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木质纤维素处理转化为乙醇的研究进展潘春雷081143020 生科制药班摘要：木质纤维素是廉价易得，来源广泛的生物质，将其转化为生物无污染的，可再生的乙醇燃料具有很好发展前景。
本文介绍了对木质纤维素的物理处理，物理化学处理，化学水解处理，生物处理的方法。
关键词：木质纤维素，乙醇，处理方法。
研究背景：目前世界温室效应及能源危机日益上升，人们在不断地寻找一种可再生的污染小的能源。
各国将焦点放在乙醇的生产上。
乙醇可以从粮食以及木质纤维素的发酵中得到，但由于全球仍然面临粮食危机，所以研究的焦点转到了对纤维素的处理上。
纤维素原料是地球上产出量很大的可再生资源,其来源包括树木的枝叶、农作物的秸秆等, 据估计木质纤维素原料占世界生物质量(100 亿～500 亿t)的50 %【1】在整个生态系统的能量循环中有重要地位。
在近几年的生态环境调查中表明农作物秸秆大多被焚烧，以获得钾肥，但此做法不仅污染了环境，而且浪费了资源，开发以木质纤维素为原料制备乙醇的工艺是未来工业燃料生产的发展方向。
1、木质纤维素生物质的主要成分木质纤维素物质的主要组成是纤维素、半纤维素和木质素，纤维素和半纤维素可通过处理得到糖类。
纤维素是由葡萄糖分子通过高度脱水缩合连接而成的高分子聚合物，纤维素的水解产物是葡萄糖单体。
半维素也是生物高聚物，是由各种不同糖基组成的，主要是六碳糖和五碳糖，在特定条件下可以水解成单糖。
木质素是由苯丙烷结构单体组成的天然高分子化合物，在细胞壁中起支撑和把纤维素和半纤维素结合起来的作用，但是木质素不能水解为单糖。
2、木质纤维素的预处理技术（1） 物理处理方法常见处理方法是机械破碎法、液相热水处理法等。
其优点在于处理方便，装置简单，且处理过程中产生的污染小，但物理法处理要很高的能量, 如电能和热能，所以会增加生产成本。
机械破碎法：通常木质纤维素经碾碎处理后的原料大小通常为10～30 mm, 而经粉碎、研磨之后的原料颗粒大小一般为0.2～2 mm。
大连化物所木质纤维素制乙醇研究工作取得新进展燃料乙醇是一种优质可再生的清洁能源，添加于汽油燃料里可替代部分石油基燃料并能降低污染物排放，已在国际上得到广泛使用。
目前燃料乙醇主要依靠粮食淀粉和植物糖类为原料经发酵制得。
利用来源广泛的农、林废弃物等各类木质纤维素为原料生产燃料乙醇有着极为广阔的前景，也是数十年来生物化工技术领域研究的一个焦点。
木质纤维素制乙醇至少需要经过预处理、酶解、发酵三步完成，其中预处理过程中产生的毒性物质（如乙酸、糠醛、苯酚等）严重抑制酵母生长和乙醇发酵，成为纤维素乙醇生产的主要技术瓶颈。
目前主要通过水洗、物理、化学和生物等方法对预处理木质纤维素及其酶解液进行深度脱毒才能实现较好的发酵效果，但是复杂的工艺、昂贵的设备投资、大量的水耗以及可发酵糖的损失等极大地降低了纤维素乙醇生产的经济效益，从而制约了纤维素乙醇的工业化进程。
中科院大连化物所生物质转化技术研究组（DNL0602）张宗超研究团队在木质纤维素制乙醇研究工作中，发现聚乙二醇（PEG）与酵母细胞有很好的生物兼容性，而且PEG对工业酿酒酵母细胞（淀粉基）具有显著的外保护“原位脱毒”功能。
这种化学分子的外保护使酵母细胞在与毒性物质共同存在时，仍具有将速生杨、玉米秸秆等木质纤维素水解液发酵生产乙醇的能力。
研究结果表明，工业酿酒酵母（淀粉基）在PEG保护的条件下可直接将木质纤维素水解液转化为乙醇，无需进行基因改造、适应性培养。
该方法可有效简化生产工艺、减少水耗和设备投资，推动纤维素乙醇的工业化进程。
相关研究结果在线发表于近期的Scientific Reports（doi:10.1038/srep20361）上。
2018年第37卷第8期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS·3119·化 工 进展纤维素乙醇生产重组酿酒酵母菌株的构建与优化研究进展唐瑞琪1，熊亮2，程诚2，赵心清1，白凤武1（1上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240；2大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116023）摘要：寻找化石能源的替代品以及开发和利用生物能源已引起国内外研究者的广泛关注。
提高酿酒酵母利用来源广泛、贮存丰富的农林废弃物等木质纤维素原料生产燃料乙醇的效率是生物能源的重要研究内容，但是，重组酿酒酵母木糖发酵性能低是限制纤维素乙醇经济性的关键问题。
本文总结了酿酒酵母中木糖代谢途径的构建和优化以及木糖转运对木糖利用的影响，分析了重组酵母利用纤维素水解液进行乙醇发酵的研究现状，并对进一步提高重组酿酒酵母纤维素乙醇生产效率的研究趋势进行了展望。
目前国内外已经构建了可有效利用木糖产乙醇的重组酵母，但对其木糖代谢机制的研究还尚未深入，限制了重组菌株的定向改造。
此外，目前缺少在纤维素生物质水解液发酵实际应用过程中对重组菌株的评价。
因此，加强重组酵母菌株对木糖利用相关代谢调控机理的分析，注重多种抑制物对菌株发酵性能的影响，结合真实底物纤维素乙醇发酵过程进行重组菌株的构建和优化，从而进一步提高纤维素乙醇生产的经济性，是未来菌株构建的重要研究方向。
