2019年最新-Identifying Proteins with Tandem Mass Spectrometry - Lectures：识别和串联质谱蛋白质-讲座-

铁皮石斛类唾液酸转移酶基因的分子鉴定张岗;王昌利;李依民;沈霞;刘清【摘要】利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀濒危药用植物铁皮石斛(Dendrobium of ficinale)中分离到一个类唾液酸转移酶(sialylt ransferase-like proteins,STLP)基因,命名为DoSTLP1(GenBank注册号KC178574).序列分析结果表明,DoSTLP1基因全长cDNA为1 340 bp,编码1条由367个氨基酸组成的肽链,分子量41.66 kD,等电点8.64；DoSTLP1蛋白具有唾液酸转移酶和糖基转移酶29家族的保守结构域(分别为1～357,87～346位氨基酸)、信号肽(1～27)和跨膜结构域(3～25,285～311).多序列比对和系统进化结果显示,DoSTLP1与多种植物的STLPs基因有较高的相似性(44.7％～53.7％),而且与水稻、玉米等单子叶植物STLPs基因的亲缘关系较近.实时定量PCR分析显示,DoSTLP1基因在铁皮石斛根、茎、叶器官中为组成型表达,其转录本在石斛根中的相对表达量较高,为叶中的2.857倍,茎和叶中的表达量无显著差异.该研究为进一步解析该基因在铁皮石斛生长发育过程中的生物学功能奠定基础.%In the present study,a sialyltransferase-like proteins (STLP) gene,designated as DoSTLP1 (GenBank accession No.KC178574),was identified from a medicinally important species Dendrobium officinale,using RT-PCR and RACE methods.Sequence analyses showed that the full length cDNA of DoSTLP1 was 1 340 bp and encoded a 367 aa with a molecular weight of 41.66 kD and an isoelectric point of 8.64;The deduced DoSTLP1 protein contained the sialyltransferase and glycosyltransferase family 29conserved domains (1 ～357,87～346),together with a signal peptide sequence (1～27) and two transmembrane helices (3～25,285～311).Multiple sequence alignment andphylogenetic analysis demonstrated that DoSTLP1 was highly similar (44.7~53.7％) to STLPs genes from various plant species and was closely related to those from monocots.Real time quantitative PCR analysis revealed that DoSTLP1 was constitutively expressed in the leaf,stem and root organs.The transcription level of DoSTLP1 in roots was relatively higher than that of leaves with 2.857 fold.Molecular characterization of DoSTLP1 will be helpful for further functional elucidation of the gene involving in the development of D.officinale.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2013(033)002【总页数】6页(P229-234)【关键词】铁皮石斛;唾液酸转移酶;基因表达;分子鉴定【作者】张岗;王昌利;李依民;沈霞;刘清【作者单位】陕西中医学院药学院/陕西省中药基础与新药研究重点实验室,西安712046;陕西中医学院药学院/陕西省中药基础与新药研究重点实验室,西安712046;陕西中医学院药学院/陕西省中药基础与新药研究重点实验室,西安712046;陕西中医学院药学院/陕西省中药基础与新药研究重点实验室,西安712046;陕西中医学院药学院/陕西省中药基础与新药研究重点实验室,西安712046【正文语种】中文【中图分类】Q789唾液酸（Sialic acids，SAs）即 N－乙酰基神经氨酸，是带负电荷的9碳单糖衍生物，以受体蛋白和脂类等碳水化合物末端糖基化形式存在在于病毒、细菌和动物中［1－2］。

