乳酸菌检验操作规范培训

一、实训目的本次实训旨在通过实验操作，掌握乳酸菌的检测方法，了解乳酸菌的基本特性，提高对微生物检测技术的实际操作能力，并加深对乳酸菌在食品、医药等领域的应用认识。

二、实训时间2023年10月25日至2023年11月5日三、实训地点生物实验室四、实训内容1. 乳酸菌样品的采集与处理2. 乳酸菌的分离纯化3. 乳酸菌的形态观察4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定5. 乳酸菌产酸能力的测定五、实训方法1. 乳酸菌样品的采集与处理（1）采集：从市场上购买含有乳酸菌的酸奶、酸奶饮料等样品。

（2）处理：将样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，制成系列稀释液。

2. 乳酸菌的分离纯化（1）平板划线法：将稀释后的样品涂布在MRS平板上，用无菌接种针进行划线。

（2）培养：将平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。

（3）挑取单菌落：根据菌落的特征，挑取疑似乳酸菌的单菌落。

3. 乳酸菌的形态观察（1）制作临时玻片：将挑取的单菌落涂布在载玻片上，用无菌盖玻片覆盖。

（2）显微镜观察：在显微镜下观察乳酸菌的形态、大小、排列等特征。

4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定（1）革兰氏染色：将挑取的单菌落涂布在载玻片上，进行革兰氏染色。

（2）生化反应：进行糖发酵试验、氧化酶试验、V-P试验等。

5. 乳酸菌产酸能力的测定（1）制作MRS培养基：按照实验要求配制MRS培养基。

（2）接种：将挑取的单菌落接种于MRS培养基中。

（3）培养：将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24小时。

（4）测定pH值：使用pH计测定培养基的pH值，计算产酸能力。

六、实训结果与分析1. 乳酸菌样品的采集与处理采集了5个样品，均成功制成系列稀释液。

2. 乳酸菌的分离纯化共分离纯化出10个疑似乳酸菌的单菌落。

3. 乳酸菌的形态观察在显微镜下观察到乳酸菌为杆状，大小约为0.5～1.0μm，排列呈链状。

4. 乳酸菌的生理生化特性鉴定10个疑似乳酸菌均呈革兰氏阳性，能发酵乳糖，不产生硫化氢，氧化酶试验阴性。

引言概述：乳酸菌饮料是一种富含乳酸菌的食品，乳酸菌在食品工业中广泛应用于酸奶、乳饮料等产品中。

本文将详细介绍乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法。

正文内容：一、样品采集和制备1.确定样品采集时机：乳酸菌饮料中的乳酸菌数量会随着储存时间的增加而增加或减少，因此需要在存储时间稳定的情况下进行采集。

2.采集样品方法：使用无菌技术采集样品，避免外部微生物的污染。

3.样品制备：将采集到的样品进行均匀搅拌，以保证样品的均匀性。

二、总菌数检验方法1.琼脂平板法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，在琼脂平板上涂布，经过一定孵育时间后，根据菌落的数量计算总菌数。

2.膜过滤法：将样品通过膜过滤器过滤，将过滤后的膜放置在琼脂平板上孵育，根据菌落的数量计算总菌数。

三、乳酸菌检验方法1.培养基选择：根据乳酸菌的生长特性选择适合的培养基，常见的培养基有MRS培养基、LBS培养基等。

2.乳酸菌的分离：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在选定的培养基上。

经过一定孵育时间后，可以观察到乳酸菌形成的菌落。

3.鉴定乳酸菌：使用形态学观察、生理生化试验和分子生物学方法等进行乳酸菌的鉴定。

四、活菌数检验方法1.孵育培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在含有乳酸菌生长所需营养物质的培养基上。

