最新]酵母双杂交幻灯片

C
Interaction between the bait and library proteins in vivo a activates transcription of
The reporter gene.
构建诱饵蛋白质粒(BD质粒)
↓ 检查BD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续)
天然Gal4分子由一条多肽链组成，含881个氨基酸。它有 两个结构域：DNA结合域（DNA-binding domain, DB），由位 于N-末端的1~147个氨基酸构成，能够识别位于 Gal1 基因的 上游激活序列（upstream activating sequence，UAS），此外， 在其N-端还具有一段核定位序列；转录激活域（DNAactivating, AD），由位于C-末端的768~881位氨基酸构成。当 Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分 接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性。
Fields等以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为 模型设计了一个新的检测蛋白-蛋白相互作用的系统。
将Snf1与DB融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上。其 中，Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的 一个结合蛋白。研究者将两种穿梭质粒转化酵母GGY：171菌株， 该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。
transcription; b. hybrids containing either DB(upper)or AD(lower)are incapable of inducing transcription; c. a protein-protein interaction between proteins X and Y brings the Gal4 domains into closes proximity
↓ AD质粒转化带有BD质粒的酵母菌，再次验证其相互作用
↓ 阳性AD质粒测序，按在酵母中读框方式进行蛋白同源性查询
↙ 如果找到候选蛋白，克隆其
↘ 如果找不到候选蛋白，有可能
全基因，采用GST融合表达 技术和体外翻译技术在蛋白
是新基因，可进一步分析，设 计引物，克隆全基因并进一步验证
↓ 基因，铺 SD/四缺平板
↓ 挑his+、ade+双阳性克隆作β-galactosidase分析，消除假阳性
பைடு நூலகம்
↓ β-gal分析阳性质粒在SD/四缺平板与摇管中传代，去除无效AD质粒
↓ 传代阳性酵母质粒分离，转化大肠杆菌，获得大量阳性AD质粒
↓ 检查AD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续)
and results in transcriptional activity
双杂交系统是由Fields和Song于1989年提出的[1]。它的建立是基于对真核 生物掉空转录起始过程的认识，细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子 的参与。
转录激活因子，例如酵母转录因子Gal4，在结构上是组件式的（modular）， 往往由两个或两个以上结构上可以分开、功能上相互独立的结构域（domain） 构成。其中有DNA结合结构域（DNA bonding domain, DNA-BD）和转录激活 结构域（activation domain, DNA-AD〉。这两个结合域将它们分开时仍分别具 有功能，但是不能激活转录，只有当两者通过适当的途径在空间上较为接近 时，才呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（uostream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下作原理示意图 Fig.1 Model of transcriptional activation by reconstitution of Gal4 activity
a. 天然Gal4蛋白具有DNA结合域和转录激活域，诱导Gal1-LacZ转录； b. 只有DNA结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录； c. 蛋白X和Y之间的相互作用使Gal4的两个结构域接近导致报告基因的转录 a. the native Gal4 protein contains both DNA-binding and activating regions and induces Gal1-LacZ
]酵母双杂交
传统的检测蛋白质相互作用的方法
1. 蛋白质亲和层析
2.
（protein affinity chromatography）
2. 亲和印迹（affinity blotting）
3. 免疫沉淀（immunoprecipitation）
反映的只是蛋白的体外相互作用
2
蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动 几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。在生 物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期， 都离不开蛋白质间的相互作用。近年，随着分子生物 学技术的发展，人们对基因的结构和功能的认识不断 加深，尤其是基因组研究的飞速进展，为揭示生命的 奥秘提供了条件。然而，只凭借基因序列很难认识蛋 白质的功能及在整个细胞中所处的位置和作用。由于 蛋白质相互作用的复杂性，使得这方面的研究工作进 展缓慢。最近兴起的双杂交系统为研究蛋白质的相互 作用提供了一套崭新的方法。
酵母双杂交系统的基本原理
The DNA-BD/protein X (bait) hybrid binds to the GAL1 UAS but cannot activate
A
transcription without the activation domain (AD).
B In the absence of bait protein, the AD/library fusion protein cannot bind to the GAL 4 UAS and thus does not activate transcription.