2222　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.11㊃数据挖掘㊃基金项目:国家中医药管理局 新型冠状病毒肺炎中医药应急专项”(2020ZYLCYJ04⁃2);云南省科技计划创新引导与科技型企业培育计划(202104AR040002);国家中医药管理局全国名老中医专家(王鹏)传承工作室建设项目(国中医药人教函[2022]75号)作者单位:430061　武汉,湖北中医药大学中医临床学院[曹悦(硕士研究生)];北京中医药大学中药学院(林瑞超);云南省药物研究所注册与临床医学部(董汛㊁张柏娥);湖北中医药大学第一临床学院湖北省中医院肺病科(杨宏志)作者简介:曹悦(1998-),2022级在读硕士研究生㊂研究方向:中医药防治肺系疾病.E⁃mail:134****5582@通信作者:杨宏志(1977-),硕士,教授,主任医师㊂研究方向:中医药防治肺系疾病㊂E⁃mail:867923535@基于网络药理学和分子对接技术探讨香藿喷雾剂治疗新冠肺炎的作用机制曹悦　林瑞超　董汛　张柏娥　杨宏志【摘要】　目的　基于网络药理学和分子对接技术探讨香藿喷雾剂治疗新冠肺炎潜在的作用机制㊂方法　运用中药系统药理学数据库和分析平台检索香藿喷雾剂相关活性化合物和作用靶点,在DisGeNET㊁Gencards㊁CTD㊁PharmGKB 数据库中得到相关基因㊂运用Cytoscape_v3.7.2构建 活性成分-靶点”网络图㊂运用R 软件进行基因本体功能富集分析和京都基因与基因组百科全书通路信号富集分析㊂利用AutoDock 软件进行分子对接验证㊂结果　检索得到87个药物活性成分,1069个药物作用靶点,得到11763个与新冠肺炎相关的基因,筛选得到150个交集基因,获得166条GO 功能,171条KEGG 通路㊂KEGG 通路富集主要在病毒感染㊁炎症以及血脂与动脉粥样硬化等方面㊂主要分子对接结果显示香藿喷雾剂与新冠肺炎的分子结合能较低,构象较稳定㊂结论　香藿喷雾剂可能作用于炎性因子和丝裂原活化蛋白激酶等靶点,通过抗病毒㊁抗炎症㊁调节脂质等方面的信号通路发挥治疗新冠肺炎的作用㊂【关键词】　香藿喷雾剂;　新型冠状病毒肺炎;　网络药理学;　分子对接;　作用机制【中图分类号】　R285.5　【文献标识码】　A　doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.11.010Discussion on the mechanism of Xianghuo Spray in the treatment of COVID⁃19based on network pharmacology and molecular docking technologyCAO Yue ,LING Ruichao ,DONG Xun ,ZHANG Bai ’e ,YANG HongzhiClinical College of Traditional Chinese Medicine ,Hubei University of Chinese Medicine ,Wuhan 430061,ChinaCorresponding author :YANG Hongzhi ,E⁃mail :867923535@【Abstract 】　Objective To investigate the potential mechanism of action of　Xiang Huo spray in thetreatment of (coronavirus disease 2019)COVID⁃19based on network pharmacology and molecular docking technology.Methods The pharmacology database and analysis platform of Chinese medicine system wasused to search for the active compounds and targets related to the Xiang Huo spray,and the relevant genes were obtained in the DisGeNET,Gencards,CTD,PharmGKB database.The active component⁃target”network map was constructed by using Cytoscape_v3.7.2.Gene ontology functional enrichment analysis andKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway signal enrichment analysis were carried out using Rsoftware.Molecular docking validation was performed using the AutoDock software.Results 87drug active ingredients and 1069drug action targets were obtained,11763genes related to COVID⁃19were obtained,150环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112223　intersecting genes were screened,166GO functions and171KEGG pathways were obtained.KEGG pathway enrichment was mainly found in viral infection,inflammation,and blood lipids and atherosclerosis.Theresults of the docking of the main molecules showed that the molecular binding energy ability of the XiangHuo spray to COVID⁃19was low and the conformation was more stable.Conclusion　Xiang Huo spraymaybe act on targets such as inflammatory factors and mitogen⁃activated protein kinase in the treatment ofCOVID⁃19through signaling antiviral,anti⁃inflammation and lipid regulation.【Key words】　Xiang Huo spray;　Corona virus disease2019;　network pharmacology;　molecular docking;　action mechanism 2019年末中国突发新型冠状病毒肺炎(以下简称 新冠肺炎”),且病情发展迅速㊂本课题组基于前期对病毒性感冒㊁流行性感冒㊁咽炎㊁鼻炎等呼吸系统疾病的研究,结合新冠肺炎的临床特征研制出一款复方中成药制剂 香藿喷雾剂㊂其剂型为喷雾剂,该药制剂工艺主要以提取挥发油入药,既保留了传统组方的疗效,又具有使用便捷㊁药物可直达病所等优点㊂2020年4月至5月期间,本课题组运用香藿喷雾剂治疗新冠肺炎患者,结果显示该药能显著改善患者症状,临床总有效率达到了98.30%,同时具有良好的安全性[1]㊂网络药理学是融合了生物学㊁药理学㊁生物信息学等多学科技术和内容的新兴学科,系统综合地预测与分析复方药物对疾病的影响,构建 药物 靶点 疾病”网络,探讨可能存在的作用机制[2-3]㊂本文基于前期临床研究结果,应用网络药理学对香藿喷雾剂的治疗作用机制进行预测和分析,并为后续研究提供参考㊂1　材料与方法1.1　药物活性成分筛选㊁治疗靶点收集香藿喷雾剂为云南省药物研究所研发和生产,其药物规格为每瓶20mL,每揿含广藿香挥发油2.86mg(相当于生药材0.143g)㊁香薷挥发油1.43mg (相当于生药材0.15g)㊁艾叶挥发油1.43mg(相当于生药材0.37g)㊁丁香挥发油0.714mg(相当于生药材0.017g)和薄荷挥发油0.714mg(相当于生药材0.039g)等㊂在中药系统药理学数据库和分析平台(/tcmsp.php,TCMSP)中分别输入基本药方中的6味中药名称(广藿香㊁苍术㊁香薷㊁艾叶㊁丁香㊁薄荷),查找各自的有效化学成分,并依据口服生物利用度(oral bioavailability OB)和类药性(drug⁃likeness,DL)两个参数筛选目标成分,筛选条件为同时满足OB≥30%,DL≥0.10两个条件,获得香藿喷雾剂的活性成分㊂将所得化合物成分通过TCMSP数据库进行成分的靶点获取,通过Perl脚本,结合UniProt(https:///)数据库,标准化每种活性成分的药物靶点,物种限于 智人”,并将靶蛋白转化为相应的基因,同时汇总删除重复项㊂将药物㊁活性成分㊁靶点基因相对应,再将genesymbol与之对应㊂1.2　疾病靶点筛选在DisGeNET(https://)数据库中以 Corona virus disease2019”(简称COVID⁃19)为关键词进行检索,设置Scoregda≥0.98进行筛选导出到Excel,在GeneCards(https://www. )数据库中,Score值越高,表示该靶点与疾病关系越密切,若靶点过多则设定Score值大于中位数㊂分别将CTD(https:///)以及PharmGKB(https://)数据库中得到的靶点基因导出,输入到UniProt数据库中,校正基因,去除假阳性后,通过Excel对四个数据库所得基因进行查重合并㊂1.3　蛋白相互作用网络构建使用Venny[Venny2.1.0(csic.es)]绘制香藿喷雾剂活性成分与新冠肺炎相关靶点的韦恩图㊂在 List1”栏内输入有效活性成分的靶点,在 List2”栏内输入新冠肺炎的相关靶点,得到韦恩图及交集基因,交集基因即为香藿喷雾剂治疗新冠肺炎的潜在靶点㊂将交集基因输入String(https://cn.string⁃db. org/)数据库,设定属性为 人类”,置信度≥0.4,未连接的节点被隐藏,其余参数设置为默认值,得到蛋白相互作用网络图㊂其中节点代表蛋白质,边代表蛋白质之间的关系,绿色边表示基因邻域,红色边代表基因融合,深蓝色边代表基因共生,黑色边代表基因共表达㊂保存String的tsv文件,运用R (https://www.r⁃/)软件分析degree,并排序,选取分值靠前的基因作为关键靶点㊂2224　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.111.4　化合物 靶点网络图绘制运用Cytoscape_v3.7.2绘制香藿喷雾剂治疗新冠肺炎的 活性成分-靶点”网络图,将相应数据导入软件中,以 节点”(node)代表活性分子和靶点基因, 边”(edge)代表活性分子和靶点基因的相互关系㊂收集活性成分㊁靶点的连接度,得出关键活性成分和靶基因㊂1.5　功能富集分析将genesymbol转换为entrezID,在R软件中插入 