蓝白斑筛选法

实验目的：本实验旨在通过蓝白斑筛选方法，筛选出含有重组质粒的大肠杆菌克隆，并验证重组质粒的插入是否成功。

实验原理：蓝白斑筛选是基因工程中常用的一种重组子筛选方法。

该方法的原理基于大肠杆菌的乳糖操纵子结构中的-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控。

当外源DNA插入到质粒的多克隆位点（MCS）后，如果插入的DNA片段较大，会破坏lacZ基因的编码序列，导致无法形成完整的-半乳糖苷酶。

在没有-半乳糖苷酶的情况下，培养基中的X-gal底物不会被降解，菌落呈现蓝色。

而当插入的DNA片段较小或没有插入DNA时，宿主细胞和质粒中的lacZ基因可以实现互补，产生具有活性的-半乳糖苷酶，降解X-gal底物，菌落呈现白色。

实验材料：1. 大肠杆菌菌株：DH5α2. 载体质粒：pUC193. 目的基因片段4. DNA连接酶5. 转化试剂6. LB培养基7. LB琼脂平板8. X-gal底物9. IPTG诱导剂10. 紫外线灯实验步骤：1. 将目的基因片段与载体质粒进行连接反应。

2. 将连接产物转化到DH5α菌株中。

3. 在含有X-gal底物和IPTG的LB琼脂平板上接种转化菌。

4. 置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

5. 观察菌落颜色，筛选出白色菌落。

实验结果：在LB琼脂平板上，观察到白色菌落和蓝色菌落。

经过多次筛选，最终获得了一组白色菌落。

结果分析：1. 白色菌落的形成说明外源DNA已成功插入到载体质粒的多克隆位点，破坏了lacZ基因的编码序列，导致无法形成完整的-半乳糖苷酶。

2. 蓝色菌落可能是由于以下原因造成的：a. 外源DNA插入位点选择不当，导致lacZ基因仍然具有活性。

b. 转化过程中，部分菌落未成功转化。

c. 转化菌落中存在自发突变，导致lacZ基因恢复活性。

结论：本实验通过蓝白斑筛选方法，成功筛选出含有重组质粒的大肠杆菌克隆。

实验结果表明，外源DNA已成功插入到载体质粒的多克隆位点，破坏了lacZ基因的编码序列，导致无法形成完整的-半乳糖苷酶。

简述蓝白斑筛选原理蓝白斑筛选（Blue-WhiteScreening）是一种分子生物学方法，它用于鉴定具有特定基因的细菌株。

蓝白斑筛选的最初想法是从一种确定的细菌介质中检测特定基因的存在，该介质受到结合的载体（如DNA或细菌DNA的封闭抗体）的支配。

其基本原理是将细菌介质中的细菌冲洗悬浮，并加入一种特定的抗性素（例如培养基中的抗生素），使得只有携带具有抗性基因的细菌才能生存，而未携带这样基因的细菌死亡。

这种方法可以快速准确地检测出细菌株中具有抗性基因的细菌株，而无需耗费大量的时间进行实验。

蓝白斑筛选的过程主要包括四个步骤：（1）细菌介质中的细菌悬浮被加入到一种细胞毒性物质（如抗生素）中；（2）悬浮物经过一定时间和条件后，只有携带具有抗毒性基因的细菌存活，没有携带这样基因的细菌死亡；（3）将抗毒性素从细菌介质中洗掉；（4）通过比较死亡和存活的细菌，从而可以将具有特定抗毒性基因的细菌株辨别出来。

在蓝白斑筛选的实验中，抗毒性素可以是任何特定的化合物，例如抗生素，甲基红，乙醛等。

从抗毒性素的效果来看，它不能完全消灭整个细菌群，而是将这些细菌分为两组：一组是抗毒性素不易受到影响的细菌，即携带有特定抗毒性基因的细菌；另一组是抗毒性素很容易受到影响的细菌，即没有携带特定抗毒性基因的细菌。