经过一定孵育时间后，观察活菌的生长情况，计算活菌数。

2.阻碍培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，与含有抑制剂的培养基混合。

通过观察生长情况，计算活菌数。

五、质量指标评价方法1.pH值测定：使用pH计或试纸对乳酸菌饮料中的pH值进行测定，根据标准范围评价产品的质量。

2.乳酸浓度测定：使用乳酸测定仪器或化学试剂对乳酸菌饮料中的乳酸浓度进行测定，根据标准范围评价产品的质量。

3.品尝评价：通过专业的品尝人员进行品尝评价，评估乳酸菌饮料的口感和风味。

总结：乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法包括样品采集和制备、总菌数检验、乳酸菌检验、活菌数检验和质量指标评价方法。

河北世翔生物有限公司乳酸菌检验方法前言1.本检验方法针对公司各种形式（固态、液态）的乳酸菌菌微生物添加剂；2.本标准的制定依据GBT 23181-2008 、SNT 1941.1-2007、GB 478935-2010等国家标准制定；3.本标准由研发部起草，经公司总经理批准，公布之日起实施。

一、检验前的准备1.培养基及其试剂1.1盛有若干玻璃珠的无菌水225ml，1.2MRS琼脂培养基：牛肉膏10g蛋白胨10g酵母膏5g121℃，灭菌15-20min1.3培养皿12个，试管12个，涂布棒1个，用报纸包扎后灭菌1.4打开超净工作台，用消毒水或者酒精喷洒，工作台台面，打开紫外灯杀菌30分钟，打开风机，5分钟后，打开照明二、取样按照GB/T14699.1进行取样：用灭菌的铲子，选取有代表性的样品适量放入取样袋中，标注好取样日期，批次备用；液体取样使用灭菌的试管，在火焰保护下进行，完成后放入低温冰箱储藏。

三、检测步骤1. 以无菌操作称取试样25g（ml），加入225ml有玻璃珠的无菌水中，放在摇床上，200r/min，摇动30min，制成1：10的初始菌悬浮液。

取1：10的初始菌悬浮液0.5ml，加入4.5ml无菌水，经充分混匀后，制成1：100的稀释液。

依次方法依次稀释到1：1082.选择107 、108 二个稀释度，用移液枪分别吸取0.1ml，接种到3个营养琼脂平板上，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘，涂布好的平皿改好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。

翻转上述平皿置于36±1℃培养箱中培养48±2h。

从样品稀释到涂布完成要求在15分钟内完成。

3.培养后，选取菌落数在30到300个之间的平板计数，低于30 CFU 平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。

每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜计数；若片状菌落步不到平板的一半，而其余一半分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。

实验一酸奶中乳酸菌总活菌数的检验一、实验目的（一）学习酸奶中乳酸菌的组成，以及储藏条件对酸乳中乳酸菌总活菌数的影响。

通过对酸奶中乳酸菌总活菌数的检测，包括培养基的制备，样品的处理，梯度稀释样品和倒平板等内容，综合训练食品卫生检验的基本技能。

（二）掌握酸奶中乳酸菌总活菌数的检测方法。

二、实验原理活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。

由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。

测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。

要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。

采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。

三、实验器材生化培养箱、恒温水浴锅、超净工作台、微量移液器（1mL、100μL）、高压蒸汽灭菌锅、酸度计、天平、酒精灯、三角瓶、烧杯、量筒、培养皿、试管（20-30mL）四、实验试剂蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、K2HPO4、柠檬酸二铵、乙酸钠、葡萄糖、蒸馏水、吐温80、NaCl 五、实验内容（一）操作步骤酸奶→稀释→制平板→培养→检查计数（二）配制生理盐水生理盐水（0.9%）：称取0.9克NaCl，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100mL，121℃高压灭菌15min，备用。

（三）培养基的配置按照MRS固体培养基的配方（见表1）称取相应的试剂于烧杯或三角瓶中，加少量蒸馏水溶解后，用量筒定容至相应刻度，分装于小三角瓶中，用高压灭菌锅121℃高压灭菌15min。

