反转录病毒基因治疗载体及其安全性评价

生１ｆＩ　技　术　通　讯…

１８－－．６－－．，２００７ＬＥ　ＲＳ　ＩＮ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　Ｖｏｌ　１　Ｎｏ　Ｎｏｖ　２００　ｒＩｒｒＥ　·　·Ｏ　·，　１０１３　

文章编号：１００９－０００２（２００７）０６－１０１３－０３　反转录病毒基因治疗载体及其安全性评价　徐述１，２，马玉媛　，吕茂民　，史利军　，章金刚　－　１．军事医学科学院野战输血研究所；国家生物医学分析中心病毒安全检测实验室，北京１００８５０；　２．扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州２２５００９　

综　述　

［摘要】　反转录病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的基因运载工具之一，具有能稳定整合入宿主细胞、持久表达目的　基因、感染细胞范围广、基因容量较大等优点，但其生物安全性还存在争议。在简要介绍反转录基因治疗病毒载体的基础　上，对反转录病毒载体中外源目的基因的表达调控及反转录病毒载体的安全性评价进行了综述。　［关键词】　基因治疗；反转录病毒载体；基因表达调控；安全性评价　［中图分类号】Ｑ７８９　［文献标识码】Ａ　

Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｓａｆｅｔｙ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｘｕ　Ｓｈｕ　０　ＭＡ　Ｙｕ—ｙｕａｎ　，Ｅ１）Ｍａｏ—ｍｉｎ　，ＳＨＩ　Ｌｉ－ｊｕｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｊｉｎ－ｇａｎｇａ２　１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｌａｂ　ｏｆ　Ｖｉｒａｌ　Ｓａｆｅｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００８５０；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ　２２５００９，Ｃｈｉｎａ　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｃｏｍｅ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ．Ｔｈｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｔｈａｔ　ｒｅｔｍｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｏｆｆｅｒ　ｉｎｃｌｕｄｅ　ｔｈｅｉｒ　ａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｔｏ　ｓｔａｂｌｙ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｅ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ，ｔｏ　ｐｅｒ－　ｍａｎｅｎｔｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ￣ａｎｓｄｕｅｅｄ　ｇｅｎｅｓ，ｔｏ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅ　ａ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅｓ，ｔｏ　ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ　ｌａｒｇｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｈｏｗ—　ｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｂｉｏｓａｆｅｔｙ　ｏｆ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｉｓ　ｃｏｎｃｅｒｎｅｄ　ａｎｄ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｒｅｖｉｅｗ，ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ，ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｓａｆｅｔｙ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ；ｒｅｔｍｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ；ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ；ｓａｆｅｔｙ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　

基因治疗的目的是将治疗性基因导人靶细胞中，使其稳定　有效地表达治疗性分子，并尽量避免任何可能的炎症反应或细　胞毒性副作用。目前基因治疗中一个亟待解决的问题是如何选　择合适的基因载体，即寻找高效、低毒、靶向性强的载体，以协助　目的基因进入靶组织…。使用基因治疗载体时必须考虑以下重要　因素：外源基因的容量、载体的纯度和滴度、转导效率、感染静止　期或者分裂期细胞的能力、基因转移效率及表达时效性、载体靶　向特异性、载体安全性及免疫原性等口。　反转录病毒载体是目前应用最广泛的基因运载工具之一，　在基因治疗中已显示出其独特的优点及广阔的应用前景，但反　转录病毒载体的生物安全性还存在争议　。我们针对反转录病毒　基因治疗性载体及其中外源目的基因的表达调控，以及反转录　病毒载体的安全性评价展开综述。　ｌ　反转录病毒介导的基因转移系统　反转录病毒（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，ＲＶ）最主要的特点是在其生活周期　中能将单链的基因组ＲＮＡ逆转录成双链ＤＮＡ，此ＤＮＡ进入细　胞核并整合在细胞染色体中，随宿主细胞的增殖而转录翻译，继　而包装病毒基因组ＲＮＡ形成病毒颗粒同。　常用的反转录病毒载体包括来源于哺乳动物Ｃ型反转录病　毒属（ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔｙｐｅ　Ｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）的小鼠白血病病毒　（ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ，ＭＬＶ）和慢病毒属（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｄａｅ）的人免　疫缺陷病毒（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｅｉｅｎｅｙ　ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）。与其他病毒　载体显著不同的是，反转录病毒载体可以高效整合到宿主细胞　基因组中，并且目的基因一般可以稳定表达２年以上［５１，从而对　遗传性疾病起到长期预防和治疗作用，而其他病毒载体表达时　间较短且稳定性较差。　１．１　哺乳动物Ｃ型反转录病毒栽体　哺乳动物Ｃ型反转录病毒的病毒粒子表面有少量纤突，核　心位于病毒粒子的中央，除ｇａｇ－ｐｒｏ－ｐｏｌ和ｅ聊基因外没有发现　其他基因。ＲＶ的基因组结构包括顺式（ｃｉｓ）作用元件和反式　（ｔｒａｎｓ）作用因子。顺式作用元件由两侧的长末端重复序列（１ｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ，ＬＴＲ）、引物结合位点（ｐｒｉｍｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ，ＰＢＳ）、　包装信号（　）及聚嘌呤片段（ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ　ｔｒａｃｔ，ｐｐｔ）组成；反式作用　因子由３个结构蛋白（Ｇａｇ、Ｐｏｌ和Ｅｎｖ）构成。　针对以上特点，很容易对哺乳动物Ｃ型反转录病毒的前病　毒序列进行分子加工和修饰构建ＲＶ载体。重组载体保留病毒的　顺式作用元件，并插入治疗性基因、外源性启动子及抗性基因，　