colorspace” DOSE” pathview” clusterProfiler”stringi”包,运用R软件按照富集的数量和显著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff=0.05),对交集基因进行分析,取前20项画出柱状图和点状图㊂1.6　通路富集分析引用1.5安装的插件,运用R软件按照富集的数目和显著程度(pvalueCutoff=0.05,qvalueCutoff= 0.05)进行分析,得到相应的通路图,取前20项画出柱状图和点状图㊂1.7　分子对接1.7.1　配体筛选　将获得的活性成分以连接度来评价其活性强度,选取连接度靠前的化合物木犀草素(luteolin)㊁汉黄芩素(wogonin)㊁柚皮素(naringenin)㊁山柰酚(kaempferol)作为分子对接的供体㊂先在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm. /)数据库中查询2D结构,用ChemBiodraw 画出其分子结构,将2D结构导入ChemBio3D软件,转化为3D结构,导入Autodocktools-1.5.6转换为pdbqt格式进行保存㊂1.7.2　蛋白受体准备　结合各分子的节点度选取雌激素受体1(estrogen receptor1,ESR1)㊁白介素6 (interleukin6,IL⁃6)㊁霉菌原癌基因蛋白(myc proto⁃oncogene protein,MYC)㊁热休克蛋白90α家族A类成员1(heat shock protein90alpha family class A member1,HSP90AA1)㊁血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)㊁半胱氨酸蛋白8(Caspase8,CASP8)㊁表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)㊁丝氨酸/苏氨酸激酶1(serine/threonine kinase1,Akt1)㊁半胱氨酸蛋白3(caspase3,CASP3)㊁丝裂原激活的蛋白激酶1(mitogen⁃activated protein kinase1,MAPK1)作为分子对接的靶点蛋白受体㊂将基因名输入Uniprot数据库,以ReviewedSwiss⁃prot和Human为条件进行过滤,获得EntryID,将ID号输入RCSBPDB (https:///)数据库,下载蛋白受体的结构,将其导入PyMOL和Autodocktools⁃1.5.6进行去水,加氢,合并非急性氢等处理,转换为pdbqt格式进行保存㊂1.7.3　分子对接　运用Autodocktools⁃1.5.6的Grid功能确定活性口袋的位置,保存配置文件,运用Autodockvina1.1.2进行分子对接,得到各受体与供体的结合能㊂2　结果2.1　活性成分与靶点在TCMSP数据库中,以OB≥30%,DL≥0.1为条件进行筛选,得到 藿香”的活性成分28个,靶点基因172个; 香薷”活性成分18个,共有330个靶点; 苍术”活性成分12个,有97个靶点; 艾叶”活性成分12个,共有83个靶点; 薄荷”活性成分13个,对应229个靶点; 丁香”活性成分11个,对应158个靶点㊂将靶点输入UniProt数据库进行校正,依据口服利用度选取前20项活性成分,见表1㊂表1　香藿喷雾剂前20种活性成分分子编号化合物名称OB(%)DL中药名MOL000695patchoulialcohol101.960.14藿香MOL000695patchoulialcohol101.960.14香薷MOL005896Cedren⁃13⁃ol,8⁃86.580.12藿香MOL00139049070_FLUKA85.510.12丁香MOL00139049070_FLUKA85.510.12藿香MOL000471aloe⁃emodin83.380.24薄荷MOL0021531H⁃Cycloprop(e)azulen⁃7⁃ol,decahydro⁃1,1,7⁃trimethyl⁃4⁃methylene⁃,(1aR⁃(1aalpha,4aalpha,7beta,7abeta,7balpha))⁃82.330.12薄荷MOL002338136458⁃42⁃980.860.12藿香MOL005907ZINC020*******.740.16藿香MOL013219Strictosamide_qt76.30.76丁香MOL005890pachypodol75.060.4藿香MOL005190eriodictyol71.790.24薄荷MOL013229caryophyllenol66.490.13丁香MOL002937DIHYDROOROXYLIN66.060.23香薷MOL013228caryophyllenealcohol65.730.13丁香MOL000676DBP64.540.13艾叶MOL000676DBP64.540.13丁香MOL000676DBP64.540.13藿香MOL000676DBP64.540.13香薷环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.1122252.2　疾病靶点在DisGeNET数据库中以 COVID⁃19”为关键词进行检索,设置Scoregda≥0.98,筛选得到405个与新冠肺炎相关的基因㊂在Gencards数据库中得到4585个相关基因㊂在CTD数据库中得到9875个基因,在PharmGKB数据库中得到9个基因,将4个数据库所得基因输入UniProt数据库校正查重合并得到11673个基因㊂2.3　蛋白相互作用网络运用Venny软件对药物化合物对应靶点1069个以及疾病靶点11673个取交集,得出交集基因150个,得到Venny图,见图1㊂将交集基因输入string数据库中得到蛋白相互作用网络,见图2㊂节点数为154,边数为890,平均节点度11.6,平均局部聚类系数为0.446,PPI富集P值:<1.0e-16㊂运用R软件分析得到节点度最高的基因为Akt1,取前30位绘制柱状图,见图3㊂2.4　化合物 靶点网络将分析得到的药物和疾病的共同基因导入Cytoscape_v3.7.2,构建香藿喷雾剂与新冠肺炎的 活性成分-靶点”网络图,见图4㊂椭圆形代表活性成分,菱形代表基因靶点,活性成分中艾叶为天蓝色,薄荷为深蓝色,苍术为淡青色,丁香为紫红色,藿香为黄褐色,香薷为淡黄色,重复的活性成分为红色,基因靶点为深红色㊂运用Cytoscape_v3.7.2分析得到连接度较高的活性成分包括木犀草素(luteolin)㊁汉黄芩素(wogonin)㊁柚皮素(naringenin)㊁山柰酚(kaempferol)㊁金合欢素(acacetin)㊁葛花苷(irisolidone)芦荟大黄素(aloe⁃emodin)㊁金圣草黄素(chryseriol)㊂注:紫色代表药物,黄色代表疾病,数字代表靶点个数㊂图1　交集基因Venny 图图2　蛋白相互作用网络图2226　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.11图3　节点度前30位基因柱状图图4　活性成分 靶点网络图环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.112227　2.5　功能富集分析引用相应插件,运用R 软件按照富集的数量和显著程度(pvalueCutoff =0.05,qvalueCutoff =0.05),对交集基因进行分析,共获得166条功能,取前20项画出柱状图和点状图,见图5及图6㊂柱状图中横坐标表示富集的基因数量,纵坐标表示基因名,p.adjust(校正后P 值)数值越小表示显著性越高,其颜色越红㊂点状图中横坐标代表基因所占比例,纵坐标代表基因名,圆圈的大小代表富集的基因数目,p.adjust 同柱状图㊂基因富集数目较多的功能为:DNA 结合转录因子结合㊁RNA 聚合酶II 特异性DNA 结合转录因子结合㊁酰胺结合㊁丝氨酸苏氨酸激酶活性的蛋白㊁泛素样蛋白连接酶结合㊁磷酸酶结合㊁肽结合㊁蛋白丝氨酸激酶活性㊁细胞因子受体结合㊁泛素蛋白连接酶结合㊂2.6　通路富集分析引用相应插件,运用R 软件按照富集的数量和显著程度(pvalueCutoff =0.05,qvalueCutoff =0.05)进行过滤,获得171条通路,取前20项通路绘制柱状图见图7,点状图见图8㊂柱状图中横坐标表示富集的基因数目,纵坐标表示基因名,p.adjust (校正后P 值)数值越小表示显著性越高,其颜色越红㊂点状图中横坐标代表基因所占比例,纵坐标代表基因名,圆圈的大小代表富集的基因数目,p.adjust 同柱状图㊂富集基因数目较多的通路:血脂与动脉粥样硬化㊁化学致癌 受体激活㊁糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物受体(advanced gly⁃cosylation end products⁃receptor of advanced gly⁃cosylation end products,AGEs⁃RAGE)信号通路㊁磷脂酰肌醇3⁃激酶/蛋白激酶B (phosphoinositide3⁃kinase /protein kinase B,PI3K⁃Akt)信号通路㊁神经退行性变的途径 多种疾病㊁人巨细胞病毒感染㊁乙型肝炎㊁卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染㊁流体剪切力与动脉粥样硬化㊁化学致癌作用 活性氧物种㊂2.7　分子对接结果分析运用Autodockvina1.1.2进行分子对接,得到4种配体与10种蛋白受体的结合能㊂供体与受体蛋白分子对接的结合能越低,两分子间结合的构象越稳固,发生的相互作用可能性越大㊂结合能小于或等于0时为受体和配体可自由结合㊂笔者查阅相关文献分析后,以结合能≤-5.0kcal /mol 和结合能≤-7.5kcal /mol 为筛选条件,结合能≤-5.0kcal /mol 时结合的较好[4],结合能≤-7.5kcal /mol 结合的非常好[5]㊂分子对接结果,表明核心靶点与重要化合物可以很好地结合,见表2㊂图5　基因功能柱状图2228　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.11图6　基因功能点状图图7　通路柱状图环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.112229　图8　通路点状图表2　活性成分与靶点对接分子结合能活性成分结合能(kcal /mol)ESR1IL6MYCHSP90AA1VEGFA CASP8EGFR AKT1CASP3MAPK1luteolin-9.4-7.3-5.6-5.7-6.9-8.2-8.6-6.0-5.9-7.4wogonin-7.7-6.6-5.1-5.1-6.0-7.2-7.8-5.4-5.4-6.8naringenin-9.0-7.1-5.9-5.8-7.4-8.2-8.0-5.7-6.0-7.3kaempferol-8.9-7.2-5.7-5.5-6.5-7.7-8.1-5.6-5.6-7.43摇讨论香藿喷雾剂借鉴了古代香薰疗法,是将传统名方与现代科技结合研制出的喷雾剂,具有芳香化浊㊁辟秽祛湿等功用㊂复方中药多成分㊁多靶点㊁多通路的特点体现了中医的整体观念,网络药理学构建的 化合物 