关键词：生物燃料；木质纤维素类生物质；乙醇发酵；酿酒酵母；代谢工程中图分类号：Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2018）08–3119–10 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2017-1977Progress of research on construction and optimization of recombinantSaccharomyces cerevisiae strains for cellulosic ethanol productionTANG Ruiqi 1, XIONG Liang 2, CHENG Cheng 2, ZHAO Xinqing 1, BAI Fengwu 1（1School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2School of LifeScience and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116023, Liaoning, China ）Abstract: The increasing challenges on gradual depletion of fossil fuel and global warming are driving the development of alternative fuels and utilization of bioenergy. Production of fuel ethanol from lignocellulosic feedstocks including a variety of agricultural and forestry residues has received increasing interests in recent years. Saccharomyces cerevisiae is the most commonly used microbial organism for ethanol production. However, it cannot efficiently assimilate xylose, which is the most abundant pentose in lignocellulosic hydrolysates. Therefore, construction and optimization of xylose utilizing S. cerevisiae is of great importance for improving economic cellulosic ethanol production. The construction and optimization of recombinant S. cerevisiae strains by integrating xylose utilization pathway, and the effect of xylose transport on xylose assimilation were summarized. Furthermore, the current status of cellulosic ethanol production using the recombinant S. cerevisiae strains was discussed, and further prospects on improvement of production efficiency of cellulosic ethanol was provided. Currently, the yield of ethanol from xylose by the recombinant strains has been improved significantly.程改造工作。
利用木质纤维素联合生物加工生产生物乙醇的展望和新方向李金伟张姗姗（青岛科技大学化工学院，山东青岛266042）摘要：美国能源部能源独立和安全法案要求，到2022年全国的生物燃料产量达到360亿加仑，其中210亿加仑必须来自可再生可持续的原料（例如木质纤维素）。
为达到这个目标，必须研制出能将植物生物质转变成可发酵糖且经济合算的工艺技术。
生产生物乙醇的一种重要途径是利用微生物，通过联合生物加工（CBP）将生物质转化成可发酵糖并将生成的糖发酵成乙醇。
CBP技术一体化程度高，能有效降低生产成本。
关键词：生物乙醇；联合生物加工；木质纤维素中图分类号: TQ223. 122 文献标识码: ＡPerspectives and new directions for the production of bioethanol using consolidated bioprocessing of lignocelluloseLI Jin-wei ,ZHANG Shan-shan(College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao, 266042 China) Abstract:The U.S. DOE Energy Independence and Security Act (EISA) mandated attainment of a national production level of 36 billion gallons of biofuels by 2022, of which 21 billion gallons must be derived from renewable/sustainable feedstocks (e.g. lignocellulose). In order to attain these goals, the development of cost effective process technologies that can convert plant biomass to fermentable sugars must occur. An alternative route to production of bioethanol is the utilization of microorganisms that can both convert biomass to fermentable sugars and ferment the resultant sugars to ethanol in a process known as consolidated bioprocessing (CBP). CBP features cellulase production, cellulose hydrolysis and fermentation in one step.Key words:bioethanol；consolidated bioprocessing；lignocellulose1、引言目前生物燃料的的生产以生物质糖的发酵为主。
