酱油

发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。

发酵工程的内容包括菌种选育、培养基的配置、灭菌、种子扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。

优良菌株的选育的目的是防止菌种退、解决生产实际问题、提高产品质量和开发新产品。

选育的方法主要有基于基因突变的自然选育和诱变育种以及基于基因重组的杂交、原生质体融合、基因工程等用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。

来源于自然界大量的微生物，从中经分离并筛选出有用菌种，再加以改良，贮存待用于生产。

3 酱油我国酱油主要分为酿造酱油和配制酱油，酱油酿造是利用微生物的发酵作用，生成酱油特有的色、香、味等过程，酿造微生物的性状决定了酱油品质及其原料的利用率。

由此法生产的酱油可以产生浓厚的酱香和酯香，但氨基酸转换率略低，鲜味不足。

目前，国内外酱油酿造工作者都致力于选育各种优良菌株，提高发酵菌株某些性能来提高酱油的鲜味。

酱油的鲜味直接受谷氨酰胺酶活性的影响，因此，选育高活性谷氨酰胺酶菌株应用于酱油生产成为酿造工作者一直关心的问题。

为此，日本利用枯草杆菌开发了一种适合酱油生产的谷氨酰胺酶来提高酱油的鲜味，得到了比较好的效果。

国内也曾有用枯草杆菌作为酱油的发酵菌株，研究了该菌株所分泌出酶的性质，提出了该菌株可作为生产酱油的发酵菌株。

韩铭海等筛选到一株高产谷氨酰胺酶菌株，研究了该酶的一系列性质，最终可以确定该菌株可应用于酱油发酵。

国内也曾有研究枯草杆菌产谷氨酰胺酶的报道，并提出应用于酱油发酵的前景。

但在目前的酱油酿造生产菌以曲霉为主，主要是米曲霉和黑曲霉，其中以保存在上海沪酿研究所的米曲霉沪酿3.042为生产菌株更为普遍。

近些年来，上海酿造科学研究所对沪酿3.042进行诱变育种，选育出中性蛋白酶活力高的沪酿UE328和沪酿UE336。

最近又以沪酿UE336菌株为出发菌株经亚硝酸、快中子、乙基磺酸甲烷、秋水仙碱等交换诱变，从667株菌中选出谷氨酰胺酶高产菌沪酿422号米曲霉。

新菌株沪酿422号米曲霉谷氨酰胺酶活力比对照菌株提高2倍以上，在同等条件下酿制的酱油谷氨酸含量提高40%左右。

冯清平等将米曲霉3.811菌株，经微波和乙基磺酰甲烷诱变后，又用谷氨酰胺驯养而选育出一个突变体，突变菌株EM-3015-40谷氨酰胺酶活力较原始菌株提高了50.8%。

周传云以酱油酿造用菌粉为出发菌（S），经分离、纯化后再经紫外诱变及控温培养后，获得了1株突变株，对该菌株进行发酵实验，突变株产酶活力更高，遗传性能稳定，所酿制出的酿油质量指标明显优于出发菌株。

由于谷氨酰胺酶系胞内酶，只有在发酵后期才能随菌体自溶才释放出来发挥作用，施安辉将选育的黑曲霉ASP-1号菌株，以聚乙烯醇为载体，包埋黑曲霉ASP-1号菌丝体进行固定化，固定化后的谷氨酰胺酶活力远高于游离细胞，用这种方法提高了谷氨酰胺酶的活性，且可以多次使用。

刘茵曾将上海酿造科学研究所培育的谷氨酰胺酶高产菌沪酿3.422米曲霉采用固定化技术，将谷氨酰胺酶活力高的菌体，通过包埋法将其固定，研究了固定后产酶特性及性质，结果发现固定后的菌株更有利于发酵生产鲜味酱油。

菌株选育典型流程出发菌株（砂土管或冷冻管）小试原种特性考擦斜面或摇瓶培养24h 培养基优化单孢子悬液菌悬液挑出高产菌株诱变处理摇瓶复筛处理前后计数稀释涂平板传种斜面观察单菌落形态挑选单菌落转种斜面保藏菌株对照组比较摇瓶初筛挑出高产斜面3.1 自然选育自然选育是指在特定环境下长期处理某一微生物培养物，同时不断地移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变（spontaneous mutation）体的古老的育种方法。

自发突变的频率较低，变异程度不大，所以，用该法培育新菌种的过程十分缓慢。

后来发展了诱变育种、杂交育种、尤其是基因工程等育种技术。

自然选育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗(BCG vaccine)。

法国的卡尔密脱(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养230代，前后经历13年时间，终于在1923年获得显著减毒的结核杆菌----卡介苗。