靶点”网络正符合这种特点,适用于对中药复方的预测研究,其不同于以往的单药㊁单靶点研究,为中药今后的研究提供了新思路,为中医现代化拓宽了道路,符合中西医结合的发展趋势㊂本研究预测了香藿喷雾剂的主要活性成分及作用靶点,并查阅相关文献,进一步验证了本研究的可靠性㊂通过靶点网络分析其主要化合物包括木犀草素㊁柚皮素㊁汉黄芩素㊁山柰酚㊁金合欢素等,蛋白互作网络分析其主要靶点有Akt1㊁ESR1㊁IL⁃6㊁MAPK3㊁MAPK1等㊂功能分析显示其化合物主要作用为DNA 结合转录因子结合㊁RNA 聚合酶II 特异性DNA 结合转录因子结合㊁酰胺结合㊁丝氨酸苏氨酸激酶活性的蛋白㊁泛素样蛋白连接酶结合㊂其主要通路包括血脂与动脉粥样硬化㊁PI3K⁃Akt 信号通路㊁肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路㊁MAPK 信号通路㊁IL⁃17信号通路等㊂91条通路含有Akt1,96个靶点与其紧密相连;46条通路含有IL⁃6,68个靶基因与其相关联;108条通路含有MAPK3,78个靶点与其相关;119条通路含有MAPK1,70个靶点与其相关㊂依据基因富集数目进行排序,前20位通路中有9条涉及病毒感染,2条涉及动脉粥样硬化,1条涉及炎症反应㊂前40位通路中,10条涉及病毒感染,4条涉及炎症反应,2条涉及动脉粥样硬化㊂据此可知信号通路主2230　环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.11要富集于血脂与动脉粥样硬化,病毒感染和炎症反应等通路㊂分子对接结果表明核心靶点与重要化合物可以很好地结合㊂所以香藿喷雾剂可能通过木犀草素㊁柚皮素㊁汉黄芩素等化合物,作用于Akt1㊁ESR1㊁IL⁃6等靶点,调节抗病毒㊁抗炎症㊁脂质等方面的信号通路发挥治疗新冠肺炎的作用㊂3.1　香藿喷雾剂重要化合物据本研究所含化合物预测香藿喷雾剂各组分具有抗炎㊁抗病毒㊁调节免疫等药理作用[6⁃12],部分化合物还有调节血脂代谢的作用[13]㊂木犀草素能够抑制PI3K⁃Akt㊁丝裂原激活的蛋白激酶/激活蛋白1(mi⁃togen⁃activated protein kinase/activator protein1,MAPK/AP⁃1)等通路[14]的传导㊂其还能通过抑制肺部炎症中的MAPK信号路径来减少脂多糖引起的急性肺损伤[15]㊂并且其具有广泛的抗病毒活性,木犀草素与严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus type2,SARS⁃Cov⁃2)表面刺突蛋白特异性结合,从而抑制病毒进入宿主细胞,并且抑制病毒感染所需的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒3⁃糜蛋白酶样蛋白酶(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 3⁃chymotrypsin⁃like,SARS⁃Cov3cl)[16]㊂3.2　核心靶点及功能分析通过功能分析及通路分析,香藿喷雾剂治疗疾病的可能靶点为Akt1㊂Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,包括Akt1㊁Akt2㊁Akt3㊂Akt1也称为蛋白激酶B,其主要功能为调节细胞存活,参与胰岛素信号传导,在血管生成和肿瘤形成方面发挥关键作用㊂活性Akt1具有促进病毒蛋白合成的作用[17],Akt1的显性阴性突变体可以显著抑制RNA病毒表达,并进一步降低病毒衣壳蛋白表达和病毒释放[18]㊂运用Akt抑制剂,与SARS⁃CoV⁃2感染相关的CXCL9㊁CXCL10和CXCL11基因表达显著减少[19]㊂3.3　信号通路分析Akt是PI3K途径的下游介质,Akt的激活依赖于PI3K途径,Akt/PI3K是许多信号通路的关键组成部分㊂PI3K/Akt信号传导路径可能涉及到病毒进入细胞㊂新冠病毒进入细胞有两种主要受体:血管紧张素转换酶2(angiotensin⁃converting enzyme 2,ACE2)和CD147,CD147可以诱导PI3K⁃Akt路径的激活㊂研究表明,PI3K⁃Akt信号通路调节相关网格蛋白从而介导SARS⁃CoV⁃2内吞作用的发生[20]㊂SARS⁃CoV⁃2通过上调细胞内活性氧水平来抑制磷脂酰肌醇3⁃激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(phosphoinositide3⁃kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)途径,从而促进自噬反应㊂SARS⁃CoV⁃2诱导的自噬会触发感染细胞的炎症反应和凋亡[21]㊂抑制PI3K/Akt信号转导通路可以抑制核因子⁃κB (nuclearfactorkappa⁃B,NF⁃κB)和AP⁃1,最终抑制IL⁃6等炎症细胞因子和TNF⁃α的表达[22]㊂脂蛋白(a)在动脉粥样硬化㊁动静脉血栓形成中具有关键作用,有报道称在新冠肺炎炎症风暴后,IL⁃6可能诱导脂蛋白(a)水平的增加,说明脂蛋白(a)与炎症通路之间存在一定联系[23]㊂有研究发现新冠肺炎患者血浆中高密度脂蛋白胆固醇(high⁃density lipoprotein cholesterol,HDL⁃C)水平降低,其降低与炎症标志物C反应蛋白水平升高以及细胞因子风暴的产生可能具有关联㊂低浓度的HDL会促进SARS⁃CoV⁃2介导的感染,但较高的HDL颗粒浓度则会抑制SARS⁃CoV⁃2感染[24]㊂SARS⁃CoV⁃2为RNA病毒所以不可忽略脂质在新冠肺炎中的作用㊂据本研究预测香藿喷雾剂可能通过调节脂质减少新冠病毒的复制,可能通过木犀草素等化合物抑制PI3K⁃Akt通路表达,活性Akt1相应减少,病毒蛋白合成减少,病毒进入细胞相应减少,并减轻细胞中IL⁃6等细胞因子引起的炎症反应㊂木犀草素㊁柚皮素对新冠肺炎的治疗作用已有相关基础研究证实,本课题组拟通过液相色谱-质谱分析出主要化合物,构建小鼠疾病模型,通过随机对照实验验证其余化合物对新冠肺炎的治疗作用㊂拟通过实时荧光定量PCR㊁蛋白免疫印迹法等方法检测组织中Akt1含量以及PI3K⁃Akt通路的变化表达情况,为本研究作进一步的支持㊂综上所述,本研究采用网络药理学的技术手段和分子对接技术对香藿喷雾剂的活性成分和靶点进行了系统性研究,阐释了其对新冠肺炎的分子作用机制,突出了中药制剂多成分㊁多靶标对机体整体调控的特点,为其治疗新冠肺炎提供了理论支持㊂本研究尚存在一定局限性,目前还迫切需要进一步广泛的研究和临床试验,包括有更多患者的临床试验及药理学试验,以进一步确认这些药物的疗效及机制,以便为新冠肺炎患者提供更好的治疗方案㊂参考文献[1]　杨宏志,林瑞超,董汛,等.香藿喷雾剂联合基础康复疗法环球中医药2023年11月第16卷第11期　Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112231治疗新型冠状病毒肺炎恢复期余毒未清证60例临床研究[J].中医杂志,2021,62(17):1509⁃1513.[2]　陈海彬,周红光,李文婷,等.网络药理学 中药复方作用机制研究新视角[J].中华中医药杂志,2019,34(7):2873⁃2876.[3]　申凤霞,李倩,聂宗恒,等.基于网络药理学与分子对接探讨防己 黄芪药对治疗糖尿病肾病的作用机制[J].环球中医药,2022,15(3):408⁃416.[4]　宗阳,丁美林,贾可可,等.基于网络药理学和分子对接法探寻达原饮治疗新型冠状病毒肺炎(COVID⁃19)活性化合物的研究[J].中草药,2020,51(4):836⁃844.[5]　Khan H,Jaiswal V,Kulshreshtha S,et al.Potential AngiotensinConverting Enzyme Inhibitors from Moringa oleifera[J].RecentPat Biotechnol,2019,13(3):239⁃248.[6]　XU J,ZHANG B,CHU Z,et al.Wogonin Alleviates Cisplatin⁃induced Cardiotoxicity in Mice Via Inhibiting Gasdermin D⁃mediated Pyroptosis[J].J Cardiovasc Pharmacol,2021,78(4):597⁃603.[7]　Tutunchi H,Naeini F,Ostadrahimi A,et al.Naringenin,aflavanone with antiviral and anti⁃inflammatory effects:Apromising treatment strategy against COVID⁃19[J].PhytotherRes,2020,34(12):3137⁃3147.[8]　Alam W,Khan H,Shah M A,et al.Kaempferol as a DietaryAnti⁃Inflammatory Agent:Current Therapeutic Standing[J].Molecules,2020,25(18).[9]　马纳,李亚静,范吉平.金合欢素药理研究进展[J].中国现代应用药学,2018,35(10):1591⁃1595.[10]　姚妮,王楚茵,赵希彤,等.芦荟大黄素对Al~(3+)存在下Aβ_(42)聚集和细胞毒性的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(18):99⁃107.[11]　XU Z,HUANG M,XIA Y,et al.Emodin from Aloe 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[20]　Lokhande A S,Devarajan P V.A review on possible mechanisticinsights of Nitazoxanide for repurposing in COVID⁃19[J].Eur JPharmacol,2021,891:173748.[21]　LI F,LI J,WANG P H,et al.SARS⁃CoV⁃2spike promotes in⁃flammation and apoptosis through autophagy by ROS⁃suppressedPI3K/AKT/mTOR signaling[J].Biochim Biophys Acta MolBasis Dis,2021,1867(12):166260.[22]　Khezri M R.PI3K/AKT signaling pathway:a possible target foradjuvant therapy in COVID⁃19[J].Hum Cell,2021,34(2):700⁃701.[23]　Moriarty P M,Gorby L K,Stroes E S,et al.Lipoprotein(a)andIts Potential Association with Thrombosis and Inflammation inCOVID⁃19:a Testable Hypothesis[J].Curr Atheroscler Rep,2020,22(9):48.[24]　Kluck G,Yoo J A,Sakarya E H,et al.Good Cholesterol GoneBad?HDL and COVID⁃19[J].Int J Mol Sci,2021,22(19):10182.(收稿日期:2022⁃10⁃18)(本文编辑:邱灵慧)。

