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1、食品生物技术的基本概念：食品生物技术是现代生物技术在食品领域中的应用，是指以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料的技术。
2、食品生物技术的研究内容：基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程、发酵工程、生物技术下游技术、现代分子检测技术。
3、食品生物技术核心和基础：基因工程技术。
4、食品生物技术作用:○1设计新型的食品及其食品原料○2为发酵工业提供品质优良的工程菌种，促进发酵工业发展○3开发新型的对人类有益的蛋白质和酶○4促进功能因子的提取技术的发展○5改变传统的食品加工工艺，提升食品的品质○6食品分析和保鲜○7处理食品工业废水。
5、基因工程的操作步骤：○1在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体（质粒、病毒、噬菌体）○2把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接组成重组体○3把重组体引入宿主细胞○4筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。
6、食品DNA提取的方法：CTAB法和SDS法。
7、基因工程的工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、碱性磷酸酯酶、S1核酸酶、逆转录酶。
8、Ⅱ型限制性内切酶：一类分子质量较小的单体蛋白，作用时仅需要镁离子存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段；切割特点是：一般能识别和切割4~8个碱基对的核苷酸序列；大多数识别序列具有回文结构；没有甲基化修饰酶功能；切割方式○1切割产生5'突出的粘性末端○2切割产生3'突出的粘性末端○3切割产生平头末端。
内切酶识别位点末端类型内切酶识别位点末端类型Bbu ⅠCGACG3'突出NotⅠGCGGCCGC5'突出CGTACG CGCCGGCGSfi ⅠGGCCNNNNNGGCC3'突出Sau3AI GATC5'突出CCGGNNNNNCCGG CTAGEco RⅠGAATTC5'突出AluⅠAGCT平头末端CTTAAG TCGAHin dⅢAAGCTT5'突出HpaⅠGTTAAC平头末端TTCGAA CAATTG9、限制性内切酶的反应系统：底物DNA、反应缓冲液、酶、反应温度、时间。
第一章食品生物技术：现代生物技术在食品领域中的应用，以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料。
基因工程：用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。
细胞工程：细胞工程就是在细胞水平上，利用细胞学和现代分子生物学的研究成果，根据人们的需求设计改变细胞的遗传基础，通过细胞培养技术、细胞融合技术等，大量培养细胞乃至得到完整个体的技术。
蛋白质工程：蛋白质工程是通过对蛋白质化学、晶体学和动力学的研究，获得有关蛋白质理化和分子特性的信息，然后进一步对蛋白质进行有目的设计和改造。
大致可分为两方面：基因水平上的蛋白质改造；蛋白质修饰，即蛋白质翻译后的基因修饰。
酶工程：利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是酶学理论、基因工程、蛋白质工程、发酵工程相结合形成的一门新技术。
发酵工程是生物技术的重要组成部分是生物技术产业化的重要环节，它将微生物学，生物化学和化学工程的基本原理有机地结合起来，建立在基因工程基础上的一门应用技术型学科。
生物工程下游技术：指将发酵工程、酶工程、蛋白质工程和细胞工程生产的生物原料，经过提取、分离、纯化、加工等步骤，最终形成产品的技术。
第二章基因工程作为生物技术的核心内容，已成为现代高息技术的标志之一基因工程：用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。
基因工程的基本过程就是利用重组DNA技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产生出人类需要的基因产物。
基因工程的操作过程：一.在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体（质粒，病毒或噬菌体）二.把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接成重组体三．把重组体引入宿主细胞四.筛选、鉴定出含外源目的基因的菌体或个体DNA提取的基本步骤包括生物材料的准备、细胞裂解、DNA的分离和纯化。