自然选育的作用：自然选育在工业生产中可以达到纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产量的目的。

3.2 诱变育种诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。

3.2.1 诱变剂及其诱发机理1,物理诱变剂物理诱变主要是采用辐射。

如紫外线,X射线,γ射线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。

本节将主要讨论紫外线。

生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处，该波长也是微生物的最敏感点。

紫外线诱变机理是它会造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应。

交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。

它会引起DNA复制错误，正常的碱基无法配对，造成错义或缺失。

图1,嘧啶的紫外线光化产物过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA，或使交联的DNA无法打开，不能进行复制和转录，从而引起菌体死亡。

在正常的微生物细胞中，紫外线造成的DNA损伤是可以得到及时修复的。

若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降，这就是光复活作用。

图2 光复活作用修复胸腺嘧啶二聚体的过程(PRE为光复活酶)光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶(photoreactivatingenzyme)，即光裂合酶(photolyase)。

光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。

可见光光能(300-500nm)可以激活光复活酶，使之打开二聚体，将DNA复原。

与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能。

一般微生物细胞内都具有光复活酶，所以,微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作。

但因为在高剂量紫外线诱变处理后，细胞的光复活主要是致死效应的回复，突变效应不回复，所以，有时也可以采用紫外线和可见光交替处理，以增加菌体的突变率；光复活的程度与可见光照射时间、强度和温度(45-50℃温度下光复活作用最强)等因素有关。

细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，所以称为暗修复(dark repair)或切除修复作用(excision repair)。

它可修复由紫外线,γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。

暗修复体系有四种酶参与反应。

首先由核酸内切酶切开二聚体的5’末端,形成3’-OH和5’-P 的单链缺口，然后，核酸外切酶从5’-P到3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口，接着,DNA 聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3’-OH 端起合成缺失片段，最后，由连接酶将新合成链的3’-OH与原链的5’-P相连接。

光复活作用使胸腺嘧啶二聚体复原成两个胸腺嘧啶，暗修复则是将胸腺嘧啶二聚体切除。

细胞中还存在另一种在并不改变胸腺嘧啶二聚体的情况下的修复系统，即重组修复(recombinationrepair)。

重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复(postreplication repair)。

重组修复中DNA损伤并没有除去，当进行下一轮复制时，留在母链上的损伤仍会给复制带来困难，还需要重组修复来弥补，直到损伤被切除修复消除。

但是，随着复制的进行，若干代后，即使损伤未从母链中除去，而在后代的细胞群中也已被稀释，事实上消除了损伤的影响。

图3 重组修复过程2,化学诱变剂化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多，常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。

(1)与核酸碱基化学反应的诱变剂此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。

烷化剂(alkylating agent) 带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。

它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。

常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。

甲基磺酸甲酯是单功能烷化剂，氮芥是双功能烷化剂。

NTG和NMU因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。

双功能烷化剂可引起DNA二条链交联，造成菌体死亡，所以其毒性比单功能烷化剂强。

碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成6-烷基鸟嘌呤，并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。

胸腺嘧啶被烷基化后，可与鸟嘌呤错误配对，见图4。

图4 EMS 的烷基化造成的碱基转换亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基,如使腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)分别脱氨基成为次黄嘌呤(H)、尿嘧啶(U)和黄嘌呤(X)。

复制时，次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)配对，见图5图5 亚硝酸引起碱基氧化脱氨基效应1.腺嘌呤氧化脱氨基成为次黄嘌呤，与胞嘧啶配对；2,胞嘧啶氧化脱氨基成为尿嘧啶，与腺嘌呤配对；3,鸟嘌呤氧化脱氨基成为黄嘌呤，仍与胞嘧啶配对，不能引起碱基转换(2)碱基类似物这些化合物有5-溴尿嘧啶(5-BU),5-氟尿嘧啶(5-FU),8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP)等。

它们与碱基的结构类似，在DNA复制时,它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。

(3)移码突变的诱变剂移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。

由移码突变产生的突变体称为移码突变体。

吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、吖啶橙及α-氨基吖啶等)和一系列称为ICR类的化合物(它们是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物)都是移码突变的有效诱变剂3.2.3 诱变育种方法中应注意的问题1.出发菌株的选择用来育种处理的起始菌株或称为出发菌株，合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。

首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力。

出发菌株的来源主要有三方面：(1)自然界直接分离到的野生型菌株这些菌株的特点是它们的酶系统完整，染色体或DNA 未损伤，但它们的生产性能通常很差(这正是它们能在大自然中生存的原因)。

通过诱变育种，它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变)的可能性大。

(2)经历过生产条件考验的菌株这些菌株已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。