木质纤维素生产燃料乙醇的关键技术研究现状作为仅次于煤炭、石油和天然气的第四大能源，生物质能源地位越来越重要。
而木质纤维素的预处理技术则能够对燃料乙醇的生产具有直接的影响。
本文主要从木质纤维素乙醇生产的关键技术入手，重点预处理技术、水解及发酵等关键环节进行了分析和阐述，并对木质纤维素生产燃料乙醇的市场前景进行了展望。
标签：木质纤维素；燃料；乙醇；预处理技术引言木质纤维素取材广泛且造价低廉，主要由纤维素、半纤维素构成，是重要的燃料乙醇的生产原料。
就目前而言，虽然利用木质纤维素进行燃料乙醇的生产技术已经初具可行性，但因其生产工艺十分复杂，且耗能较高等问题，对木质纤维素生产燃料乙醇形成严重的阻碍。
本文针对其生产过程的几项关键技术进行了分析、研究。
1、木质纤维素乙醇生产的关键技术1.1 预处理1.1.1 物理方法（1）机械粉碎。
所谓的机械粉碎指的是使用球磨、碾磨等设备对纤维素加以粉碎的过程。
粉碎后的物料粉末是不具备膨润性的，且体积较小，基质浓度较高，对于酶解过程中的木质素酶以及纤维素酶的挥发有着重要作用，然而处理效果不尽人意，且具有较高的耗能。
（2）热液处理。
将物料投入高压热水中，可以使得物料中的半缩醛键断裂并形成酸，而在酸的作用下，半纤维素就会水解成为单糖。
经过预处理的纤维素酶解效率较高，且其水解物可以直接用于燃料乙醇的生产。
（3）微波处理。
微波处理操作简便、用时短且具有明显的糖化效果，然而成本较高，使得工业化应用过程中受到限制。
微波处理不仅能够对植物纤维素中的超分子结构加以改变，导致纤维素结晶区的尺寸出现变化，还能对木质素和半纤维素进行讲解，有效提升植物纤维素的糖化效率。
（4）超声波。
超声波形成的空化作用对传质具有一定的强化作用，同时对材料结构也具有一定影响。
众所周知，木质纤维素是由纤维素、半纤维素以及木质素三部分构成，因此想要取得良好的处理效果，就必须进一步降低发酵过程中的传质阻力，同时将其包裹结构打破。
木质纤维素糖化发酵工艺研究进展前言目前，世界乙醇生产主要以淀粉类(粮食作物为主，如玉米、木薯等)和糖类（如甘蔗、甜菜等）[1-2]作为发酵原料．采用微生物法发酵生产乙醇技术成熟，但是高昂的原料成本使粮食发酵生产乙醇的工业应用受到限制，同时存在与人争粮或与粮争地等弊端，并且导致粮食价格持续走高，因此寻找新的原料势在必行．所以现在科学家把目光投向成本更为低廉、来源更广泛的木质纤维素原料[3]．它不仅包括秸秆等农业废弃物，城市固体废弃物、办公废纸、杂草、锯末等以及市政废水中的固体部分[4].地球上每年植物光合作用的生物量可达2 000亿 t，其中大部分为木质纤维素类．它的主要成分是纤维素、木质素、半纤维素．在植物组织中木质素与半纤维素以共价键形式结合，并将纤维素分子包埋其中，形成一种坚固的天然屏障，使一般微生物很难进入使其降解。
木质纤维素原料生产燃料乙醇的过程主要包括预处理、糖化、发酵等，其预处理是生物转化的关键步骤，影响整个纤维素酒精生产过程．因此高效、便捷的预处理技术是木质纤维素原料生产燃料乙醇的关键所在．一、分步糖化和发酵（SHF）前处理后的木质纤维素经水解糖化生成葡萄糖，然后在另一反应器中进行发酵转化为乙醇，这种糖化发酵工艺被称为分步糖化和发酵。
其主要优点是糖化和发酵都能在各自最优条件下进行——纤维素酶水解糖化所需的最适温度在 45～5℃，而大多数发酵产乙醇的微生物最适温度在 28～37 ℃[5]。
缺点是糖化产物葡萄糖和纤维二糖的积累会抑制纤维素酶的活力，最终导致产率的降低。
研究发现，纤维二糖的浓度达到 6 g/L 时，纤维素酶的活力就将降低 60%，葡萄糖对纤维素酶的抑制作用则没有那么明显，但是，它会对β-葡糖苷酶（一种关键的纤维素水解酶）产生强烈的抑制，葡萄糖浓度达到3 g/L时，β-葡糖苷酶的活力就将降低75%。
此外，水解用的纤维素酶（主要来自于真菌）不仅组分相对单一而且价格昂贵，当其活力受到抑制时，就得增加用量，最终导致使用成本的提高。
关于利用微生物用于木质纤维素生物质转化为燃料乙醇的研究进展综述摘要：木质纤维素生物质是一种廉价、易得的可持续发展的潜在新能源材料，随着能源危机的加剧，由木质纤维素生物质转化为燃料乙醇成为开发新能源的一个新突破口。
国内外近年来在这个领域都有很多研究成果。
本文就微生物在木质纤维素生物质转化为燃料乙醇的预处理、水解中的应用作出综述，分析了现在木质纤维素生物质转化为燃料乙醇要想实现产业化所遇到的问题，并提出几条对策。
关键词：木质纤维素、燃料乙醇、发酵、纤维素酶、研究进展随着现代工业与经济的发展，能源需求日益增加。
特别是石油能源，由于人类社会的不断开采，石油资源目前面临着枯竭的危险。
据2010年11月8号《环境科学与技术杂志》发表的研发报告显示，以当前的使用速度，化石燃料原料将在2050年前枯竭，而石油开采量下降10%～15%足以令发达工业国家的经济完全瘫痪1。
这就意味着，要想保证人类社会的继续发展，寻求清洁、可持续的新能源已经成为了人类一项必须要完成的任务。
因此，越来越多的国家已将生物质能源产业作为国家的一项重大战略推进，纷纷投入巨资进行生物质能源的研发。
