Livin基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其对喉癌细胞HEP-2增殖的影响
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中图分类号： Ｒ７３９．６５ 文献标志码： Ａ 文章编号： １００７－６６１１（２０１８）０９－１０６８－０７ ＤＯＩ：１０．１３７５３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－６６１１．２０１８．０９．０１３
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＬｉｖｉｎｇｅｎｅｓｉＲＮＡ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨＥＰ２ ＦＥＮＧＪｕｎ１，ＬＩＬｉ２ ，ＹＡＮＧＪｉｕｍｅｉ１，ＰＥＮＧＴａｏ１（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥＮＴ，ＳｅｃｏｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＮｏｒｔｈＳｉｃｈｕａｎＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＮａｎｃｈｏｎｇＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ６３７０００，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＮｏｒｔｈＳｉｃｈｕａｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ；Ｃｏｒｒｅ ｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅｍａｉｌ：ｆｊｌｘ８８８８＠１６３．ｃｏｍ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｏｆＬｉｖｉｎｇｅｎｅｓｉＲＮＡａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ ＨＥＰ２ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＬｉｖｉｎｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＧｅｎｅＢａｎｋ，ａｎｄｔｈｒｅｅｓｉＲＮＡｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ａｆｔｅｒ ＭｌｕⅠ ａｎｄＣｌａⅠ ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＬｅｎＯＲＴＨＭ ｗａｓｃｌｏｎｅｄ．ＡｆｔｅｒｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｔｒａｎｓ ｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｏｍｐｅｔｅｎｔｂａｃｔｅｒｉａＤＨ５ａｌｐｈａ，ｔｈｅｃａｎｄｉｄａｔｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＵｓｉｎｇＥｃｏＲⅠ ａｎｄＸｂａⅠ ｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３Ｔｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｓｏｍｅ２０００． Ｔｈｅｎｔｈｅ２９３ＴｃｅｌｌｓａｎｄＨＥＰ２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡ ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ ＨＥＰ２ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅＬｉｖｉｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＳＨ２Ｒ，ＳＨ２ ＦａｎｄＮＣｉｎｌａｒｙｎｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＬｅｎＯＲＴＨＭＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３Ｔｃｅｌｌｓ．Ｓｔｒｏｎｇｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅ２９３Ｔｃｅｌｌｓｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｆｔｅｒｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｉｎｔｈｅ２９３ＴｃｅｌｌｓａｎｄＨＥＰ２ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎｔｈｅｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｔｈｅ２９３ＴｃｅｌｌｓａｎｄＨＥＰ２ｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｖｉｒｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｈａｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｖｉｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔｉｎＳＨ２Ｒ［（１２３１±４４３）％］，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎ ＳＨ２ＲａｎｄＳＨ２Ｆ，ＮＣ（Ｐ＜００５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｏｆＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡｈａｓｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉ ｆｉｅｄ．ＴｈｅｓｉＲＮＡｃａｎｒｅｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｖｉｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｌａｒｙｎｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： Ｌｉｖｉｎｇｅｎｅ； ＨＥＰ２ｃｅｌｌｓ； ｓｉＲＮＡ； ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ； ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
·１０６பைடு நூலகம்·
ＪＳｈａｎｘｉＭｅｄＵｎｉｖ，Ｓｅｐ２０１８，Ｖｏｌ４９Ｎｏ９
Ｌｉｖｉｎ基因 ｓｉＲＮＡ慢病毒表达载体的构建及其对喉癌细胞 ＨＥＰ２增殖的影响
冯 俊１，李 丽２ ，杨久梅１，彭 涛１ （１ 川北医学院第二临床医学院耳鼻咽喉科，南充市中心医院耳鼻咽喉科，南充
６３７０００；２ 川北医学院病理学教研室；通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｆｊｌｘ８８８８＠１６３．ｃｏｍ）
摘要： 目的 构建及鉴定 Ｌｉｖｉｎ基因 ｓｉＲＮＡ慢病毒表达载体并观察其对喉癌细胞 ＨＥＰ２增殖的影响。 方法 从基因库获 得 Ｌｉｖｉｎ基因序列，设计 ３段 ｓｉＲＮＡ序列；经 ＭｌｕⅠ和 ＣｌａⅠ双酶切后克隆入慢病毒表达载体 ｐＬｅｎＯＲＴＨＭ，构建 ｐＬｅｎＯＲＴＨＭ ＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡ重组质粒，将其转化感受态细菌 ＤＨ５α，对阳性克隆进行筛选后，用 ＥｃｏＲⅠ和 ＸｂａⅠ双酶切及测序鉴定正确后用 脂质体转染 ２９３Ｔ细胞包装病毒颗粒，感染 ２９３Ｔ细胞及 ＨＥＰ２细胞，用荧光定量 ＰＣＲ检测其对 ＨＥＰ２增殖的影响。 结果 慢病毒表达载体 ｐＬｅｎＯＲＴＨＭＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡ被成功构建；转染 ２９３Ｔ细胞组装病毒液有绿色荧光，并主要表达在细胞膜上；浓缩 后的病毒液感染 ２９３Ｔ细胞及 ＨＥＰ２细胞均有绿色荧光表达。ＳＨ２Ｒ组的 Ｌｉｖｉｎ蛋白相对表达量最低为（１２３１±４４３）％； ＳＨ２Ｒ组与 ＳＨ２Ｆ、ＮＣ组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜００５）。 结论 成功构建了 Ｌｉｖｉｎ基因 ｓｉＲＮＡ慢病毒载体；ＨＥＰ２细 胞 Ｌｉｖｉｎ蛋白表达受到抑制。 关键词： Ｌｉｖｉｎ基因； 喉癌细胞； ｓｉＲＮＡ； 慢病毒载体； 细胞增殖