食品生物技术：是现代生物技术在食品领域中的应用，是指现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料基因工程：又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品基因工程的理论基础：1、不同基因具有相同的物质基础2、基因是可切割和转移的3、多肽与基因之间存在对应关系4、基因的遗传信息是可以遗传的基因工程的主要内容：1、在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以别离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体〔质粒、病毒或噬菌体〕2、把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接组成重组体3、把重组体引入宿主细胞4、筛选、鉴定出含有外源目的基因或个体工具酶：限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶Ⅰ型限制性内切酶：不能专门切割DNA的某个特殊位点〔未大量使用〕Ⅱ型限制性内切酶：可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段〔广泛应用〕➢同裂酶：来源不同，具有相同的识别序列➢同尾酶：识别序列不同，切割后，具有相同的DNA黏性末端Ⅲ型限制性内切酶：具有独特的识别方式和切割方法，如MboⅡ基因载体：质粒〔能自主复制的双链DNA分子，在细菌中独立于染色体之外存在：①具有复制起点②相对分子质量尽可能小③有单一的限制性内切酶识别位点④有一个或多个选择标记基因〕、植物病毒、噬菌体理想的基因工程载体具备的特征：1、能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，在外源DNA插入其DNA复制的非必需区内，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性2、易于从宿主细胞中别离，并进行纯化3、有适当的限制性内切酶单一酶切位点4、具有能够直接观察的表型特征质粒载体pBR322：大小为4363bp，含有两个抗生素抗性基因〔抗氨苄青霉素和抗四环素〕，还有单一的Bam HⅠ、HindⅢ和SalⅠ的识别位点，这三个位点都在四环素抗性基因内；另一个单一的PstⅠ识别位点在氨苄青霉素抗性基因内质粒载体pUC19：pBR322带的单一克隆位点较少，筛选程序较费时，pUC19是在其发展的，有一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因〔lac Z’〕的调节片段，一个调节lac Z’基因表达的阻遏蛋白的基因lacⅠ，还有多个单克隆位点酵母质粒载体：既可以在大肠杆菌中复制，又可在酵母系统中复制，又称穿梭载体噬菌体载体：细菌病毒聚合酶链式反应法〔PCR〕：PCR模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的快速聚合及扩增。
第二、四、八章一、名词解释1、食品生物技术：食品生物技术指生物技术在食品工业中的应用，其以基因工程技术为核心手段，包括细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等技术，贯穿于食品制造的全过程（上游过程和下游过程）。
或者，利用生物体及其细胞、亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段研究及加工处理或制造食品产品的新技术。
2、基因工程：指用酶学方法将异源基因与载体DNA进行体外重组，将形成的重组DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需的生物品种和产物，也称分子克隆或重组DNA技术。
3、目的基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状，又称特异基因或靶基因。
4、基因重组：指将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。
5、感受态：指宿主细胞能吸收外源DNA分子而有效作为转化受体的某些生理状态。
6、限制性内切酶：指一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。
7、酶的固定化：是指将酶与不溶性载体结合，使游离酶、细胞或细胞器等的催化活动完全或基本上限制在一定空间内的过程。
8、酶分子修饰：通过改变酶分子的结构，使酶的某些特性和功能发生改变的技术。
9、转基因食品：是指用转基因生物制造、生产的食品、食品原料及食品添加物等。
10、受体（宿主）细胞：指在转化、转导和杂交中接受外源基因DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。
二、思考题1、碱性SDS法提取质粒的原理。
在pH12.0~12.5范围内使染色体中双螺旋开链DNA选择性变性，而闭环双链DNA不变性。
经乙酸钠中和后，SDS引起蛋白质-SDS复合物和相对分子质量高的DNA沉淀，再经高速离心将质粒DNA留于上清液中而分离。
第一章绪论食品生物技术：食品生物技术是现代生物技术在食品领域中的应用，是指以现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料。
基因工程技术是核心和基础。
掌握基因工程的概念/基因工程的四大要素基因工程的关键技术和原理第二章基因工程第一节基因工程：指用酶学方法将异源基因与载体DNA进行体外重组，将形成的重组DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需的生物品种和产物，也称分子克隆或重组DNA技术。