20世纪70年代石油危机以来，一些国家开始尝试利用生物质资源生产液体燃料2。
继美国和巴西用玉米和甘蔗生产燃料乙醇成功后，欧盟、日本、加拿大、印度等国家和地区也先后加大用粮食制备燃料乙醇的投入，2006年，仅美国由玉米淀粉生产乙醇的产量就达到了50亿加仑3。
然而，随着随着世界耕地面积的缩小和人口数量的急剧增多，世界粮食价格也在近年出现大幅攀升。
如何寻求价格低廉且来源广泛的替代原料来生产燃料乙醇，成为了发展生物质能转化为乙醇新能源亟待解决的问题。
木质纤维素生物质如农林牧业加工废弃物，是可再生、价廉易得和来源丰富的资源和能源。
全球每年光合作用的产物高达1500-2000亿吨，其中80%以上为木质纤维素生物质(如秸秆、草类、树木等)4。
利用木质纤维素生物质生产乙醇不仅有利于环境保护和资源再利用，而且可减少温室气体的排放和缓解化石能源的危机，因此成为了一条解决新能源问题的新途径，其研究得到了世界各国的大力支持，并且也取得了很多阶段性的进展。
木质纤维素为原料的燃料乙醇发酵技术研究进展一、本文概述随着全球能源危机和环境污染问题的日益严重，可再生能源的开发与利用已成为研究的热点。
木质纤维素作为一种广泛存在的可再生生物质资源，具有储量丰富、价格低廉、可再生等优点，因此在生物燃料领域，特别是在燃料乙醇的生产中，其潜在的应用价值日益受到关注。
本文旨在对以木质纤维素为原料的燃料乙醇发酵技术的研究进展进行全面的综述和分析。
本文首先介绍了木质纤维素的组成、性质及其作为燃料乙醇原料的优势，阐述了木质纤维素在燃料乙醇生产中的重要地位。
随后，重点回顾了近年来在木质纤维素预处理、酶解糖化、酵母菌发酵以及后续分离提纯等关键技术环节的研究进展，分析了各种技术的优缺点以及适用条件。
本文还讨论了当前研究中存在的问题和挑战，如木质纤维素的复杂结构导致的预处理难题、酶解效率低、酵母菌对木质素和半纤维素的耐受性差等问题，并提出了相应的解决策略和发展方向。
本文展望了木质纤维素为原料的燃料乙醇发酵技术的未来发展前景，认为通过持续的技术创新和优化，以及产业链上下游的协同合作，有望实现木质纤维素基燃料乙醇的高效、绿色、可持续生产，为可再生能源的发展做出重要贡献。
二、木质纤维素的结构与性质木质纤维素，作为自然界中最丰富的可再生有机资源，是植物细胞壁的主要成分，由纤维素、半纤维素和木质素三种主要组分构成。
这种复杂的天然高分子化合物具有独特的三维网络结构，赋予了其优良的生物降解性和生物相容性。
纤维素是由β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖分子线性链构成，具有较高的结晶度和较强的分子间氢键，因此具有较好的化学稳定性和生物惰性。
半纤维素则是由不同种类的单糖构成的支链聚合物，结构多样且无定形，相较于纤维素，其更易于被微生物降解。
木质素则是一种复杂的酚类聚合物，主要存在于细胞壁中，起着增强植物细胞壁硬度的作用，其结构中含有大量的酚羟基和甲氧基，赋予其良好的化学稳定性和生物抗性。
在燃料乙醇的发酵过程中，木质纤维素的这三种组分各有其重要作用。
应用与环境生物学报 2009，15 ( 4 ): 579~584Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2009-08-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00579以木质纤维素为原料的第二代生物质燃料开发既是全球研发的热点也是难点. 欧盟国家和美国的中长期生物质能源发展路线图中均将木质纤维素生产燃料乙醇作为2010年后生物质燃料产业化的主要目标，但是目前整体水平尚处于中试阶段. 我国的纤维素类生物质原料非常丰富，将其转化成燃料乙醇有着很大的潜力，但当前要想实现工业化生产，还面临着很多瓶颈问题亟待解决，主要体现在：1) 对于原料的生物质能转化特性和转化机制尚缺乏充分的基础研究；2) 还没有形成高效的组分分离技术(预处理技术)；3) 生物炼制技术尚处于起步阶段，还需要大量基础性实验和理论研究. 4) 缺乏能够同时高效利用纤维素类水解物(主要为葡萄糖和木糖混合物)的发酵菌株，这是制约纤维素乙醇生产的关键因素[1]. 李科等对木质纤维素生物质制取乙醇的预处理、酶解和发酵等三大关键制约因素进行了较为全面的综述，为木质纤维素生产乙醇提供了新的研究思路[2]，在此不再赘述. 孙宪昀等就国内外对青霉菌木质纤维素降解酶系研究的最新动态，包括菌株的选育、纤维素酶系的特性与合成调控，以及基因分析与克隆等方面对木质纤维素的生物降解进行了综述[3]. 本文主要针对高效利用纤维素水解物的重组发酵菌株这一关键因素进行探讨.目前对于利用木质纤维素生产乙醇的菌种研究主要集中于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis )和大肠杆菌(Escherichia coli )等. 在乙醇工业中通常使用酿酒酵母来发酵生产乙醇，但酿酒酵母不能发酵大量存在于纤维素水解物中的五碳糖；革兰氏阴性细菌运动发酵单胞菌由于其本身所具有的优点也被作为一种候选的燃料乙醇生产菌株，但也不能直接发酵五碳糖. 