灭菌完后，将其至于60℃的恒温水浴箱中，备用。

表1 1000mLMRS培养基配方（四）酸奶样品的稀释、制平板1.样品选择酸奶样品分两类，一类是室温放置一周的酸奶，一类是4℃存放的酸奶。

对两类酸奶的样品处理均一致。

2.样品稀释先将酸奶样品搅拌均匀，用移液器取1mL酸奶样品于9mL的灭菌生理盐水试管中，充分摇匀，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，连续稀释至10-9。

乳酸菌活菌数量检测方法--菌落计数法本方法适用于乳酸菌制剂及配合饲料中有效活菌数和杂菌率的测定。

按照国家标准GB/T 14699.1进行抽样，获得样品200g，分装于两个无菌、干燥的玻璃瓶中，贴上标签，注明产品名称、批号、取样日期等信息。

一瓶供检验用，一瓶密封保，以备复查。

一、测定原理：乳酸肠球菌用肠球菌琼脂培养基，杂菌用营养琼脂培养基；培养后利用平板菌落计数法进行计数。

二、培养基与缓冲液配方：（1）营养琼脂培养基，每L蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 18.0g 水稀释至1000ml PH 7.0~7.4（2）肠球菌琼脂培养基，每L蛋白胨 20.0g蔗糖 5.0g 葡萄糖 5.0g 乳糖 5.0g 酵母膏 5.0g氯化钠 4.0g 乙酸钠 1.5gVc 0.5g 琼脂 17.0g 水稀释至1000mlPH 6.5~7.0（3）PH6.8磷酸缓冲液配制方法取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀即得。

三、样品处理：（1）乳酸菌纯品制剂样品测定乳酸菌纯品制剂时，取样量为1g，溶解到100ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为100:1。

（2）配合饲料样品测定饲料样品时，取样量为25g，溶解到225ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为10:1。

四、有效活菌数、杂菌数的测定：（1）本方法采用平板菌落计数法（2）操作方法：1．取磁力搅拌棒装入500ml三角瓶中，再量225ml PH6.8的磷酸缓冲液一并装入三角瓶中灭菌备用。

纯品制剂量取缓冲液100ml。

2．取25g饲料样品放入三角瓶中，在磁力搅拌器中震荡混匀5min后，再放到摇床上37℃，150转/分，充分震荡45min，混匀成1：10稀释液。

纯品制剂样品量为1g，混匀成1：100稀释液。

3．在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释。

用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul缓冲液的离心管内，并在液体中反复吹打5次，在漩涡振荡器上震荡30s混匀（注意每次稀释时更换枪头及充分震荡混匀）。

《农产品/食品质量安全检测技术》课程-微教材知识讲解一、检验操作程序1、样品处理（1）无菌室消毒和准备本实验主要在无菌室中进行，无菌室的消毒和准备如下：①进入无菌室缓冲间，将样品放入传递窗中，打开传递窗紫外灯进行表面杀菌。

②进入已进行整体消毒过的无菌室，用75%酒精棉擦拭超净工作台台面和工作台面，将消毒水废液缸等常用物品放置在台面上。

依次开启超净工作台和无菌室的紫外灯，辐照灭菌30min后，依次关闭无菌室、超净工作台和传递窗的紫外灯。

③进入无菌室缓冲间，更换无菌工作服，戴一次性帽子、口罩和无菌手套，穿上鞋套，用75%酒精棉彻底消毒双手，取出传递窗内的物品，放在工作台面上，进行后续操作。

（2）样品处理在无菌室内，以75%酒精擦拭酸奶样品外包装，尤其是包装的开口处，然后使用无菌剪刀拆开酸奶包装封口。

接着，用无菌药匙称取酸奶样品25 g，加入到盛有含无菌生理盐水225 mL的样品罐中，振荡均匀，做成1:10 样品匀液。

2、梯度稀释（1）将实验材料放入超净工作台，根据对待检样品活菌总数的估计，乳酸菌总数和嗜热链球菌选择的样品浓度为10-5、10-6和10-7，双歧杆菌选择的样品浓度为10-4、10-5和10-6。