基因工程的基本过程①从供体细胞中分离出含目的基因的DNA②限制性内切酶截取DNA片断③从大肠杆菌中分离出质粒并酶切④连接酶连接酶切的目的基因与质粒（DNA重组）⑤把重组质粒引入宿主细胞（转化）⑥克隆目的基因，筛检后表达即基因工程是基因的一种操作平台与技术基因工程五大基本操作单元：切、接、转、增、检切、接：DNA的体外重组转、增：重组DNA分子的转化（可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中）与扩增（某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供可能）检：转化子的筛选与鉴定基因工程四大要素:工具酶、目的基因（制备）、基因载体、基因受体第二节一、DNA的分类染色体DNA：获取目的基因的主要生物材料质粒DNA：应用最广泛的载体工具病毒、噬菌体DNA：构建克隆载体、分离目的基因和基因表达调控因子的材料线粒体和叶绿体DNA：获取目的基因的材料二、DNA的提取1、准备生物材料选择DNA含量丰富、含杂质少的材料或组织。
对于提取质粒DNA，需要把菌液培养至对数生长期后期；对于植物DNA，选用植株幼嫩部位或幼苗，减少因淀粉或糖分的积累对提取DNA 的干扰；提取动物DNA，需要去除酶活性高的部位。
2、裂解细胞裂解要适度，避免DNA链断裂。
对于结构简单的原核生物，用溶菌酶、超声波、NaOH、SDS处理，或煮沸、冷冻处理；真核生物类的植物、动物，先粉碎（液氮冷冻后研磨，或直接用捣碎机或研钵破碎）组织，然后用裂解原核生物细胞的方法处理。
3、分离和纯化DNA裂解后的细胞液中加入蛋白质变性剂（酚/氯仿/异戊醇、SDS等），使蛋白质变性，再通过离心，除去蛋白质等杂质。
然后使用有机溶剂（乙醇或异丙醇）聚集沉降DNA，除去溶液得粗到DNA，再进一步纯化（用酚/氯仿抽提，70%乙醇洗涤）。
三、DNA的检测——凝胶电泳技术1、凝胶电泳的基本原理当分子置于电场中时，由于本身带有一定的电荷，其会以一定的速度向适当的电极移动（电泳分子在电场中的迁移速度称为电泳的迁移率），迁移率与电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比，而与介质分子的摩擦系数成反比。
根据分子大小的不同，构型或形状的差异，以及所带净电荷的多少，可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中各成分分离开来。
DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态（也称多聚阴离子），带负电荷，置于电场中时向正电极移动，不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的迁移率就不同，从而分出不同的区带。
电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。
2、凝胶类型琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶使用特点：一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50kb范围内的DNA片段，聚丙烯酰胺凝胶适用于1~1000bp的，故琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。
凝胶浓度越高，孔隙越小，分辨能力越强。
第三节工具酶一、限制性内切酶1、概念指一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。
2、限制性内切酶种类I型酶：在识别位点很远的地方任意切割DNA链，识别特异性差，且需辅助因子，应用价值不大。
II型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因子或只需Mg2+，适合基因工程。
III型酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列，无规律；很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。
3、限制性内切酶命名原则1973年由H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统由三部分构成，即菌系编号、菌株名、分离顺序。
（1）用属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）组成的3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
（2）菌株名以非斜体符号加在前三个字母后面，如Eco k, Eco R（3）同一菌株中有不同的限制性内切酶时，按分离顺序用罗马字母表示，正体书写，如Eco R I，Eco R V。
4、限制性内切酶作用机制和方式（1）作用机制限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为底物，在一定条件下，识别一定的核苷酸序列，在两条链的特定的磷酸二酯键上催化切开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。
（2）酶切特点识别双链DNA分子中4—8对碱基的特定序列（识别长度）大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧（切割位点）识别切割序列呈典型的对称回文结构。
（识别结构）识别序列：限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列。