所以研究者一直致力于通过基因工程的手段来解决发酵菌株对利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇重组菌株研究进展*何明雄1, 2 祝其丽1, 2 潘 科1, 2 胡启春1, 2**(1农业部沼气科学研究所生物质能技术研究中心 成都 610041)(2农业部能源微生物与利用重点开放实验室 成都 610041)Progress in Ethanol Production with Lignocellulosic Biomassby Different Recombinant Strains*HE Mingxiong 1, 2, ZHU Qili 1, 2, PAN Ke 1, 2 & HU Qichun 1, 2**(1Research Centre of Biomass Energy Technology, Biogas Institute of Ministry of Agriculture, Chengdu 610041, China)(2Key Laboratory of Energy Microbiology and Application, Ministry of Agriculture , Chengdu 610041, China)Abstract Ethanol fermentation with lignocellulosic biomass involves significantly great challenges, owing to lack of industrially suitable microorganisms for converting cellulose hydrolysates into fuel ethanol, which has traditionally been considered as a major technical roadblock to the development of bioethanol industry. Currently, different recombinant strains have been engineered to produce ethanol from lignocellulosic biomass. The greatest successes have been made in the engineering of Saccharomyces cerevisiae and some other bacteria, including Escherichia coli , Klebsiella oxytoca , and Zymomonas mobilis , which provide a basis for constructing industrially suitable engineered strains for cellulose ethanol industrialization. This review summarizes recent progress in this filed, and also prospect it in the Omic era. Fig 2, Tab 2, Ref 51Keywords lignocellulose; biomass; bioethanol; Saccharomyces cerevisiae ; Zymomonas mobilis ; Escherichia coli ; KlebsiellaoxytocaCLC Q936 : TK6摘 要 要实现木质纤维素类生物质的有效利用，当前还面临很多瓶颈问题亟待解决，而缺乏能够同时高效利用纤维素类水解物的发酵菌株是制约纤维素乙醇生产的最关键因素. 目前对发酵菌种的研究主要集中在酿酒酵母、运动发酵单胞菌、大肠杆菌和克雷白氏杆菌这4种菌上，已取得大量研究进展，为纤维素乙醇的产业化奠定了一定的基础. 本文综述了这4种菌发酵纤维素水解物的基因工程改造研究进展，并对组学时代进一步优化发酵菌株进行了展望. 图2 表2 参51关键词 木质纤维素；生物质；燃料乙醇；酿酒酵母；运动发酵单胞菌；大肠杆菌；克雷白氏杆菌CLC Q936 : TK6收稿日期: 2008-12-12 接受日期: 2009-03-02*中国农业科学院科技经费项目(2009)资助 Supported by the Sci & Tech Project of the Chinese Academy of Agricultural Sciences (2009) **通讯作者 Corresponding author (E-mail: Qichun204@)58015 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 五碳糖(特别是木糖)的发酵问题，大肠杆菌和克雷白氏杆菌(Klebsiella oxytoca )由于具有较宽的底物利用范围引起了研究者的关注. 本文主要对这几种目前用于木质纤维素生物质发酵产生乙醇的菌种进行较为全面的综述.1 重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )传统的乙醇发酵生产菌株酿酒酵母由于缺少木糖利用的最初代谢途径，不能直接利用木糖，而只能利用其异构体——木酮糖. 自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径有2条(图1). 在真菌中，木糖通过木糖还原酶(Xylose reductase ，XR 或XYL1)和木糖醇脱氢酶(Xylitol dehydrogenase ，XDH 或XYL2)的共同作用来完成木糖到木酮糖的代谢转化过程；而在细菌中，则是通过木糖异构酶(Xylose isomerase ，XI)一步转化为木酮糖[4]. 目前主要通过以下2种思路构建直接利用木糖的重组酵母菌：1) 将来自木糖利用酵母(目前主要是Pichia stipitis )的XR 和XDH 基因在酿酒酵母中表达；2) 将来源于细菌的木糖异构酶(XI)在酿酒酵母中表达.1.1 XR-XDH 代谢途径的运用将毕赤酵母的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2克隆到酿酒酵母中，转化子能在以木糖为唯一碳源的培养基上缓慢生长，但所利用的木糖全部被氧化形成木糖醇，乙醇产率相当低[5]. 