世界最新医学信息文摘 2019年 第19卷 第69期3投稿邮箱：zuixinyixue@·论著·老年男性骨质疏松患者血清促甲状腺素与骨密度及骨代谢指标的相关性研究郑晖1，李颖2＊（通讯作者）（1.华中科技大学同济医学院附属梨园医院 检验科，湖北 武汉 430077；2.华中科技大学同济医学院附属梨园医院 老年研究所，湖北 武汉 430077）0　引言随着老龄化社会到来，男性骨质疏松症发病率逐年增加，严重影响老年男性的健康。

目前对男性骨质疏松的发病机制尚未完全阐明，近年来，垂体-骨代谢轴在骨代谢中的地位逐渐引起研究者的重视[1]，国外研究者发现垂体分泌的促甲状腺素（TSH ）除对靶腺体的经典作用外，对骨代谢的生理及病理也发挥着重要作用[2]。

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP-5b ）、骨钙素（BGP ）是骨代谢的生化指标，分别反映骨吸收和骨形成情况。

本研究通过对老年男性骨密度、TSH 、TRACP-5b 、BGP 水平的检测，旨在探讨正常水平的TSH 对老年男性骨代谢的影响及其影响机制。

1　材料和方法1.1　研究对象。

选取来我院体检中心健康体检的的150例老年男性（年龄≥60岁），通过询问病史，体格检查、实验室常规检查，排除甲状腺功能异常、患有或曾患有与骨代谢相关疾病，如肝肾疾病、内分泌疾病和代谢营养性骨病及肿瘤等，近三个月服用过影响骨代谢药物的患者。

1.2　方法1.2.1　骨密度测定：采用法国MEDILINK 公司生产的摘要：目的 探讨老年男性骨质疏松患者促甲状腺素（TSH ），骨密度及骨代谢指标的变化及其相关性。

方法选取来我院健康体检的150例老年男性，测定其左股骨颈骨密度（BMD ），血清促甲状腺素（TSH ）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离四碘甲状腺原氨酸（FT4）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP-5b ）、骨钙素（BGP ）水平。

根据骨质疏松症的诊断标准，将研究对象分为骨量正常组即正常对照组、骨量减少组、骨质疏松组。

文章编号：2095－6835（2022）12－0175－04邻近标记技术APEX2的发展与应用罗思，丁明（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京211198）摘要：工程抗坏血酸过氧化物酶（The Engineered Ascorbate Peroxidase，APEX2）是一种能够有效地应用于研究活细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。

与其他传统的蛋白质互作研究方法相比，APEX2技术不仅可以允许靶向和邻近依赖性标记蛋白质，并且实现了亚细胞室的蛋白质组学定位以及动态蛋白质复合物的识别，现已成为蛋白质组学分析的一种新方法。

主要总结了APEX2的技术发展及其在不同类型的蛋白质组的应用。

关键词：APEX；APEX2；生物素化；蛋白质相互作用中图分类号：Q816文献标志码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2022.12.053研究活细胞细胞器和亚细胞区域的蛋白质组有助于理解细胞中组织和蛋白质相互作用网络，因此兴起了许多方法。

基于邻近标记的方法结合质谱（MS）的蛋白质组的系统分析为研究蛋白质的相互作用提供了一种高通量的方法。

近年来，研究蛋白质相互作用的邻近依赖标记技术也取得了很大发展。

目前用于邻近标记技术的酶主要有3种：辣根过氧化物酶（HRP）、邻近依赖的生物素鉴定（BioID）和工程抗坏血酸过氧化物酶（APEX）。

虽然第一个基于生物素邻近标记的研究是利用HRP和芳基叠氮生物素做底物进行的[1]，但是HRP在哺乳动物细胞质中并不活跃。

在细胞质的还原环境中，HRP的4个二硫键和2个Ca2+离子结合位点会被破坏，不能稳定维持自身结构[2]。

这一缺陷限制了其在细胞内相互作用方面的使用，因此HRP逐渐退出蛋白质相互作用研究的舞台。

基于BioID的邻近标记采用了来自大肠杆菌的生物素连接酶BirA的突变形式，利用质谱检测BirA修饰生物素化蛋白，可以鉴定出与感兴趣蛋白相互作用的微弱或者短暂的蛋白质，目前这种技术已成功用于天然环境中相互作用伙伴的生化筛选[3-5]。

GPI锚定蛋白的研究进展摘要】糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI-APs）是一类通过自身羧基末端糖基-磷脂酰肌醇结构锚定在真核细胞膜表面但不穿过磷脂膜双层的蛋白质。

它们具有广泛的功能，涉及细胞识别、生长、分化和程序性死亡等重要的生命过程，并与许多疾病有一定的关系。

现在普遍认为，GPI-APs与膜上脂筏的连接在信号转导和其他功能方面具有重要意义。

本文就GPI-APs的生物特征及功能进行综述。

【关键词】GPI锚定蛋白；膜蛋白；信号传递；疾病检测【中图分类号】R379 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）19-0010-02糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphosphatidy-linositol-anchored protein，GPI-APs)是一类通过其羧基末端的GPI结构锚定于细胞膜表面而不跨越其磷脂双层结构的蛋白。

[1]在脊椎动物，真核生物，植物，软体动物，昆虫，血吸虫病，真菌和原生动物中发现了大量的GPI-AP[2]。

目前，GPI-AP主要用于细胞生物学，分子生物学及相关疾病的研究。

例如，IL-12基因与GPI信号肽序列的融合为初步制备肾癌疫苗奠定了基础[3]；B7-1和GPI-AP的剪接和相关细胞的融合可以促进T细胞的活化。

从而介导肿瘤细胞凋亡以达到治疗目的[4]。

GPI-APs还可锚定CD等细胞因子，促进T细胞活化，从而介导抗肿瘤[5]。

1.GPI-APs的分子结构GPI锚定蛋白的基因位于第19号染色体，基因跨度大于40kbp，包括18个内含子，17个外显子[6],全长蛋白约56kD，是一个与多种疾病相关的多功能蛋白。

GPI-APs广泛分布于各类生物体内，它含有大约20个氨基酸的组成的特殊C末端序列，该序列即为膜钩连接的标志，从而能将蛋白质锚定于细胞膜表面，但不跨越膜结构，从而不干涉细胞内信号传递[7]。

