入甘油、乙二醇、甘露醇以及葡萄糖，探究验证这类有机物的保护作用。
而N-乙酸马酰亚胺（NEM）是巯基修饰剂，因此可以利用NEM 验证菠萝蛋白酶中的半胱氨酸残基为其酶活性所必需。
实验仪器和试剂材料：菠萝汁（菠萝榨汁后用纱布过滤得澄清溶液）仪器：烧杯、玻璃棒、离心机、离心管、滴管、透析袋、恒温水浴锅、冰箱、电炉、磁力搅拌器、凝胶柱、试管、白瓷板试剂：纯化水，硫酸铵，1mmol/L EDTA的2% NaHCO3溶液，1mmol/L EDTA溶液，1%BaCl2溶液，磷酸缓冲溶液（称取KH2PO4 2.69g以及K2HPO4 13.97g，加水溶解后定容至1000mL，pH7.4 实验中需要大量该溶液），CM琼脂糖FF凝胶，20%乙醇溶液，洗脱液：1M NaC-20mM pH4.0 含0.01% EDTA醋酸缓冲液（取2M醋酸钠溶液13ml与2M醋酸溶液87mL，加入含铜1mg/mL的硫酸铜溶液0.5mL，加入0.1g EDTA，再加水稀释至1000ml），双缩脲试剂（取1.50g CuSO4·5H2O，6.0g酒石酸钠，加水约500ml溶解后加入300ml 10% NaOH，用水配成1L），酪氨酸标准液（精确称取105℃下干燥至恒重的酪氨酸5mg，用pH7.4磷酸缓冲溶液定容至100ml ），酶激活剂（20mmol/L L-半胱氨酸盐酸盐，1mmol/L EDTA-Na，用磷酸溶液定容至100ml），酪蛋白溶液（精确称取酪蛋白5mg，用磷酸缓冲液定容至100ml），三氯醋酸溶液（取三氯乙酸1.8 g，无水醋酸钠2.99 g，冰醋酸液1.9 mL，加水溶液并稀释至100 mL），50%甘油溶液，50%乙二醇溶液，50%甘露醇溶液，50%葡萄糖溶液，NEM，吡啶，苯，己烷，0.1M pH4.6 柠檬酸缓冲溶液（0.1M柠檬酸溶液10.3ml，0.1M柠檬酸钠溶液9.7ml）实验方法1 菠萝蛋白酶的提取在5~8℃下硫酸铵少量多次加入菠萝汁形成饱和溶液，搅拌30min，离心（11000g，20min，4℃），弃去上清液，得粗酶固体。
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菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。
2、学习酶活力测定的方法。
3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。
4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。
5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。
二、实验原理菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
分子量为33 000 , 等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。
2、本实验采用离子交换技术纯化菠萝蛋白酶。
与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。
它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。
3、菠萝蛋白酶活性单位的定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下[pH7.0，(37±1℃)]酶作用于干酪素底物1min产生1μg酪氨酸所需的酶量。
菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275 nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计(275 nm)测定溶液中所含肽的数量。
菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方法 [91]。
每毫升酶液活性单位（U/ml）=A-A0/Aw×M 标×V/t×样品稀释倍数/供测体积式中：( A - A0) 为275nm 波长下待测酶液与对照的光密度差值；Aw 指以水为对照，275nm 波长下50μg/mL 标准酪氨酸光密度值；M 标为标准酪氨酸溶液浓度；V 为反应体系总体积（mL）；t 为反应时间10min。
4、修饰的菠萝蛋白酶对温度和pH值的稳定性均比天然酶有很大程度的提高。
菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶,但它的稳定性较差,影响了它的应用。
此外,菠萝蛋白酶易受有关因素的影响而失活。
聚乙二醇(PEG) 为一种无毒且具亲水性的免疫惰性大分子，本实验采用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰,提高了其对环境的稳定性,使其半衰期延长。
三、实验材料（一）试剂和材料1、新鲜菠萝(0.735kg)2、0.1mg/ml牛血清蛋白柠檬酸钠、单宁、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液、激活剂、考马斯亮蓝、Brolain试剂、0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液、PEG活性酯、50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖溶液、50%甘油溶液（二）实验仪器榨汁机；离心机；紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；恒温水浴锅（37℃）；试管、试管架；烧杯、容量瓶；移液管；离子交换柱(250×10mm)；蠕动泵；自动部分收集器四、实验方法（一）从菠萝中提取、纯化菠萝蛋白酶操作步骤：将菠萝切碎→加柠檬酸钠，榨汁→菠萝汁→纱布过滤→澄清液→2000r/min，7min离心→上清液→加Vc,0.2%单宁溶液搅拌15min,静置40min4200r/min,5min离心→沉淀物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化钠液→4200r/min,5min离心→酶复合物→加适量1.5%氯化钠溶液，4000r/min,7min离心→酶复合物沉淀→冻存备用经预处理的强酸型阳离子树脂和经组氨酸修饰后的强碱型阴离子树脂分别装入250mm×10mm的离子交换柱和离子交换层析柱，柱的长径比为20∶1，将两柱串联。
在常温下依次操作：加样：略微增大层析柱出口的流速，排除凝胶床表面缓冲液。
打开层析柱顶塞，用移液管量取菠萝蛋白酶粗品溶液，从交换柱顶部加入，使其沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下。
加样时应先沿柱内壁转动一周，然后移至中心缓慢小心地将样品溶液加到凝胶表面，最好避免破坏凝胶，以保持凝胶表面平坦。