将木酮糖激酶基因XKS1 (XYL3)克隆到已含有XYL1和XYL2基因的酿酒酵母转化子中，可使木糖醇的产率降低，乙醇产率明显提高[6, 7]. 副产物木糖醇的形成原因可能是木糖代谢途径下游不畅及氧化还原不平衡，目前也通过改变下游代谢途径的氧化还原平衡来增加乙醇的产率[8, 9]. 另一方面也可通过敲出某些关键基因(如GRE 3等) [10]来实现这一目标. 国内袁振宏和杨秀山等也通过代谢途径过程构建了重组木糖利用酵母，并就木糖运输途径的改造、木糖代谢途径的引入、增强其对发酵抑制剂的耐受性等方面进行了全面综述，提出了酿酒酵母的木糖代谢工程还有待于进一步深入研究[11].此外，Walfridssion 等在木糖酵母中超表达磷酸戊糖途径的转酮酶(Transketolase ，TKL)和转醛酶(Transadolase ，TAL)可以增加木糖转化为乙醇的量[12]. 目前较为成熟的菌种有S. cerevisiae TMB3400、S. cerevisiae RWB218和S. cerevisiae RE700A (pKDR)等(表2).1.2 细菌XI 代谢途径的运用多种细菌来源的XI 被引入酿酒酵母中[13]，沈煜等也将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus 的木糖异构酶基因xylA 引入酿酒酵母[14]，但来源于Piromyces sp.的XI 所得到的活性最高[15]，只有通过适应性进化[16]或其他的遗传改造[17]方能使其代谢木糖的能力得到提高. 从整体上看，采用细菌木糖代谢途径还存在着重组酶表达活性较低和细菌木糖异构酶的最适反应温度与发酵温度不同等问题，也有研究者通过突变的方式来解决这一问题. 并且该途径与XR-XDH 的发酵比较研究表明，采用XR-XDH 代谢途径所构建的重组菌株S. cerevisiae TMB3400较细菌XI 代谢途径发酵效率高，且在发酵纤维素水解物时没有副产物木糖醇的生成[13].1.3 细胞表面展示技术的应用近年来发展起来的酵母表面展示技术也被用于构建酵母基因工程菌上，如Yasuya Fujita 等应用酵母展示系统展示图1 真菌(A)和细菌(B)中的木糖代谢途径Fig. 1 Metabolic pathway of xylose in fungus (A) and bacterium (B)表1 纤维素水解酶基因和五碳代谢途径相关基因在运动发酵单胞菌中的表达Table 1 Expression of cellulase gene and pentose metabolic pathway of Z. mobilis底物Substrate 基因Gene基因来源Source of gene参考文献Reference纤维素Cellulose内切葡聚糖酶 Endoglucanase 内切葡聚糖酶 Endoglucanase 内切葡聚糖酶 Endoglucanase β-(葡萄)糖苷酶 β-glucosidase羧甲基纤维素酶 Carboxymethyl cellulase 菊欧文菌 Erwinia chrysanthemi 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis萤光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 白纹黄单胞菌 Xanthomonas albilineans 醋酸杆菌 Acetobacter xylinum [21]木糖Xylose木糖异构酶 Xylose isomerase 木酮糖激酶 Xylulokinase 透明质酸酶 Alidase野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris[27]木糖异构酶 Xylose isomerase 木酮糖激酶 Xylulokinase转二羟丙酮基酶 Transaldolase 酮糖移转酶 Transketolase大肠杆菌 Escherichia coli [28]阿拉伯糖(Arabinose)L -阿拉伯糖异构酶 L -arabinose isomerase 核酮糖激酶 Ribulokinase转二羟丙酮基酶 Transaldolase 5-磷酸核酮糖异构酶5-phosphoribuose isomerase 酮糖移转酶 Transketolase大肠杆菌 E. coli [25]581 4 期何明雄等：利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇重组菌株研究进展两种纤维素酶，构建了一株不经过前处理而直接发酵β-葡聚糖生产乙醇的重组酵母菌基因工程菌，通过此系统构建的重组酵母工程菌，糖化作用和发酵同时发生，在以β-葡聚糖为唯一碳源的培养基中，能在50 h直接发酵45 g β-葡聚糖生产乙醇16.5 g/L[18]. Hisayori Shigechi等应用酵母展示系统展示葡萄糖糖化酶和α-淀粉酶，成功构建了一株能直接利用玉米淀粉发酵生产乙醇的酵母基因工程菌，在72 h内，该菌株能生产乙醇61.8 g/L，达到其理论产量的86.5%[19]. 侯进等也利用利用α-型酿酒酵母表面展示系统的载体将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus的木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母H158中表达，得到了一株木糖利用率提高17.18%的重组菌株H158-SXI [20].2 重组运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)运动发酵单胞菌最早发现于非洲等热带地区的果酒中. 