研究认为[8]，GPI-APs和其他脂化蛋白是与脂质相关联的，这些蛋白质大部分分布于细胞膜的脂筏上，可看作是膜相关的含脂双层脂筏域的蛋白质。

第38卷第2期2024年3月山东理工大学学报(自然科学版)Journal of Shandong University of Technology(Natural Science Edition)Vol.38No.2Mar.2024收稿日期:20230301基金项目:江苏省高校 青蓝工程 项目(2023);江苏省高职院校青年教师企业实践项目(2021QYSJ063);江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学)开放课题(SDGC2239)第一作者:谢钰珍,女,295842442@;通信作者:覃鸿妮,女,qinhn@文章编号:1672-6197(2024)02-0067-06基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株谢钰珍1,覃鸿妮1,2,吴凡1,孙曙光1,孟丽君3(1.苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院,江苏苏州215123;2.江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学),江苏苏州215000;3.苏州东岭生物技术有限公司,江苏苏州215123)摘要:利用CRISPR /Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD -L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP )序列,构建含有PD -L1-GFP 报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株㊂根据CRISPR -Cas9靶点设计原则,针对PD -L1基因终止密码子设计两对sgRNA ,退火形成双链后连接至Lenti -V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证㊂对于正确的Lenti -V2-sgRNA 重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率㊂根据靶点位置设计左同源臂+GFP +右同源臂序列合成Donor 片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证㊂将验证成功的Lenti -V2-sgRNA 和pUC19-donor -GFP 共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP 表达情况,菌落PCR 及基因测序验证GFP 报告基因的靶向插入效果㊂经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD -L1的Cas9载体Lenti -V2-gRNA 和含GFP 基因的Donor 质粒pUC19-donor -GFP 构建成功㊂两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察㊁多克隆验证㊁单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP 成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR 均检测到特异条带,表明在PD -L1终止密码子前成功插入了GFP 片段,细胞株构建成功㊂通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD -L1-GFP 报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD -L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂关键词:PD -L1;CRISPR /Cas9;报告基因;GFP 中图分类号:TB532.1;TB553文献标志码:AConstruction of HT29cell line with PD -L1-GFPreport gene by CRISPR /Cas9systemXIE Yuzhen 1,QIN Hongni 1,2,WU Fan 1,SUN Shuguang 1,MENG Lijun 3(1.School of Biotechnology,Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing,Suzhou 215123,China;2.Jiangsu Province Engineering Research Center of Precision Diagnostics and Therapeutics Development,Soochow University,Suzhou 215000,China;3.Suzhou Dongling Biotechnology Company Limited,Suzhou 215123,China)Abstract :Using CRISPR /Cas9and homologous recombination technology to tap green fluorescent protein (GFP)sequence at specific position of PD -L1gene,we constructed human colon cancer cell (HT29)㊀stable cell line containing PD-L1-GFP reporter gene.According to the design principle of CRISPR-Cas9target,two pairs of sgRNAs were designed for the stop codon of PD-L1gene.After annealing,the sgRNAs were connected to the Lenti-V2plasmid.The plasmid was extracted and verified by sequencing after amplification of the receptor cells.For the correct Lenti-V2-gRNA recombinant plasmid,the effi-ciency of gene editing was verified by T7E1digestion.According to the target location,Donor fragment was synthesized from left homologous arm+GFP+right homologous arm sequence,which was ligated to pUC19after double enzyme digestion.Plasmid extraction and sequencing were also performed after re-combinant vector transformation and amplification.HT29cells were co-transfected with Lenti-V2-gRNA and pUC19-donor-GFP,and the expression of GFP protein was detected by fluorescence microscopy. Finally,the targeted insertion effect of GFP reporter gene was verified by colony PCR and gene sequen-cing.The Cas9vector Lenti-V2-gRNA and Donor plasmid pUC19-donor-GFP containing PD-L1were successfully constructed by enzyme digestion and sequencing.After the two recombinant plasmids were transfected into HT29cells,the results of microscopic observation,polyclonal verification,monoclonal screening and identification showed that GFP was successfully transferred into HT29cells and expressed, and the monoclonal cells screened by limited dilution method had uniform fluorescence.Moreover,com-pared with the control group,specific bands were detected in the genomic PCR of the clones of positive cells,indicating that the GFP fragment was successfully inserted before the PD-L1stop codon,and the cell line was successfully constructed.HT29colon cancer cell line with stable expression of PD-L1-GFP reporter gene was successfully constructed by gene editing technology,and a system was established to di-rectly observe whether PD-L1is expressed and the degree of expression,which laid a foundation for sub-sequent in vitro and in vivo screening of upstream new targets and drugs regulating PD-L1. Keywords:PD-L1;CRISPR/Cas9;reporter gene;GFP㊀㊀PD1(programmed death-1,程序性死亡受体-1)为PDCD1基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达于活化的免疫细胞表面,如T细胞㊁B细胞㊁NK细胞以及单核细胞等㊂PD1是维持自身耐受性的重要因子,在生理条件下可通过TCR识别抗原,调节外周组织中T细胞的功能,从而应对和清除外源病菌及内源异常细胞㊂PD-L1(程序性死亡配体-1)也称CD274,是PD1的配体之一,是由CD274基因编码的一种细胞表面糖蛋白,多过度表达于肿瘤细胞表面[1]㊂作为重要的负性免疫调节因子,当T细胞表面PD1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-L1配体结合后,可向细胞内传递调控信号,抑制T细胞活化与增殖,从而帮助肿瘤细胞逃脱宿主的免疫监视,因此,抑制PD1/PD-L1通路或者通过特异性靶点抑制PD-L1蛋白的表达,可有效增强肿瘤治疗效果㊂近年来的临床研究结果显示,由PD1/PD-L1通路介导下的免疫抑制在非小细胞肺癌㊁胃癌㊁乳腺癌㊁大肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展中均具有重要作用,PD-L1在以上各种癌组织的表达明显升高,且PD-L1的阳性表达与肿瘤大小㊁转移情况㊁分化程度及远期生存率存在密切关系[2-3];此外,从诱导肿瘤细胞表面高表达PD-L1的相关因素来看,目前已报道的肿瘤细胞中调控PD-L1表达的相关信号通路主要有Akt3信号通路和MAPK信号通路㊁IFN-γ信号通路和AR信号通路[4],而且这些通路的某些抑制剂已被证明可调节PD-L1㊂例如:TGFβR-1抑制剂LY364947可明显降低TGFβR-1诱导的PD-L1mRNA和蛋白表达[5];突变转录因子FOXP3在PD-L1启动子区的结合位点后,胰腺癌细胞PD-L1的表达明显受到抑制[6];但关于结肠癌肿瘤细胞PD-L1表达的具体调控机制仍需进一步研究㊂CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑技术,通过sgRNA介导核酸酶Cas9对基因组特定位点进行识别㊁切割,从而实现基因编辑,操作相对简便,基因编辑效率高㊂本文利用CRISPR/Cas9技术,在PD-L1基因终止密码子之前插入绿色荧光蛋白GFP基因,通过构建稳定表达PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞株HT29,旨在建立一个可直观观察细胞上PD-L1是否表达以及表达强弱的系统,为进一步研究结肠癌细胞中PD-L1表达的可能调控机制提供帮助,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定基础㊂86山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀1㊀材料与方法1.1㊀材料HT29细胞和293T细胞(苏州东岭生物技术有限公司保存),Lenti CRISPR V2质粒载体和pUC19载体(苏州东岭生物技术有限公司),胶回收试剂盒(Thermo),Stbl3感受态大肠杆菌(TransGen Biotech),DMEM培养基和D10培养基(HYclone), T4连接酶(Takara公司),DNA聚合酶(NEB)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀sgRNA引物的设计与合成根据NCBI查询的PD-L1基因序列,使用CRISP在线设计工具(/E-CRISP/),根据靶点设计原则,在PD-L1基因终止密码子处设计sgRNA,并在序列正义链与反义链的5 端添加Esp3I(BsmBI)酶切位点,合成的具体序列如下:sgRNA-1:GAGGAGACGTAATCCAGCAT gRNA-1-F:CACCGAGGAGACGTAATCCAGCA gRNA-1-R:AAACATGCTGGATTACGTCTCCTC sgRNA-2:GTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-F:CACCGTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-R:AAACGATACACATTTGGAGGAGA为检测突变是否成功,设置了一对检测引物,扩增产物为包含sgRNA靶点的基因组DNA片段,检测引物具体序列如下:Test-F:TGGGGGACAAGCCATCCCAA