（同分子中识别序列短的出现几率大，反之亦然）稀切酶：能够识别长序列及富集GC和AT的识别序列（几率小）的内切酶。
同裂酶：具有相同识别序列的限制酶同尾酶：识别序列不同，但切割得到的DNA片段具有相同的黏性末端。
（3）切割方式1 黏性末端：被限制酶交错切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。
（5’粘性和3’粘性）2 平整末端：同一位点平齐切割DNA两条链而形成的双链末端。
5、限制性内切核酸酶反应系统反应底物（DNA）内切酶用量（活力决定）反应缓冲液（最适pH 7.5）适当的温度（大部分37℃）1U核酸内切酶的活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1 μg标准DNA所需的酶量。
二、DNA连接酶1、概念：能催化DNA分子中相邻的3’-OH和5’-P末端之间形成磷酸二酯键，即可封闭双链DNA上相邻核苷酸之间的单链缺口。
2、主要的两种DNA连接酶（1）大肠杆菌-DNA连接酶：只能连接黏性末端，需NAD+为辅助因子。
（同一种限制酶或两种同尾酶）（2）T4-DNA连接酶：连接黏性末端、平整末端，需ATP为辅助因子。
（同一种或两种限制酶）作用：DNA重组中促使载体与目的DNA连接（即两种来源的DNA）。
（最适温度37℃，或4~15℃）3、非互补黏性末端、非平整末端的连接（1）DNA片段末端修饰核酸外切酶：切成平整末端末端核苷酸转移酶：修饰成互补黏性末端碱性磷酸酶：将5’-P修饰成5’-OH，防止载体自我环化（2）DNA片段加连杆后连接人工合成连杆或衔接头三、其他工具酶DNA聚合酶：PCR扩增T4多聚核苷酸激酶：催化ATP上磷酸转移至5’-OH上，作为DNA的5’-末端标记。
S1核酸酶：分析DNA-RNA杂合子结构；反向转录酶：以RNA为模板，反向转录形成与已知RNA互补的DNA链（构建cDNA文库）。
第四节目的基因的制备一、直接分离法二、化学合成法三、基因文库法四、PCR扩增法1、目的基因的定义目的基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状，又称特异基因或靶基因。
2、目的基因的来源真核生物染色体基因组（人和动物）；原核生物染色体；质粒、病毒、线粒体、叶绿体等。
一、直接分离法工作原理：把染色体DNA用限制内切酶切割，将所有片段链接到某载体上，转入大肠杆菌中增殖。
再用适当方法筛选出含目的基因的的重组体菌落，从重组体菌落提取DNA，经酶切后获得目的基因。
对象：原核生物基因组较小，基因容易定位，或已知核苷酸序列的DNA分子。
优点：快速简便、产物纯度高。
二、化学合成法如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，可以利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。
通常是先合成一定长度（~200bp）、具有特定序列的寡核苷酸片段。
然后将寡核苷酸适当连接组装成完整的目的基因步骤：①合成引物②合成DNA寡核苷酸连杆③合成基因片断④DNA片断的连接重组，采用DNA片段的连接酶有E.coli DNA 、T4-DNA连接酶三、基因文库法工作原理：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。
包含某种生物基因组全部基因的受体菌群体称为该生物的基因组文库。
四、PCR扩增法（聚合酶链式反应）PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
1、PCR技术原理PCR技术的实质为体内DNA复制的体外模拟。
即使双链DNA热变性而分开成为单链DNA，退火后在低温下，两个与模板互补的引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用Taq DNA聚合酶的聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。
每经过一次变性、退火和延伸为一个循环，所扩增的特定DNA序列数量按几何指数增长。
变性：在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA（94˚C）退火：模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。
（55˚C）延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链（72˚C）2、PCR反应步骤①模板DNA的变性：模板DNA加热至94~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环“变性--退火--延伸”过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
3、PCR反应体系反应缓冲液18（l）dNTP（原料基质，由四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dTTP、dCTP组成） 2 Primer1（引物）0.5Primer2（引物）0.5DNA分子（模板） 1Mg2+（酶的辅助因子，10×buffer） 2.5Taq酶（DNA聚合酶）0.54、PCR特点灵敏度高——PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝。