19世纪50年代早期，人们发现运动发酵单胞菌在厌氧条件下主要通过ED途径代谢葡萄糖，它可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖等六碳糖产乙醇，但不能利用五碳糖生产乙醇. 迄今为止，运动发酵单胞菌是唯一一种通过ED途径厌氧发酵葡萄糖的微生物，其独特的代谢途径使其成为构建产乙醇工程菌的优选宿主之一. 多年来，研究者已就其生理生化特性、菌种改造、遗传操作和发酵工艺学等方面作了大量的研究. 同酿酒酵母相比，运动发酵单胞菌具有如下一些优点：较高的糖吸收率，较高的乙醇产率；生物量少；较高的乙醇耐受力等. 但该菌底物利用范围过窄，一般野生型Z. mobilis菌株只能以葡萄糖、果糖和蔗糖作为生产乙醇的底物，不能将复杂的碳水化合物代谢为乙醇. 为拓宽其底物利用范围，研究者将其他微生物中相关的水解酶基因如阿拉伯糖或者纤维素代谢的相关基因转移到Z. mobilis中，使其具有利用其他底物的能力[21] (表1). 尽管如此，该菌目前仍然没有在商业化生产中得到应用，但随着2005年其全基因组序列的公布[22]和2006年杜邦公司宣布对该菌进行玉米秸秆燃料乙醇的研究[23]，其产业化应用前景仍值得我们关注.为拓展运动发酵单胞菌的底物利用范围，研究者前期也进行了大量的工作，如将来自菊欧文菌(Er winia chrysanthemi)的内切葡聚糖酶基因、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的内切葡聚糖酶基因、醋酸杆菌(Acetobacter xylinum)的羧甲基纤维素酶基因和野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的木糖代谢相关基因[21]. 这些工作为构建能直接发酵木糖的重组运动发酵单胞菌奠定了基础. 美国可再生能源实验室Zhang等基于前人的研究结果，通过同时表达来自大肠杆菌的木糖异构酶(XI)、木酮糖激酶(XK)、TKT和TAL(图2)，得到重组菌株Z. mobilis CP4 (pZB5)，该重组菌株能直接发酵木糖产生乙醇，其乙醇产率为其理论值的86% [24]；Deanda等又通过表达来自大肠杆菌阿拉伯糖代谢途径的5个基因，L-阿拉伯糖异构酶(ara A)、核酮糖激酶(ara B)、5-磷酸核酮糖异构酶(ara D)、转二羟丙酮基酶(tal B)和酮糖转移酶(tkt A)基因，得到了能直接发酵阿拉伯糖的重组菌株Z. mobilis ATCC39678 (pZB206)，该重组菌株能直接发酵阿拉伯糖(25 g/L)生产乙醇，达其理论产率的98% [25]；Rogers等将质粒pZB5转入ATCC31281(ZM4)中，得到重组菌株ZM4(pZB5)，在发酵葡萄糖和木糖混合糖产乙醇时显示出了比CP4 (pZB5)更高的乙醇耐受性[26]. 但这些菌种有一个共同的缺点，就是其木糖代谢基因在质粒载体中，因此不得不在培养基中加入一定量的抗生素，以防止质粒的丢失，这将导致生产成本图2 运动发酵单胞菌戊糖代谢途径的构建Fig. 2 Construction of metabolic pathway of pentose in Z. mobilis58215 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol的增加. 所以该研究小组又通过构建整合型表达载体，将木糖代谢和阿拉伯糖代谢相关基因整合于运动发酵单胞菌基因组上，得到木糖发酵菌株和阿拉伯糖发酵菌株Z. mobilis ATCC39676 (AX101)，该工程菌能共发酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，优先利用葡萄糖，其次为木糖，最后利用阿拉伯糖[29]. 为提高该菌对木糖的利用效率，Jeon等还通过增加木酮糖激酶基因(XK)的表达水平，但未能得到预期结果.3 重组大肠杆菌(Escherichia coli)大肠杆菌等具有较广的底物利用范围，可以代谢六碳糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖)、五碳糖(木糖和阿拉伯糖)以及糖醛酸(半乳糖醛酸、葡糖醛酸)生成代谢中间产物——丙酮酸. 大肠杆菌的糖代谢途径和生理机制比较复杂，六碳糖主要经糖酵解途径代谢，五碳糖主要是通过磷酸戊糖途径并与ED途径相偶联进行代谢. 一般情况下，发酵条件为pH=7.0，发酵温度为30 ℃或35 ℃. 大肠杆菌糖代谢的复杂性决定了它的代谢产物的复杂性，其代谢产物包括一些醛类、醇类和有机酸，乙醇并不是其主要的代谢产物，只是其中很小的一部分，因此传统上一般不用它来生产乙醇. 但是大肠杆菌含有代谢五碳糖的磷酸戊糖途径中的整套基因和酶，因此在木糖发酵和混合糖发酵产乙醇的研究中也有一定的研究价值. 大肠杆菌缺少高活力的乙醇产生酶系，而且在糖酵解过程产生的副产物较多. 在20世纪80年代，Ingram等利用运动发酵单胞菌中的高活力丙酮酸脱羧酶(pdc)和乙醇脱氢酶基因(adhB)构建了PET 操纵子——pLOI297，并将该操纵子导入大肠杆菌中表达，结果大肠杆菌工程菌株能发酵葡萄糖产生乙醇[30]；为寻找更适合的宿主菌，Ingram等通过对9种不同大肠杆菌工程菌株的乙醇耐受性、质粒稳定性和乙醇产率等方面的比较研究发现，E. coli ATCC11303 (pLOI297)为最理想的菌株[31]；Beall等对ATCC11303 (pLOI297)进行了发酵评估[32]；为提高工程菌的遗传稳定性，Ingram研究组又将这2个基因整合至大肠杆菌ATCC 11303染色体Pyruvate formate lyase (pfl)基因位点上，但该重组菌株乙醇产率较质粒型ATCC11303 (pLOI297)菌株低，通过高浓度氯霉素抗性筛选，得到乙醇产率较高的菌株；为了进一步提高该菌株的乙醇产量，通过将琥珀酸合成途径中的延胡索酸合成酶frd 基因打断，阻断琥珀酸的合成，提高了乙醇产量，该菌株被定名为E. coli KO11 [33]. 