质粒提取、定量和酶切鉴定

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级： 2018级临床卓越创新班组别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2019-11-05 实验地点第四实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03一、实验目的1.学习并掌握碱裂解法提取质粒的方法2.掌握紫外吸收测定DNA的操作3.了解质粒酶切鉴定原理和方法4.掌握琼脂糖凝胶电泳技术原理，操作二、实验原理1. 碱裂解法：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。

1）pH =12.6（碱性），染色体DNA：氢键断裂，变性。

质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。

（不完全变性）2）（在1）溶液加入KAc溶液调节pH），中性，质粒DNA：复性，继续溶于溶液中染色体DNA：不能复性；形成了、缠连的网状结构。

3）离心后，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来2. 离心层析柱1) 硅基质膜在高盐、低pH值的状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；2）通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3）低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；3. 质粒DNA定量测定：紫外光分光光度计法1）物质在光的照射下会产生对光的吸收效应2）而且物质对光的吸收是具有选择性的3）各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱4）因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在紫外光260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。

5）DNA对波长260nm的紫外光有特异吸收峰，蛋白质在280nm紫外光处有特异吸收峰，A260/A280可以反应DNA纯度。

4.质粒DNA的酶切分析限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA5.琼脂糖凝胶电泳（有电荷效应，分子筛效应）不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动速率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。

（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。

TBE比TAE有相对高的缓冲能力。

（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。

（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。

②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。

③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。

④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。

（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。

pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。

而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。

这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。

可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。

但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。

竭诚为您提供优质文档/双击可除质粒的提取与鉴定实验报告篇一：质粒DnA测定生化实验报告生物化学实验报告姓名：杨晓霞学号：3120XX0025专业年级：20XX级口腔组别：第一实验室生物化学与分子生物学实验教学中心篇二：质粒DnA的提取、纯化与鉴定姓名宿智新学院生命科学学院班级11级生工2班科目分子生物学实验学号20XX00140155第8组质粒DnA的提取、纯化与鉴定摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌Dh5?（e.coliDh5?）中提取puc19质粒，旨在学习并掌握质粒DnA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。

同时通过对质粒DnA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DnA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。

关键词：碱变法质粒电泳实验目的：1.学习并掌握凝胶电泳进行DnA的分离纯化的实验原理。

2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

3.学习并掌握凝胶中DnA的分离纯化方法。

4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。

5.掌握碱变性法提取质粒DnA的方法。

实验原理：1.质粒DnA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DnA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、eb-氯化铯密度梯度离心法和wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DnA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取质粒DnA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

eb-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DnA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DnA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。

少量提取质粒DnA还可用沸水浴法、wizard法等，沸水浴法提取的质粒DnA中常含有RnA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。

碱变性法提取质粒DnA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DnA。

质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。

二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。

三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。

实验一：质粒DNA提取+琼脂糖凝胶电泳*实验目的：1.掌握质粒DNA提取的基本原理和方法2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法*实验原理：1.DNA提取原理1）DNA提取要求：①保证DNA一级结构的完整性；②排除其他分子的污染，使其纯度尽可能提高。

2）DNA样品来源：①培养细胞；②组织样本；③血液样本。

3）主要试剂和材料及仪器：试剂和材料：RNA酶A、细胞悬浮液（Buffer P1)、细菌裂解液（Buffer P2）、中和液（Buffer P3）、漂洗液PW1、漂洗液PW2、洗脱液、质粒DNA吸附柱、滤液收集管仪器：微量移液器、台式微量高速离心机、电泳仪、水平电泳槽、紫外透射仪或凝胶成像系统。

2.电泳原理：1）概念：电泳是指带电粒子在电场中向电势降低的方向移动的现象，移动速度与粒子大小及所带电荷多少有关。

在一定pH条件下，核酸及蛋白质等生物分子呈带电状态，可以进行电泳分析。

2）迁移方向：DNA由负极向正极迁移3）影响目标物迁移速率的因素：分子大小、构象、凝胶浓度、琼脂糖种类、电泳缓冲液、嵌入染料的存在和使用电压等。

4）荧光强度（得率）：荧光的强度是同DNA片段的大小或数量成正比的。

5）琼脂糖凝胶电泳原理：(1)关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子一尤其是蛋白质和核酸。

正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。

通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp大小的DNA片断。

一般琼脂糖胶浓度在0.5%到4%之间，琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。

较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。

(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。

质粒dna的提取实验报告思考题人篇一：质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验材料及用品（1）实验仪器（apparatus）：恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（Vortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（ beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（ comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ）3）、材料与试剂（Reagents）：①溶液I（Solution Ⅰ）：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl （pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）⑤70% 乙醇；⑥平衡酚：氯仿 1：1：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。