聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方

聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。

其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。

2.试剂(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。

(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。

(3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。

(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml 与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。

(5)染色液取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。

(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。

(7)脱色液 7％醋酸溶液。

3.操作(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。

(2)标准品溶液及供试品溶液的制备(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。

6 ％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验试剂及配制：a, 40 %丙烯酰胺单体凝胶贮存液。

丙烯酰胺38 g，甲叉双丙烯酰胺 2 g，加双蒸水定容至 100mL，过滤，贮存于棕色瓶中。

b,变性剂。

1 M NaOH 1 mL，甲酰胺 95 mL，溴酚蓝 0. 05 g，二甲苯青 0. 05 g，加双蒸水定容至100 mL。

C, 固定液。

100 mL 冰醋酸溶于双蒸水定容至1 000 mL。

d, 银染液。

硝酸银 1 g， 37 甲醛 1. 5 mL，加双蒸水定容至1000 mL。

f, 显影液。

无水碳酸钠 30 g， 37 甲醛 1. 5mL， 10 mg /mL 硫代硫酸钠 200 μL，加双蒸水定容至 1 000 mL。

DNA 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作流程6 ％变性凝胶的制备：40 %的凝胶贮存液 11. 2 mL，尿素36.36g， 5 × TBE 15mL，加双蒸水定容至 75 mL。

预冷至 4 ℃后，加入500 μL 10 过硫酸铵和 50 μL TEMD 混合均匀，灌胶。

灌胶完毕，插入样品梳，在室温下聚合 30 ～60 min。

聚合完全后，梳齿下可见二条折光线。

电泳:安装电泳装置，在电泳槽中加入1 × TBE缓冲液，使缓冲液覆盖样品孔。

拔出样品梳，用移液器吸取适量缓冲液冲洗样品孔。

打开变压器，恒定功率 60 W 预电泳 15 ～30 min。

预电泳结束后，用移液器将 DNA 样品小心注入样品孔中( 加样量为 3 ～ 5 μL) ，电泳直至带型分开。

固定:关闭电源，卸下玻璃板，剥离玻璃板，将胶板置于固定液中固定 30 min，直到指示剂颜色褪去。

漂洗:将胶板转移到双蒸水中漂洗三遍，每次 2 ～ 3 min。

染色:转移胶板至染色液中，在摇床上摇动染色 30 ～ 40 min。

显影:将胶板在双蒸水中漂洗 5 ～ 10 s 后立即放入预冷为 4 ℃～ 10 ℃的显影液中，摇动显影直到带型完全出现。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ． 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。

2 ．熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。

在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂 过硫酸铵（Ap ） 和加速剂 四甲基乙二胺（ TEMED ） 的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。

根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章）， 使样品分离效果好， 分辨率较高。

一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质， 应用十分广泛。

图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。

本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚 度 为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。

【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。

2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶制备4.1 清洗玻璃板、灌胶用量筒和烧杯，玻璃板气干(制胶用玻璃板为硫化玻璃，灌胶面必须干净无水分，否则灌胶时容易产生气泡；烧杯、量筒和玻璃板如果有水，由于胶与水不相溶，易使胶不能牢固粘在玻璃板上)；4.2将平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌面的支撑物（瓶盖等）上，给玻璃板滴少量100%乙醇，用质量好的纸均匀擦洗制胶面，气干；4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三个边均匀的涂抹适量凡士林（凡士林太多不容易清洗）；放上需要厚度的板条，此步应注意密封好板条的相接处，用手将三边和接茬处按牢固，否则容易漏胶；然后用夹子（夹子夹在板条中间）将玻璃板固定于灌胶架上；4.4 配胶（8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，Acr:Bis=37.5:1）、灌胶;将以下母液按量混合均匀保存于4℃，一般一周内用完，溶液 120ml 240ml40%Acr 24ml 48ml2%Bis 12.84ml 25.68ml10XTBE(8.3) 12ml 24mlddH2O 70.8ml 141.6ml针对所选用的胶的大小和厚度量取适量以上混合液倒入干净烧杯，加入适量10%APS（催化剂）和TEMED（加速剂），摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固；（注：1 聚丙烯酰胺凝胶在凝固以前有毒，凝固后无毒，因此操作时应戴上手套； 2 板条和梳子厚度必须一致，否则将在点样孔中产生胶膜，影响点样和最后电泳质量）对于20cm x 17cm的玻璃板，除去板条尺寸，胶为16.5cm(宽) x 15.5cm(高) x 1mm(厚)，配制如下：胶混合液10%APS TEMED一板胶30ml 180μL 80μL两板胶60ml 360μL 160μL制胶及电泳（1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%乙醇擦拭。

1 用1～2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2～3次）2 用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2～3次）3 用加样枪取0.5～1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（擦至感觉特别光滑为止）4 用1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分）5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取0.4mm的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