Test-R:ATGATTTGCTTGGAGGCTCC1.2.2㊀LentiV2-gRNA重组质粒的构建及鉴定根据所设计序列合成单链sgRNA,经梯度降温PCR退火形成双链sgRNA㊂退火结束后,将得到的双链gRNA连接到已用Esp3I酶切回收后的线性Lenti-V2空载质粒中,连接产物转化Stbl3感受态细胞,37ħ培养过夜后挑取阳性单克隆进行测序验证,测序引物:LKO1-5(GACTATCATATGCTTAC-CGT)㊂针对序列正确的单克隆,提取其对应菌液中的质粒DNA,即可得到正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒㊂1.2.3㊀pUC19-Donor-GFP重组质粒的构建及鉴定设计左同源臂+GFP+右同源臂序列,序列两端添加酶切位点XbaI/BamHI,送公司合成Donor片段,将合成的Donor片段㊁pUC19分别用XhaI和BamHI双酶切后连接㊂取10μL连接产物转化至50μL Stbl3感受态大肠杆菌中,37ħ培养1h 后,均匀涂在含有Amp的LB平板上,过夜培养㊂次日挑取6个克隆于4mL含有Amp的LB培养基中, 37ħ培养16h㊂16h后取1mL菌液抽提质粒,并对质粒进行菌落PCR,判断选取的单克隆中是否含有目的片段㊂将验证正确的质粒送至测序,测序引物:M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC),测序正确后冻存菌种㊂1.2.4㊀细胞培养和细胞转染从-80ħ冰箱中取出冻存的HT29细胞,复苏结束后留2mol/L的细胞量在10cm培养皿中培养,隔天进行传代培养㊂培养至第4天时将HT29转移至24孔板中的2孔(一孔转染,一孔阴性对照),每孔0.5ˑ106细胞㊂转染前1~2h更换新鲜培养基(0.9mL/孔),按Lenti-V2-sgRNA(0.6μg)㊁Donor-GFP(0.4μg)㊁1mg/mL PEI(3μL)㊁DMEM(97μL)配制转染体系,室温孵育30min后,将混合液加入到1孔中,另一个孔无须加入,轻轻摇匀后放入培养箱培养(37ħ,5%CO2)㊂1.2.5㊀多克隆效果验证提取转染后的HT29细胞基因组DNA,利用在PD-L1基因组以及GFP上分别设计的上下游引物,对其进行PCR鉴定,以检测其中是否含有在PD-L1位点成功插入GFP片段的目的细胞㊂引物序列: PD-L1-F(TTCAAATTTATCATTTATCA),GFP-R (CCGGACACGCTGAACTTGTG),PCR体系:模板DNA10ng㊁PD-L1-F和GFP-R各1μL,2X PrimeSTAR HS DNA Polymerase MIX10μL,总体积20μL㊂PCR扩增程序:98ħ预变性20s,98ħ变性10s,55ħ退火5s,72ħ延伸35s,共30个循环,68ħ彻底延伸2min㊂扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析㊂1.2.6㊀单克隆细胞筛选转染72h后,观察细胞生长状况并计数,采用有限稀释法,用D10(10%的FBS+DMEM)按每200μL一个细胞稀释到96孔板中,培养24h 后,显微镜观察荧光及细胞状态,并做好标记㊂继续培养,当上一步标记的单克隆细胞密度达到80%后,消化并收集细胞,用基因组DNA抽提试剂盒提取基因组,作为检测引物(TestF㊁R)的扩增模板,最后将扩增产物送至公司测序,以检测PD-L1-GFP 报告基因是否插入成功㊂96第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株2㊀结果与分析2.1㊀Lenti -V2-gRNA 重组质粒构建结果重组质粒基因测序结果显示,在酶切位点之间插入的片段位置㊁方向以及序列与预期一致(图1),含有本实验所需要的两条sgRNA 序列,证明LentiV2-gRNA 重组质粒构建成功㊂2.2㊀两条sgRNA 切割效果验证结果为了验证所设计的两条sgRNA 的切割效果,将两种Lenti -V2-gRNA 重组质粒转入293T 细胞后提取基因组DNA,并对其进行T7E1酶切鉴定,结果显示1和2两种sgRNA 都能切下相应大小的条带(图2),证明Lenti -V2-sgR1和Lenti -V2-sgR2都具有切割效果,本实验随机使用其中1条,采用sgRNA2,即Lenti -V2-sgR2㊂图1㊀Lentiv2-gRNA重组质粒测序结果图2㊀T7E1酶切图2.3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒构建结果以挑选的6个单克隆为模板,经菌落PCR 均能扩增出目的片段(图3),说明菌落中含有目标质粒㊂将阳性质粒进一步送至金唯智测序,从图4可以看出,第一行的序列为测序结果,第二行的序列是所需的模板序列,序列比对完全正确,pUC19-Donor -GFP 质粒构建成功㊂2.4㊀Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 细胞转染结果㊀㊀将Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 转染至HT29细胞,72h 后荧光显微镜下观察细胞状态㊂由图5可知,培养72h后可观察到少量细胞表达绿注:1-6为随机挑取的6个单克隆,M 为DNA marker㊂图3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒转化质粒菌落PCR 结果色荧光,证明GFP 成功转入HT29并进行了表达㊂2.5㊀PD -L1-GFP 报告基因工程细胞株阳性单克隆筛选结果2.5.1㊀多克隆效果验证结果图6为多克隆PCR 鉴定结果,可以发现实验组在200bp 位置有目的条带,而对照组没有,证明GFP 插入到指定位点㊂2.5.2㊀单克隆细胞筛选结果为将上述验证的插入正确GFP 序列位点的细胞挑选出来,将多克隆细胞进行单克隆筛选,图7为荧光显微镜观察结果,可以看到细胞形成了单克隆并且具有均一的荧光,可以进行后续的验证㊂7山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀图4㊀pUC19-Donor重组质粒测序结果(a)细胞图(b)荧光图图5㊀HT29细胞荧光蛋白表达为验证上述挑选的单克隆中所需的序列存在,对其基因组PCR 之后送至金唯智测序,图8显示与正常HT29细胞基因组相比,敲入的实验组所挑的单克隆在终止密码子前插入了GFP 片段,证明细胞系构建成功㊂3㊀讨论PD1表达于活化的免疫细胞表面,如B淋巴细图6㊀多克隆验证琼脂糖凝胶电泳图图7㊀单克隆细胞荧光状态图胞㊁CD4+T 细胞等㊂PD -L1作为PD1的配体之一,在癌组织上可见异常高表达,如肾癌㊁肝癌㊁肺癌㊁乳腺癌及卵巢癌等;但在肿瘤邻近的正常组织中低水平表达,提示它参与肿瘤发生发展,并在削弱抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用㊂PD1/PD -L1是负性共刺激分子,当肿瘤细胞表面的PD -L1与免疫细胞表面的PD1结合时,可抑制免疫细胞的增殖与活性甚至诱导其凋亡,使癌细胞成功逃脱免疫杀伤㊂近年来,PD -L1及其受体PD1信号通路一直是肿瘤免疫领域的热门研究对象,针对阻断PD1/PD -L1通路的单克隆抗体已然成为了肿瘤免疫治疗的明星产品,目前FDA 已经批准了五种PD -L1抑制剂㊂作为非特异性免疫治疗产品,PD -L1抑制剂的抗癌效应具有广谱性,且在不同癌症疾病中显示出了很好的治疗[7-11],但由于治疗过程中的原发性和获得性耐药,相当大比例的患者无法从中受益㊂相较于单药疗法,近年来越来越多的研究正向着PD1/PD -L1耐药机制研究以及联合用药靶点的筛选上转移[12]㊂在一些研究报道中,针对不同类型免疫检查点的联合疗法已被证明对几种肿瘤有效㊂例如:采用抗PD -1抑制剂抗体㊁抗CD137激动剂抗体和疫苗治疗的三联疗法可以显著增强胰腺导管腺癌的治疗效果[13-14];联合anti -PD -L1和anti -TIGIT 在临床上对转移性NSCLC 患者非常有效[15];增强ITCH 活17第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株性可促进PD -L1泛素化降解从而降低肿瘤细胞PD -L1表达,化合物AK087与MAPK 抑制剂联用可明显增强MAPK 靶向治疗黑色素瘤的效果[16]等㊂但对于其他大部分肿瘤来说,不同疗法治疗过程中肿瘤表面PD -L1的表达量变化情况及产生治疗抗性的关键机制,仍需进一步研究㊂注:斜体为GFP 片段,下划线为PDL1终止密码子,WT 为正常HT29测序序列,Knock -in clone 为实验组测序序列㊂图8　对照组和实验组序列对比图㊀㊀为了探究结肠癌细胞表面PD -L1表达的更多可能调控机制,本研究利用CRISPR /Cas9系统和同源重组的原理,通过两次转染将GFP 荧光基团成功插入到PD -L1基因终止密码子之前,成功构建了PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株,通过荧光信号直观观察细胞上PD -L1是否表达以及表达的强弱程度,为进一步研究结肠癌细胞中PD -L1表达的可能调控机制提供了材料,并为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂参考文献:[1]谢丽叶,付杰军,卢奕,等.PD1/PD -L1激活促进癌症发生㊁发展和转移的研究进展[J].肿瘤防治研究,2017,44(6):423-427.[2]车章洪.PD -1/PD -L1通路在肿瘤的发生发展过程中对T 细胞的活化作用研究进展[J].中国新药杂志,2017,26(16):1913-1917.[3]方宇,王海娟,李征洋,等.PD -L1和A2aR 在大肠癌中的表达及意义[J].河北医药,2021,43(3):345-348,352.[4]丰江舟,杨梦梦,朱彬彬,等.人PD -L1基因启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建[J].皖南医学院学报,2016,35(6):524-526.[5]柯佳,李卓伟,李超,等.TGF -β1对结肠癌SW620细胞及其PD -L1表达的影响[C]//中国解剖学会.中国解剖学会2019年年会论文文摘汇编.昆明:解剖学杂志编辑部,2019:182.[6]王秀超.胰腺癌肿瘤细胞PD -L1表达调控机制及联合干预实验研究[D].天津:天津医科大学,2017.[7]李青丽,唐瑶,李富丽,等.抗PD -L1抗体抑制小鼠非小细胞肺癌移植瘤的生长及其机制[J].肿瘤,2020,40(8):531-540.[8]孙晨,镡云辉,耿波,等.PD -1/PD 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·方法技术学·Cardiac MR tissue tracking technique for quantitativelyevaluating myocardial strain of cardiacamyloidosis patientsHE　Jiangkai1， CUI　Chen1， MA　Wei2， WANG　Zhi2， LIU　Jia1， LI　Wei1，ZHAO　Kai1， NAI　Rile1， XU　Shasha1， QIU　Jianxing1*（1.Department of Radiology，2.Department of Cardiovascular， PekingUniversity First Hospital， Beijing 100034， China）［Abstract］Objective　To observe the feasibility of cardiac MR tissue tracking （CMR-TT）technique for quantitatively evaluating myocardial strain of patients with myocardial amyloidosis （CA）.Methods　Cardiac MRI were collected from20 patients of immunoglobulin amyloid light-chain CA （AL-CA，group A），20 cases of transthyretin CA （ATTR-CA，group B） and 20 healthy subjects （group C）， and myocardial strain parameters were obtained using CMR-TT technique.Left ventricular cardiac function parameters were compared among 3 groups， so were strain parameters of each myocardial segment of left ventricle and global myocardium，including 3D longitudinal strain （LS），3D radial strain （RS）and 3D circumferential strain （CS）.Results　Compared with those in group C，significant differences of left ventricular cardiac function parameters were found in both group A and B （all P＜0.01），while no statistical difference was found between group A and B （all P＞0.05）. Except for apical segment RS （P=0.81）， strain parameters in group A and B were both lower than those in group C （all P＜0.01）， while no significant difference was detected between group A and B （all P＞0.05）.Conclusion　CMR-TT technique could be used to quantitatively evaluate left ventricular myocardial strain of CApatients.［Keywords］myocardium； amyloidosis； magnetic resonance imaging； tissue tracking techniqueDOI：10.13929/j.issn.1672-8475.2024.01.009心脏MR组织追踪技术定量评估心肌淀粉样变性患者心肌应变何江凯1，崔晨1，马为2，王智2，刘佳1，李玮1，赵凯1，奈日乐1，徐莎莎1，邱建星1*（1.北京大学第一医院医学影像科，2.心血管内科，北京 100034）［摘要］目的　观察利用心脏MR组织追踪（CMR-TT）技术定量评估心肌淀粉样变性（CA）患者心肌应变的可行性。