因此，按照样品选择浓度，先用记号笔分别对MRS、改良MRS和MC平板进行相应编号，然后对梯度稀释的试管进行-2、-3、-4、-5、-6和-7样品浓度编号。

（2）轻轻摇动1:10 样品匀液，用 1 mL 微量移液枪吸取匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL 生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液），涡旋振摇试管使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。

（3）另取1 mL微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10 倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用 1 次 1 mL 灭菌吸头。

（4）梯度稀释一直持续稀释到10-73、涂布分离（1）选择-5、-6、-7这3个稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL 样品匀液分别置于2 个MRS 琼脂平板，使用灭菌涂布棒进行表面涂布，用于乳酸菌总数计数。

乳酸菌检验的方法要点乳酸菌不是分类学上的名称，它是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳糖产生乳酸、需氧和兼性厌氧、多数无动力、过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性的无芽孢杆菌和球菌。

这类细菌在自然界分布广泛，可栖居在人和各种动物的口腔、肠道等器官内，在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在。

乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高，相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用，但个别菌种能对人畜致病，乳酸菌主要包括23个属的细菌。

乳酸菌的检测流程：1、乳酸菌悬液的制备：将待检测的样品，准确称取0.5克，量取99.5mL无菌生理盐水稀释，（此次稀释了200倍，即0.5克样品，稀释到了100克水溶液），再加入灭菌玻璃珠20～30粒于250mL三角瓶中，置于振荡器或摇床上剧烈摇晃30分钟以上，目的是将粘连在一起的乳酸菌细胞打散从而分散开来。

2、稀释到适当倍数：根据所待检测的样品可能的乳酸菌含量，进行适当的稀释操作，例如如果估计样品的含乳酸菌活菌数为200亿/克左右，则建议稀释2亿倍，这样将来在90mm平板上培养时会长出大约100个乳酸菌落，比较便于计数，总之控制平板培养皿上的乳酸菌落数量在30～300个的范围内，比较便于计数。

3、倒制平板即“接种”：倒制平板在超净工作台上进行，养殖户可使用一盏简单的酒精灯和一个干净的操作台就可操作。

即事先配制好并灭菌处理的检测用琼脂培养基，在水浴锅内保持50℃的温度，使琼脂培养基呈溶解状态，置于操作台旁边备用。

（养殖户可先不从压力锅中取出，在压力锅维持一定的温度，从而也不会凝固。

）取事先干热灭菌处理后的90mm培养皿（也叫平板）若干、1mL移液管若干，置于操作台上备用。

（养殖户的培养皿平板可在压力锅中进行蒸汽灭菌处理。

）在无菌条件下（打开超净工作台无菌风，或养殖户点上酒精灯），将稀释了2亿倍的乳酸菌液，用移液管移取1mL，于培养皿中，再在此培养皿中倒入前述保持溶解状态的检测培养基液15mL左右（倒培养基时，估计能覆盖满平皿的液体量即可），然后，盖好培养皿盖，轻轻转动平皿，原地转几圈，使培养基液与乳酸菌液混合均匀，等数分钟后，待培养基凝固后，可移入培养箱中进行培养；4、在培养箱中进行培养：将前面倒制好的平板倒转（即盖子在下面），放于培养箱中于33℃温度下培养2～3天，待培养皿平板中长出比较明显的带有透明圈的菌落时，即可进行计数得出检测结果。

食品检验工考证资料----朱庆玲2011年4月培训题目：酸乳中乳酸菌的检测（GB/T4789.3-2003）考试时间为3小时，占分为40分考核操作过程是：一、酸奶的检测注：实验前要注意填写好考官给的评分表，接着开始做实验前要先消毒手和桌面，用消毒棉球。