一、材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。

30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。

过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。

1.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

2.10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。

能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。

配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。

过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。

过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。

同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。

3.N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。

TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。

另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。

配制方法：原液使用。

应使用电泳级TEMED。

4.30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液） :含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。

丙烯酰胺单体（Arc）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。

N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），交联剂。

丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。

聚丙烯酰胺凝胶配制方法聚丙烯酰胺凝胶配制方法5×tbe（组份浓度：5×tbe，ph8.3；配制量：1l）：称取53.9gtris，27.5g硼酸，量取20ml0.5mol/ledta（ph8.0），置于1l烧杯中；加入约800ml超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至1l；室温保存。

10%过硫酸铵（组份浓度：10%(w/v)过硫酸铵；酿制量：10ml）：称取1g过硫酸铵，放在10～50ml烧杯中；重新加入约8ml超纯水，烘烤熔化；提超纯水将溶液定容至10ml；4℃留存（留存时间为2周左右，少于期限过硫酸铵将丧失催化作用）。

30%丙烯酰胺（组份浓度：30%(w/v)丙烯酰胺；配制量：1l）：称取290g丙烯酰胺，10gn,n'-亚甲基双丙烯酰胺，置于1l烧杯中；加入约600ml超纯水，水浴加热至37℃，充分搅拌至溶解；加超纯水将溶液定容至1l，用0.45μm滤膜过滤除去杂质；并检测该溶液ph值应不大于7；棕色瓶4℃保存。

0.1%agno（0.1%(w/v)agno3；酿制量：1l）：称取1gagno3，3组份浓度：放在1l烧杯中；重新加入约800ml超纯水，；提超纯水将溶液定容至1l；棕色瓶室温留存。

显色液（组份浓度：2%(w/v)naoh，0.04%(w/v)na2co3，0.4%(w/v)37%甲醛；配制量：1l）：称取20gnaoh，0.4gna2co3，置于1l烧杯中；加入约800ml超纯水，充分搅拌溶解；加4ml37%甲醛溶液，加超纯水将溶液定容至1l；室温保存。

10%冰乙酸（组份浓度：10%冰乙酸；酿制量：1l）：量挑100ml冰乙酸，放在1l烧杯中；重新加入约800ml超纯水，烘烤搅匀；提超纯水将溶液定容至1l；室温留存。

2.2.6电泳检测2.2.6.1玻璃板清洗首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反反复复冲洗；然后用ⅲ级蒸馏水冲洗2～3次，直到玻璃板表面发生光滑水膜，既不T4300水滴，也未成股泣不成声；再用超纯水冲洗1次，晒干；最后用无水乙醇冲洗，晒干水泵[74]。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验目的:测定蛋白质亚基的分子量及纯度实验原理：在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。

当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。

基本过程：制胶、电泳、检测试剂：（储液由专业人员配置）30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、1.5mol/L Tris-HCl, pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl, pH6.8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇器材：灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪实验操作程序：1．安装灌胶模具，依照说明书进行2．按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml），过硫酸铵和TEMED在用前加入。

3．分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇（或水饱和的异丙醇、水），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。

4．室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，用浓缩胶缓冲液淋洗胶面，然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。

5．静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。

6．制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1：1混合，与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug）7．加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。

8．连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶，9．溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶，做好标记，准备染色。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告引言聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的生物分子分析技术。

它通过应用电场，将带电的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白质）在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离和测量。

本实验旨在通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析DNA分子的大小和浓度。

材料与方法1. 准备聚丙烯酰胺凝胶：将聚丙烯酰胺粉末加入缓冲液中，并加热至溶解，制备成一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶。

2. 制备样品：将待测DNA样品与DNA标记物混合，加入一定体积的加载缓冲液，并加热至退变。

3. 电泳操作：将准备好的样品注入凝胶槽，连接电源，施加一定电压使DNA分子在凝胶中移动。

4. 染色与观察：将电泳结束后的凝胶进行染色，使用紫外线透射仪观察和记录分离出的DNA带。

结果与讨论通过实验我们得到了一张聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果图。

图中展示了不同大小的DNA分子在凝胶中的分离情况。

根据DNA标记物的迁移距离和已知标准品的迁移距离，我们可以测量待测DNA样品的大小和浓度。

在实验中，我们发现较大的DNA分子在凝胶中迁移较慢，而较小的DNA分子则迁移较快。

这是因为聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，较大的DNA分子难以穿过这些孔隙，因此迁移速度较慢。