［收稿日期］２００７－０４－０３　ｆ基金项目］北京市自然科学基金项目（５０５３０２８）；　国家自然科学基金项目（３０６７１５５３）　［作者简介］徐述（１９８２－），男，硕士研究生　［通讯作者］章金刚，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｚｈａｎｇｉｇ＠ｎｉｃ．ｂｍｉ．８ｃ．ｃｎ　

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构建成重组病毒载体，包装病毒所需的结构蛋白则由辅助病毒　提供（或将结构基因的表达质粒导人包装细胞中），从而组成ＲＶ　包装系统［７１。　ＲＶ载体的主要优点是：可稳定整合人宿主细胞、能持久表　达目的基因、感染细胞范围广、基因容量较大（＜８　ｋｂ）、机体对载　体产生的免疫反应较弱等。自１９９０年美国成功地利用ＲＶ载体　进行了腺苷脱氨酶（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ，ＡＤＡ）缺陷病　的基因治　疗后，相继开展了许多利用ＲＶ载体对遗传性和后天获得性疾病　进行基因治疗的工作１９１。　１．２慢病毒栽体　慢病毒（１ｅｎｔｉｖｉｒｕｓ，ＬＶ）形态与哺乳动物Ｃ型反转录病毒相　似，但病毒核心呈棒状或锥状。慢病毒的基因组结构复杂，除了　具有反转录病毒共同的结构基因（ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｒｇｖ）外，还有许多调　节基因和辅助基因（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｇｅｎｅ），它们参与病毒基因的表达　调控、病毒颗粒的装配，以及改变感染细胞的结构和功能【１０１。ＬＶ　载体既可感染分裂期细胞，又可感染非分裂期细胞【１１】，尤其能用　于感染神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞及心肌细胞等，并且能稳　定整合人宿主染色体，因此能持久稳定表达外源基因。与ＲＶ载　体相比，ＬＶ载体的靶细胞范围更广，携带外源基因的能力更强。　ＬＶ载体中研究较多的是ＨＩＶ载体。早期以ＨＩＶ一１为基础　的载体是为研究ＨＩＶ一１的感染性而构建的，缺失ＨＩＶ一１的结构　基因（ｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｒｇｖ）用于插入外源基因，而病毒的结构蛋白由辅　助病毒提供，并可将病毒的Ｅｎｖ蛋白替换成水泡性口炎病毒糖　蛋白（ＶＳＶ—Ｇ）或ＭＬＶ的Ｅｎｖ蛋白　，从而增加宿主细胞的嗜性　范围。另外还可去除病毒的调控基因ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ和ｎｅｆ等，以进　步提高载体的安全性㈣。　经过改进的ｔ　缺陷型载体不影响病毒颗粒的感染性和转　导效率，病毒滴度可达５ｘ１０　ｃｆｕ／ｍＬ，可在小鼠体内有效转导神　经元细胞。而第三代ＬＶ载体只含有ＨＩＶ一１的９个结构基因中　的３个，即ｇａｇ，ｐｏｌ和ｒｅｖ。由于ＨＩＶ一１基因组成分中６０％被去　除，因此生成野生型病毒（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，ＲＣＲ）　的机率就很低［１４１。