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＬｉｖｉｎｇｅｎｅｓｉＲＮＡ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨＥＰ２ ＦＥＮＧＪｕｎ１，ＬＩＬｉ２ ，ＹＡＮＧＪｉｕｍｅｉ１，ＰＥＮＧＴａｏ１（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥＮＴ，ＳｅｃｏｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＮｏｒｔｈＳｉｃｈｕａｎＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＮａｎｃｈｏｎｇＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ６３７０００，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＮｏｒｔｈＳｉｃｈｕａｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ；Ｃｏｒｒｅ ｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅｍａｉｌ：ｆｊｌｘ８８８８＠１６３．ｃｏｍ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｏｆＬｉｖｉｎｇｅｎｅｓｉＲＮＡａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ ＨＥＰ２ｃｅｌｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ＬｉｖｉｎｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＧｅｎｅＢａｎｋ，ａｎｄｔｈｒｅｅｓｉＲＮＡｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ａｆｔｅｒ ＭｌｕⅠ ａｎｄＣｌａⅠ ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＬｅｎＯＲＴＨＭ ｗａｓｃｌｏｎｅｄ．ＡｆｔｅｒｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｔｒａｎｓ ｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｏｍｐｅｔｅｎｔｂａｃｔｅｒｉａＤＨ５ａｌｐｈａ，ｔｈｅｃａｎｄｉｄａｔｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＵｓｉｎｇＥｃｏＲⅠ ａｎｄＸｂａⅠ ｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３Ｔｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｓｏｍｅ２０００． Ｔｈｅｎｔｈｅ２９３ＴｃｅｌｌｓａｎｄＨＥＰ２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡ ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ ＨＥＰ２ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅＬｉｖｉｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＳＨ２Ｒ，ＳＨ２ ＦａｎｄＮＣｉｎｌａｒｙｎｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＬｅｎＯＲＴＨＭＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏ２９３Ｔｃｅｌｌｓ．Ｓｔｒｏｎｇｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅ２９３Ｔｃｅｌｌｓｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｆｔｅｒｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｉｎｔｈｅ２９３ＴｃｅｌｌｓａｎｄＨＥＰ２ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎｔｈｅｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｔｈｅ２９３ＴｃｅｌｌｓａｎｄＨＥＰ２ｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｖｉｒｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｈａｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｖｉｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔｉｎＳＨ２Ｒ［（１２３１±４４３）％］，ａｎｄｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎ ＳＨ２ＲａｎｄＳＨ２Ｆ，ＮＣ（Ｐ＜００５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＴｈｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｏｆＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡｈａｓｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉ ｆｉｅｄ．ＴｈｅｓｉＲＮＡｃａｎｒｅｄｕｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬｉｖｉｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｌａｒｙｎｇｅａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： Ｌｉｖｉｎｇｅｎｅ； ＨＥＰ２ｃｅｌｌｓ； ｓｉＲＮＡ； ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒ； ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
·１０６பைடு நூலகம்·
ＪＳｈａｎｘｉＭｅｄＵｎｉｖ，Ｓｅｐ２０１８，Ｖｏｌ４９Ｎｏ９
Ｌｉｖｉｎ基因 ｓｉＲＮＡ慢病毒表达载体的构建及其对喉癌细胞 ＨＥＰ２增殖的影响
冯 俊１，李 丽２ ，杨久梅１，彭 涛１ （１ 川北医学院第二临床医学院耳鼻咽喉科，南充市中心医院耳鼻咽喉科，南充
６３７０００；２ 川北医学院病理学教研室；通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｆｊｌｘ８８８８＠１６３．ｃｏｍ）
摘要： 目的 构建及鉴定 Ｌｉｖｉｎ基因 ｓｉＲＮＡ慢病毒表达载体并观察其对喉癌细胞 ＨＥＰ２增殖的影响。 方法 从基因库获 得 Ｌｉｖｉｎ基因序列，设计 ３段 ｓｉＲＮＡ序列；经 ＭｌｕⅠ和 ＣｌａⅠ双酶切后克隆入慢病毒表达载体 ｐＬｅｎＯＲＴＨＭ，构建 ｐＬｅｎＯＲＴＨＭ ＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡ重组质粒，将其转化感受态细菌 ＤＨ５α，对阳性克隆进行筛选后，用 ＥｃｏＲⅠ和 ＸｂａⅠ双酶切及测序鉴定正确后用 脂质体转染 ２９３Ｔ细胞包装病毒颗粒，感染 ２９３Ｔ细胞及 ＨＥＰ２细胞，用荧光定量 ＰＣＲ检测其对 ＨＥＰ２增殖的影响。 结果 慢病毒表达载体 ｐＬｅｎＯＲＴＨＭＬｉｖｉｎｓｉＲＮＡ被成功构建；转染 ２９３Ｔ细胞组装病毒液有绿色荧光，并主要表达在细胞膜上；浓缩 后的病毒液感染 ２９３Ｔ细胞及 ＨＥＰ２细胞均有绿色荧光表达。ＳＨ２Ｒ组的 Ｌｉｖｉｎ蛋白相对表达量最低为（１２３１±４４３）％； ＳＨ２Ｒ组与 ＳＨ２Ｆ、ＮＣ组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜００５）。 结论 成功构建了 Ｌｉｖｉｎ基因 ｓｉＲＮＡ慢病毒载体；ＨＥＰ２细 胞 Ｌｉｖｉｎ蛋白表达受到抑制。 关键词： Ｌｉｖｉｎ基因； 喉癌细胞； ｓｉＲＮＡ； 慢病毒载体； 细胞增殖