而较小的DNA分子则能够更容易地通过孔隙，因此迁移速度较快。

我们还观察到，在电泳过程中，DNA分子会受到电场的作用而带有电荷，向阳极（电场的正极）移动。

根据DNA分子的电荷量、大小和凝胶孔隙的大小，我们可以通过调整电场强度和凝胶浓度来控制DNA分子的迁移速度和分离效果。

结论通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们成功地分离和测量了DNA分子的大小和浓度。

这项技术在生物学和分子生物学研究中具有重要的应用价值，可以用于DNA测序、基因突变检测和蛋白质研究等领域。

然而，在实际应用中，我们需要注意凝胶浓度、电场强度和染色方法等因素对实验结果的影响，以确保实验的准确性和可重复性。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常见的蛋白质分离技术，它是以电荷和大小为基础对蛋白质进行分离的方法。

本文将介绍十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、步骤、优点和应用。

一、原理十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种非常规的凝胶电泳技术，它利用十二烷基硫酸钠（SDS）将蛋白质分子进行线性化，并使其带负电荷，从而使所有的蛋白质分子在电场中移动速度相同，只受到分子大小的限制。

这种方法可以将蛋白质按照分子大小分离开来，从而实现蛋白质的定量和鉴定。

二、步骤1、制备凝胶：将聚丙烯酰胺单体和交联剂混合，加入TEMED和过硫酸铵，混合均匀后倒入凝胶板中，静置凝固。

2、制备样品：将待测蛋白质样品加入SDS试剂中，使其线性化，并加入还原剂使其还原成硫氢化物。

3、装载样品：将制备好的样品加入凝胶孔中，待样品进入凝胶后施加电场。

4、电泳：将凝胶浸入电泳缓冲液中，施加电场，使蛋白质分子运动到电极上，形成特定的蛋白质条带。

5、染色：将凝胶浸入染色液中，使蛋白质条带显色。

6、成像：将染色后的凝胶进行成像和分析。

三、优点1、能够分离出不同分子量的蛋白质。

2、分离效率高，准确度高。

3、可以同时分析多个样品。

4、操作简单，成本低。

四、应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳广泛应用于蛋白质分离、鉴定和定量等方面，如：1、研究蛋白质表达及其功能。

2、检测蛋白质的异常，如疾病标志物。

3、分析蛋白质的结构和功能。

4、制备蛋白质纯化。

5、鉴定蛋白质。

总之，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常见的蛋白质分离技术，具有分离效率高、准确度高、操作简单、成本低等优点，广泛应用于蛋白质分离、鉴定和定量等方面。

5×TBE（组份浓度：5×TBE，pH 8.3；配制量：1 L）：称取53.9 g Tris，27.5 g硼酸，量取20 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，充分搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。

10% 过硫酸铵（组份浓度：10% (W/V) 过硫酸铵；配制量：10 ml）：称取1 g过硫酸铵，置于10～50 ml烧杯中；加入约8 ml超纯水，搅拌溶解；加超纯水将溶液定容至10 ml；4 ℃保存（保存时间为2周左右，超过期限过硫酸铵将失去催化作用）。

30% 丙烯酰胺（组份浓度：30% (W/V)丙烯酰胺；配制量：1 L）：称取290 g丙烯酰胺，10 g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，置于1 L烧杯中；加入约600 ml超纯水，水浴加热至37 ℃，充分搅拌至溶解；加超纯水将溶液定容至1 L，用0.45 μm滤膜过滤除去杂质；并检测该溶液pH值应不大于7；棕色瓶4 ℃保存。

0.1% AgNO3（组份浓度：0.1% (W/V) AgNO3；配制量：1 L）：称取1 g AgNO3，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，；加超纯水将溶液定容至1 L；棕色瓶室温保存。

显色液（组份浓度：2% (W/V) NaOH，0.04% (W/V) Na2CO3，0.4% (W/V) 37%甲醛；配制量：1 L）：称取20 g NaOH，0.4 g Na2CO3，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，充分搅拌溶解；加4 ml 37%甲醛溶液，加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。

10% 冰乙酸（组份浓度：10% 冰乙酸；配制量：1 L）：量取100 ml冰乙酸，置于1 L烧杯中；加入约800 ml超纯水，搅拌混匀；加超纯水将溶液定容至1 L；室温保存。

2.2.6 电泳检测2.2.6.1 玻璃板清洗首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反复清洗；然后用Ⅲ级蒸馏水漂洗2～3次，直至玻璃板表面出现均匀水膜，既不聚成水滴，也不成股流下；再用超纯水漂洗1次，晾干；最后用无水乙醇擦拭，晾干备用[74]。

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，）1电泳各试剂的配制1.1凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，%C)——为聚丙烯酰胺取丙烯酰胺acrylamide g、双丙烯酰胺N′N′-bis-methylene-acrylamide g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。

4℃避光储存。

即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配）称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。