打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口。
洗脱：加样后用足够量的起始缓冲液淋洗，使未吸附的物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）以1mL/min 流速，开始洗脱部分收集：用自动部分收集器收集部分洗脱流出液。
将洗脱液按一定的体积分别收集于试管中，收集各洗脱液，然后逐管进行分析。
检测：洗脱流出液连续通过紫外检测仪，在选定波长下测定其吸光度A，并自动绘制洗脱曲线。
洗脱流出液经沉淀、干燥，得到菠萝蛋白酶精品。
（二）菠萝蛋白酶活力的测定精确移取pH7.0 的干酪素溶液5mL 于15mL 具塞的试管中，置于37℃恒温水浴中保温10min，准确取一定量的供试菠萝蛋白酶液，用酶液激活液（pH4.5 用L-cys 和EDTA-2Na 配制）稀释至1mL，加入上述底物溶液中，摇匀，立即置入37℃恒温水浴中，准确反应10min，加入5mL 三氯乙酸溶液，终止反应，用力混匀，在37℃恒温水浴中静置保温30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷却至室温，于3500rpm 离心10min，取上清液于275nm 波长下测其吸光度值A。
另取等体积的供试酶液，按上述步骤操作，对换酶液和三氯乙酸的加入顺序，测得的吸光度记为A0。
（三）物理及化学因素对菠萝蛋白酶稳定性的影响菠萝蛋白酶酶活力测定采用连续测定法，以酪蛋白为底物，经菠萝蛋白酶水解后用紫外分光光度计测定吸光值，每五分钟测定一次，大致表示为酶活性。
3.1、不同温度下的酶活性变化：温度（℃）15 25 40 50 60 70吸光度值3.2、不同PH值下得酶活性PH值 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0吸光度值3.3、在以上实验的相同条件下，在测定所用的酶试剂中分别加入1-2滴50%甘油溶液，然后与之前相同进行测定酶活性变化情况。
50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖溶液之后与50%甘油溶液相同处理进行实验。
试剂50%甘油溶液50%乙二醇溶液50%甘露醇溶液50%葡萄糖溶液吸光度值（四）NEM修饰及修饰与未修饰酶的活性比较：4.1 修饰酶的制备60gNEM溶于40ml干燥吡啶，加入1.01g琥珀酸酐，60度保温2h，在60度减压蒸馏除去溶剂。
加入苯至残余物溶解，再加100ml冷己烷，4度振荡2h。
过滤，残渣溶于蒸馏水后透析，冻干。
将其与菠萝蛋白酶按配比投料，加入0.1mol/L柠檬酸缓冲液（PH 3.0），4度反应4h。
产物在PH 4.6柠檬酸缓冲液中透析，冻干后得NEM-菠萝蛋白酶（修饰酶）。
4.2 修饰与未修饰酶的活性比较（1）分别取修饰酶与未修饰酶，溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液中（PH 7.0）至10ml，离心得上清液（2）取15支试管，分为三组，每组5支，分别按下表操作：组1：试管号1 2 3 4 5所加试剂未修饰酶（ml） 1 1 1 1 1激活剂（ml）0.9 0.9 0.9 0.9 0.91%酪蛋白（ml）0.2 0.4 0.6 0.7 0.8组2：试管号1 2 3 4 5所加试剂修饰酶（ml） 1 1 1 1 1激活剂（ml）0.9 0.9 0.9 0.9 0.91%酪蛋白（ml）0.2 0.4 0.6 0.7 0.8组3：试管号1 2 3 4 5所加试剂缓冲液（ml） 1 1 1 1 1激活剂（ml）0.9 0.9 0.9 0.9 0.91%酪蛋白（ml）0.2 0.4 0.6 0.7 0.8（3）混匀后，在37度水浴下反应10min，向15支试管中各加入8ml的1mol/L氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置30min；（4）分别取15支试管中溶液，在275nm波长下测定吸光度；（5）数据处理（五）结果1、在酶试剂中加入甘油、乙二醇、甘露醇及葡萄糖等稳定剂后，酶变性速率减慢，酶活性下降趋势减缓。
未修饰酶的活力大于修饰酶的活力2、在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好,同时果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。
菠萝蛋白酶提取时,p H 值为6. 5～8.5 左右,温度为60 ℃,菠萝蛋白酶的活性最强,可作为最佳提取条件。
3、温度对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响较大，当浸提液温度超过50℃，浸提液中菠萝蛋白酶将明显失活．浸提液的pH对浸提液中菠萝蛋白酶活性有影响，在浸提液原始pH条件下，浸提液中菠萝蛋白酶稳定性最好．4、理化因素影响的列表（六）讨论1、菠萝蛋白酶在提取分离和干燥过程中，酶的活性中心巯基易被氧化而使酶活性降低。
在提取过程中适当加入某些抗氧化剂，对阻止酶被氧化失活有良好作用。
作为菠萝蛋白酶活性保护剂，硫代硫酸钠与半胱氨酸组合使用，可获较好的效果。
2、维系酶分子三维构象的作用力包括:氢键、疏水相互作用、静电相互作用、范德华力，有些还包括共价二硫键，蛋白质分子不管是变性、还是增强稳定性，都是通过影响这些作用力来实现的。
但总的来看，氢键、疏水相互作用在增强酶的稳定性方面起着主要作用。
3、TNBS法测定修饰率取1mL蛋白酶溶液(1mgPmL),加入1mL4 %的碳酸氢钠溶液,1mL10%的十二烷基磺酸钠溶液,20min 后加入1mL0.1%的TNBS 溶液,40℃保温2h ,用0.5mL 1mol/L的盐酸终止反应。
325nm测光吸收值。
同样浓度蛋白酶溶液在修饰后与修饰前的光吸收值之比即为残留氨基率。
修饰率=1-残留氨基率= 1- 修饰后的光吸收值P修饰前的光吸收值4若菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：(1)、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；(2)、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；(3)、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；(4)、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；(5)、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。
(6)、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶液微浑浊，对吸光度的测定有影响。