研究表明，在厌氧条件下，E. coli KO11可发酵半纤维素水解产物中几乎所有的糖生产乙醇，其乙醇生产能力较高，并且对木质纤维素水解产物中的抑制剂具有相对高的耐受性. 对KO11的基因芯片分析结果表明，在KO11中，大部分与木糖代谢相关的酶基因表达水平较出发菌株高，其中木糖异构酶基因(xylA)的表达水平是出发菌株的3倍多，木酮糖激酶(xylB)是出发菌株的2倍多[34]. Dien等还通过突变大肠杆菌pfl和ldh基因，然后将质粒pLOI297转化该宿主菌，得到FBR5菌株，并对其进行了发酵研究[35, 36]. Yomano等通过KO11的长期适应性进化研究，得到一株乙醇耐受性为10%的菌株LY01，该菌株使发酵140 g/L木糖的时间由120 h缩短为96 h [37]，并且对木质纤维素水解产物中的抑制剂具有比KO11相对高的耐受性[38~40].4 重组克雷白氏杆菌(Klebsiella oxytoca)K. oxytoca是一种肠道细菌，具有较宽的底物利用范围，如已糖、戊糖、纤维二糖和纤维三糖等，特别是对纤维二糖的利用特点可减少纤维素酶的使用. 但野生型的K. oxytoca 发酵产物主要为有机酸. 乙醇的形成主要通过PFL代谢途径. 将PET操纵子转入K. oxytoca M5A1，发酵液中90%的发酵产物为乙醇，低拷贝质粒pLOI555比高拷贝质粒pLOI297具有更高的乙醇产率[41]；并且该菌株更适合木糖的发酵，其木糖代谢速率在前24 h与葡萄糖一样，达2 g/L/h，是KO11的2倍. 该重组菌株与其他重组菌相比，具有最高的理论产率(表2). 同样，为提高PET操纵子的遗传稳定性，将其整合至K. oxytoca M5A1染色体Pyruvate formate lyase (pfl)基因位点上，但该重组菌株乙醇产率较低，通过高浓度氯霉素抗性筛选，得到乙醇产率较高的菌株[42]，其中菌株P2能在48 h内发酵葡萄糖(100 g/L)或纤维二糖(100 g/L)，乙醇产率达44~45 g/L，与质粒型工程菌株基本一致. 对P2菌株也进行了不同底物的发酵评估研究. Zhou和Ingram等还通过将来源于E. chrysanthemi 的内切葡聚糖酶基因转入P2菌株中进行整合型表达，得到重组菌株SZ21，但其酶活性较低，为20 U/mL，仅为商业化酶的1%，其发酵纤维素的能力较低，但若加入一定的商业化纤维素酶，其乙醇产率较P2高7~16%左右[43].5 展望综上所述，目前对纤维素发酵的菌种进行了大量的工作，也得到了具有一定效率的重组菌株，但这些工作基本上是基于单个基因或是某个代谢途径的几个基因的改造，只是改变了细胞的局部，部分改变了细胞的代谢平衡，虽然得到了新的表型，但这种改变是有限的，并没有解决木糖代谢途径中的复杂问题，致使构建得到的重组菌株未能在商业化生表2 4种重组菌株发酵木糖产乙醇的的比较Table 2 Comparison of four recombinant strains for ethanol production from xylose重组菌株Recombinant strain 木糖 Xylose(ρ/g L-1)乙醇产率Ethanol yield (ρ/g L-1)理论产率Theoretical yield (r/%)References参考文献E. coli KO119041.089[44] E. coli FBR59541.590[36] E. coli LY0114063.288[44] K. oxytoca M5A1 (pLOI555)10046.095[41] Z. mobilis AX101Ara : Glc : Xyl 20 : 40 : 404284[29] Z. mobilis CP4 pZB56023.094[45] S. cerevisiae TMB34005013.367[17] S. cerevisiae RWB21820 8.485[17] S. cerevisiae RE700A(pKDR)451974[17, 46]583 4 期何明雄等：利用木质纤维素类生物质发酵生产乙醇重组菌株研究进展产中得到应用. 因此，可以在木糖代谢途径的基因组层面上定向进化或同时改变多个相关基因群，使细胞在整体水平上适应木糖的代谢或利用. 目前这些菌株的基因组序列已经测定，但在基因组水平上的菌种改造主要集中在酿酒酵母上. 对重组木糖酵母的代谢组学和蛋白质组学已经展开，这对了解重组酵母的木糖代谢调控机制具有十分重要的意义[47]. 而毕赤酵母基因组序列的测定[48]，其基因组特点和基因调控模式等也会对构建工程酵母起重要作用；代谢建模、代谢流量分析、表达谱分析、突变和适应性进化等方法也为构建高效率的木糖发酵菌种提供了重要的方法学依据[49]；Alper通过gTME技术对酿酒酵母的改造工作为改造木糖酵母提供了有益的借鉴[50]，该技术在系统生物学的层面通过改造全局转录调控因子使整个转录调控过程发生变化从而改变或提高目标基因的转录及表达，获得需要的表型[51]. 随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学和生物信息学等方面的发展，在系统生物学的层次上进行乙醇发酵菌种的改造，从基因调控的水平上将新加入的代谢途径与原有的代谢途径协调，提高外源基因的表达水平，将会得到高效率的乙醇发酵菌种.References1 Chen HZ (陈洪章) ed in chief. 秸秆资源生态高质化理论与应用. 北京:化学工业出版社, 20062 Li K (李科), Jin YL (靳艳玲), Gan MZ (甘明哲), Liu XF (刘晓风),Zhao H (赵海). 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