Tris-HCl，pH称取Tris base g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。

4℃储存。

%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝，去离子水定容至100mL。

Tris-HCl，pH ：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH ，再加去离子水至总体积100mL。

4℃储存。

10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。

凝胶配制按下表比例配制凝胶分离胶及浓缩胶按上表比例配好后，均需脱气15 min。

临灌胶前，往分离胶中加入100 μl 10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。

其中：TEMED为催化剂10×电极缓冲液，pH称取Tris base g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。

4℃储存。

临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。

样品溶解液S去离子水；0.5M Tris-HCl，pH ；glycerol （甘油）10% (w/v) SDS%（w/v）溴酚蓝总体积为 mL。

室温储存。

临用前加50 μlβ-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）于950 μl样品缓冲中，即为样品溶解液。

聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）5101520253040508%水 2.3 4.6 6.99.311.513.918.523.2 30%丙烯酰胺溶液 1.3 2.74 5.3 6.7810.713.3 1.5 mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.03 10%水 1.94 5.97.99.911.915.919.8 30%丙烯酰胺溶液 1.7 3.35 6.78.31013.316.7 1.5 mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 12%水 1.6 3.3 4.9 6.68.29.913.216.5 30%丙烯酰胺溶液246810121620 1.5 mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 12.5%水 1.5 3.1 4.65 6.37.89.412.515.6630%丙烯酰胺溶液 2.1 4.2 6.258.310.412.516.720.84 1.5 mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02 15%水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.99.211.5 30%丙烯酰胺溶液 2.557.51012.5152025 1.5 mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.85 6.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02表2 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）1234568105% 水0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831 1.3 1.7 1.0 mol/L Tris(pH6.8)0.130.250.380.50.630.7501.25 10% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.1 10%过硫酸铵0.010.020.030.040.050.060.080.1 TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01相关溶液贮液的配制30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g甲叉双丙烯酰胺 4gMilliQ水 500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。

D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤(总3页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。

2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。

3、TEMED4、5xTBETris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。

二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。

2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。

3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。

4、37％甲醛。

三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。

室温凝固时间>1小时。

四、银染：1、固定液固定10m。

2、水洗2m x3次。

3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。

4、水洗 20秒x2次。

5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。

6、水洗若干次，终止显色。

电泳时间：150v x3h，溴酚兰的位置相当于40bp。

银染后胶面积将膨胀10％。

在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。

显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。

我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。

因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。

聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳(electrophoresis) 是指带电颗粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。

在生物化学及分子生物学中，主要是根据生物大分子所带电荷的数量及其在分子表面排布的不同来对它们进行分离和鉴定。

电泳现象早在1809年就被发现，但将这种现象用于生物化学领域却萌芽于十九世纪初，1907年，有人曾研究过白喉毒素在琼脂中的电泳；1937 年，瑞典的Tiselius 建立了“移界电泳法”(moving boundary EP),成功地将血清蛋白质分成5个主要成分，即清蛋白、a 1-、a 2-、B -和丫-球蛋白。

其后的几十年，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生。

以所采用的固体支持物区分，有纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳1. 纸上电泳2. 醋酸纤维薄膜电泳3. 薄层电泳4. 非凝胶性支持体区带电泳支持体有：淀粉、纤维素粉、玻 璃粉硅胶、合成树脂粉末5. 凝胶支持体区带电泳（1） 淀粉胶（2） 聚丙烯酰胺① 圆盘电泳法② 平板法③ SDS-凝胶电泳法（3） 琼脂糖凝胶电泳（4） 琼脂凝胶电泳1.双向电泳2.电泳一层析相结合用支持体的电泳技术其他用法包括常压、高压电泳（水平式或垂直式）水平式或垂直式（平板法、柱形法及线丝法）垂直式（柱形法）垂直式或水平式垂直式（测分子量）平板法或柱形法3. 交叉电泳纸4. 连续低电泳等；以电泳形式区分，有在液体介质中进行的，有将支持物做成薄膜或薄层的，有板形或柱形的等(表1)。

电泳由于与光学装置、自动记录仪及自动部分收集器结合，又组成了等电点聚焦仪、等速电泳仪等等，80年代末发展起来的毛细管电泳(capillary electrophoresis) 是在毛细管中装入缓冲液，在其一端注入样品，在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离,, 这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。

电泳按其分离的原理大致可分为四类：区带电泳(zone EP，ZEP)、移界电泳(moving boundary EP, MBEP)等速电泳(isotachophoresis ，ITP) 和等电聚焦(isoelectric focusing ，IEF)。

实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。

这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。

圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。

因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。

仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。

上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。

下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。

上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。

图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。

由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。

下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。

（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。

分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。

样品在其中进行电泳和分子筛分离。

蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。

进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。

由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。

（2）缓冲离子成分的不连续性。

(3)电位梯度的不连续性。

(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。