1、用25ml吸量管吸取25ml酸奶放到装有225ml的无菌水的锥瓶中混匀，制成10-1的稀释级；2、用1ml灭菌吸管吸取10-1稀释液1ml，沿管臂慢慢注入还有9ml的无菌水的试管里，振摇混匀即得10-2的稀释级，同理制成10-3，10-4一直到10-7。

注意每递增稀释一次，必须另换1支1mL灭菌吸管；3、选择三个稀释级来做平板，选10-5 10-6 10-74、每个稀释级做两个平板，对应每个平板加1ml的稀释液；5、加培养基（混菌平板的制备），6套平皿都加上培养基，但要注意培养基的温度。

6、同时要做一个空白实验，即是在一个平皿中加入1ml的无菌水，然后再加入培养基。

注意从1到6点的操作不要超过20分钟。

二、鉴定及出报告（老师准备两个已经培养好菌的平板，一个用来计数，一个用来做革兰氏染色镜检，看清标记）1、从平板中挑取5个菌落进行镜检（做5张片）革兰氏染色法：涂片→干燥→固定→结晶紫初染（1min）→水洗→卢戈碘液媒染(1min)→水洗→95%乙醇脱色(20-30s)→水洗→番红复染(1min)→水洗→干燥→镜检(油镜观察、用香柏油) →清洁显微镜（先用擦镜纸擦一遍，接着滴1到2滴二甲苯到擦镜纸上再擦镜头，最后再用干净的擦镜纸再擦一遍镜头）。

在油镜头下观察到的结果要让考官看并打分。

乳酸菌：革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无芽孢的球菌或者杆菌。

注意：本次的乳酸菌是兼性厌氧菌，可能有的会长在培养基里面，所以用接种针挑菌时一定要挑开培养基。

2、过氧化氢酶试验：就用刚挑过菌的接种针直接伸进3%过氧化氢试管中静止放置，注意观察接种针周围是否有气泡。

无气泡为过氧化氢酶阴性，有气泡则为阳性。

乳酸菌检验操作规程1、感官性状：取本品适量，置于非太阳光直射条件下的明亮处，目视检测，应为白色至淡黄色粉状固体，无发霉、结块。

2、水分：精密称取本品5.0g，置于经105℃烘干至恒重的扁形称量瓶中，在105℃条件下干燥至恒重，计算减失重量的百分率，应≤8.0%。

3、粒度：称取供试品100g，置于40目标准筛中，手动振筛10分钟，称取筛上物质量，应能100%通过40目筛。

4、目标菌数：4.1、试剂和培养基4.1.1、稀释液：0.85%生理盐水经121℃高压灭菌30分钟；取0.85%灭菌生理盐水9ml，置于具塞离心管中，密封，经121℃高压灭菌30分钟。

4.1.2、MRS培养基：称取蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80-1.0ml、七水磷酸氢二钾2.0g、三水醋酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、七水硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、琼脂粉15.0g，将除琼脂粉的上述各组分置于1000ml纯化水中，加热搅拌使溶解，调pH值为7.0±0.1，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液2.0ml，摇匀，分装于预置琼脂粉的锥形瓶中，密封，经115℃高压灭菌30分钟，在无菌条件下注入灭菌后的平皿中，每个平皿约注入15ml培养基。

4.2、检测方法：在无菌条件下操作，固体中间产品取样10.0g，置于含90ml灭菌稀释液的锥形瓶中，其中置玻璃珠数颗，超声处理2分钟，振摇使样品完全分散于溶液中，即为1:10的稀释液；移液器或灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，置于含灭菌稀释剂9ml的离心管（或试管）中，密封，摇匀；按上述稀释次序递次稀释至适宜的稀释倍数；取2-3个适宜稀释倍数离心管，用移液器或灭菌吸管吸取0.1ml，接种至经37℃预培养24小时的MRS培养基平皿上，每个浓度接种两个以上平皿，使用灭菌后的L形涂布棒小心涂布接种液于培养基表面，涂布好的平皿盖好后室温静置15分钟，密封并倒置平皿于37±1℃培养箱中培养48小时观察。