LncRNA SNHG7通过调控β-catenin蛋白影响乳腺癌细胞的增值、迁移和侵袭张瑞华;劳伟思;许英;蔡栋昊;毕卓菲;段朝晖【摘要】目的探讨长链非编码RNA SNHG7(LncRNA SNHG7)在乳腺癌细胞系中的功能及其机制.方法 RT-qPCR检测LncRNA SNHG7在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系的表达水平,核浆分离实验检测LncRNA SNHG7在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的定位.在MDA-MB-231细胞系中,siRNA沉默LncRNA SNHG7后,利用MTS和平板克隆形成实验研究LncRNA SNHG7对细胞增殖的影响;利用划痕和transwell实验研究LncRNA SNHG7对细胞侵袭迁移的影响.通过Western blot(WB)实验研究LncRNA SNHG7在乳腺癌细胞系中可能参与的分子机制.结果qPCR结果显示,与癌旁组织相比,LncRNA SNHG7在乳腺癌组织中高表达(P<0.05);与乳腺正常上皮MCF-10A相比,LncRNA SNHG7在乳腺癌细胞系中高表达.siRNA沉默LncRNA SNHG7后,细胞增殖能力和平板克隆形成能力被抑制(P<0.05),划痕实验显示细胞的愈合能力降低(P<0.05),tran-swell实验显示细胞的迁移和侵袭能力均被抑制(P<0.05).WB结果显示β-catenin、C-Myc和Cy-clinD1蛋白的表达下调,磷酸化的β-catenin(p-β-catenin)蛋白降解增加.结论LncRNA SNHG7在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中高表达.沉默LncRNA SNHG7后,细胞的增殖和侵袭迁移能力均降低.WB结果表明LncRNA SNHG7调控乳腺癌细胞的增殖和侵袭迁移可能与β-catenin蛋白的表达下调和p-β-catenin蛋白降解增加有关.【期刊名称】《岭南现代临床外科》【年(卷),期】2019(019)001【总页数】6页(P28-33)【关键词】乳腺癌;LncRNASNHG7;增值;侵袭;β-catenin【作者】张瑞华;劳伟思;许英;蔡栋昊;毕卓菲;段朝晖【作者单位】中山大学孙逸仙纪念医院检验科,广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院检验科,广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院检验科,广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院检验科,广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院检验科,广州510120;中山大学孙逸仙纪念医院检验科,广州510120【正文语种】中文【中图分类】R737.9在女性新发癌症中，乳腺癌发病率占25%，死亡率占15%［1］。