目前研究较多的第四代ＬＶ载体是建立在　ＨｌＶ一２基础上的自身失活载体（ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ，ＳＩＮ），一　旦到达靶细胞即丧失病毒ＬＴＲ的转录能力【１５１。　ＬＶ载体凭借其高效稳定整合到宿主基因组且持久表达外　源基因的优点，在基因转移和基因治疗方面展示了广阔的应用　前景。Ｃｈｅｎ等　将重组有人因子Ⅸ的ＬＶ载体转染小鼠造血干细　胞（ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ＨＳＣ），并将转染后的小鼠ＨＳＣ移　植入小鼠体内，使得人因子Ⅸ在小鼠血浆中得到持续高效表达，　从而有望用于人类Ｂ型血友病的基因治疗。最近有报道表明，ＬＶ　载体也可用于心血管疾病的治疗【１７１。　２反转录病毒载体中外源治疗性基因的表达调控　反转录病毒载体在基因治疗中起着重要的作用，针对不同　疾病及其致病机理选择合适的治疗性基因进行基因转移和基因　表达显得至关重要，但治疗性基因能否到达靶组织及其表达水　平的差异也是不容忽视的一个问题。　外源治疗性基因的靶向性表达决定了基因治疗的应用价　值。一般通过组织特异性启动子来实现目的基因在病变组织中　的表达，即组织特异性表达。研究疾病状态下基因表达调控的机　制，开发及应用能识别病理信号的启动子元件表达载体系统具　有重要的临床应用价值。心肌缺血性疾病能导致心肌纤维化甚　至心肌缺血性坏死，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ等【１８１研制了一种组织特异性缺氧响　应启动子，即在启动子中插入缺氧响应元件，心肌组织供氧正常　时启动子关闭下游基因表达，心肌组织一旦缺氧，启动子下游的　报告基因能在心肌组织中特异性表达，并且表达量较通常提高　了４００倍。　外源治疗性基因表达水平的差异则决定了基因治疗的优劣　与否。通过应答性启动子元件，在诱导因子作用下启动诱导下游　基因的表达，从而实现对治疗性基因体内表达的启动、表达时机　及表达水平的控制。起初认为启动子是随周围和生理环境的变　化而变化的，因此针对这些因素（包括热激、金属离子、干扰素、　双链ＲＮＡ及类固醇等）开发了一系列的基因表达调控系统，随　后又开发了／ａｃ操纵子系统等。　目前应用最广泛的基因表达调控系统为四环素（ｔｅｔｒａｃｙ—　ｃｌｉｎｅ，Ｔｅｔ）调控系统及其衍生系统。Ｔｅｔ调控系统由两部分组成，　即Ｔｅｔ反应性元件和一个融合的转录活化因子。转录活化因子经　过修饰能被强力霉素诱导和激活，从而生成新的激活因子ｔＴＡ　（ｔｅｔ—ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ）和ｒｔＴＡ（ｒｏｖｅｒｓｅ　ｔｅｔ—ｃｏｎ—　ｔｒｏｌｌｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ），二者有４个氨基酸的差别，这４　个氨基酸的突变使得ｔＴＡ与ｒｔＴＡ的表型相反，由此衍生出了２　种新的调控系统，即Ｔｅｔ—Ｏｎ和Ｔｅｔ—Ｏｆｆ系统【１９１。这２种系统在外　源诱导因子的作用下可人为控制目的基因的表达或关闭。系统　中ｔＴＡ和ｒｔＴＡ既拥有四环素阻遏物一操纵子相互作用的特异性，　又具有ＶＰ１６转录活化因子的激活潜能，它们在体外培养细胞和　转基因小鼠中能使目的基因的表达提高１０５倍　。自Ｔｅｔ系统被　发现后，历经改造，其可控性、表达效率和降低表达背景等都得　到了极大的改进，通过对其进行进一步的研究和应用，将加速临　床基因治疗的发展。