然后，洗掉抗毒性素后，可以通过观察实验中死亡和存活的细菌，从而将那些携带特定抗毒性基因的细菌株辨别出来。

蓝白斑筛选法的优点在于它比其他基因组学技术更加快速，也比其他基因筛选方法更加简单，可以在不到一个月的时间内，快速准确地检测出携带特定基因的细菌株。

另外，由于它只需要很少的实验操作，因此可以大大节省实验时间和成本。

但是，蓝白斑筛选也有一些缺点，其中最重要的是，它只可以检测携带一个特定基因的细菌株，而无法检测其余的基因。

其次，对抗毒性的效果也不一定非常稳定，在抗毒性素的浓度较低的情况下，有时会出现抗毒性不足的情况。

总的来说，蓝白斑筛选是一种简单有效的基因筛选方法，它可以有效地检测携带特定基因的细菌株，从而节约大量的实验时间和成本。

蓝白斑法筛选
取分离纯化后的菌株斜面，分别接种到限磷和过磷的葡萄糖-MOPS 培养基平板中,28℃培养36h-48h，观测蓝白斑的生长情况。

同时在两种培养基上都产
生蓝斑的菌落初步定为聚磷菌。

苏丹黑染色法
将在限磷和过磷葡萄糖-MOPS 培养基上都产生蓝斑的菌株,接种到驯化培养
基上,厌氧培养16h。

取干净载玻片上一个,滴一滴无菌水,挑取细菌涂于水滴,固
定,用3%的苏丹黑乙醇染IOmin,用水冲去染液后再用滤纸将残水吸干。

用二甲苯
冲洗涂片至无色素洗脱,再用质量浓度为0.5%的番红水溶液复染1 至2min,用水
冲洗，吸干,备油镜镜检。

蓝白斑法筛选
将经过分离出的单菌株，接种在过磷葡萄糖-MOPS 培养基平板和限磷葡萄糖-MOPS 培养基平板上，在28℃下培养36-48h，注意观察蓝白斑的生长状况，最后在过磷和限磷培养基上都有蓝斑产生的菌株，可以初步定为有聚磷能力的菌株。

PHB染色法
经过蓝白斑法的筛选，将筛选出的菌株，接种到驯化培养基上，28℃厌氧培养16h。

接着，取洁净的载玻片，在载玻片上滴一滴无菌水，挑取一株菌落涂布在无菌水上，风干固定，用配置好的苏丹黑染液染色10min，用清水缓慢冲去染液后，用二甲苯洗脱涂片直至无色素被冲洗下来，最后用番红水溶液复染3min，清水缓慢冲洗，风干，油镜镜检。

1.取目的基因DNA10ul，加入到100ul的感受态细胞中，轻轻混匀，并置于冰上放置30min。

2.将感受态细胞于42 ℃水浴中热休克90s后迅速置于冰上放置2min。

3.加入800ulLB液体培养基（-AMP），37 ℃，200r/min摇菌液60min。

4.将摇菌后的转化菌液3000rpm离心3min，吸取LB液体上清液700ul弃除，留200ul液体在离心管内，轻轻吹打沉淀，然后取每组连接反应转化原液取200μl+40ul X-gal溶液+4ulIPTG溶液混匀，用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。

5.倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

放于4℃数小时,使显色完全。

6.用无菌枪头挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。

1.取目的基因DNA10ul，加入到100ul的感受态细胞中，轻轻混匀，并置于冰上放置30min。

2.将感受态细胞于42 ℃水浴中热休克90s后迅速置于冰上放置2min。

3.加入800ulLB液体培养基（-AMP），37 ℃，200r/min摇菌液60min。

4.将摇菌后的转化菌液3000rpm离心3min，吸取LB液体上清液700ul弃除，留200ul液体在离心管内，轻轻吹打沉淀，然后取每组连接反应转化原液取200μl+40ul X-gal溶液+4ulIPTG溶液混匀，用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。

5.倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

放于4℃数小时,使显色完全。

6.用无菌枪头挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml的5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。

蓝白斑筛选名词解释蓝白斑筛选（blue-white selection）是一种用来筛选融合过表达的目的基因的方法。

它在分子生物学研究中被广泛应用于筛选携带特定基因型的细胞克隆。

蓝白斑筛选的基本原理是利用一种称为β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的酶来区分含有目的基因的细胞克隆和不含有目的基因的细胞克隆。

β-半乳糖苷酶是一种能够水解乳糖和其类似物的酶，在无添加基因座的细胞中存在着，而在添加了基因座的细胞中则不存在。

在蓝白斑筛选中，一般会将目的基因与与β-半乳糖苷酶基因lacZ连在一起，形成一个连锁或位点插入建构。

当该建构被转入宿主细胞中后，如果目的基因被激活或表达，那么lacZ基因也会被转录和翻译形成β-半乳糖苷酶。

而在加入X-半乳糖（一种受β-半乳糖苷酶水解的物质）后，带有lacZ基因的细胞会产生蓝色的反应物，形成蓝斑。

因此，只有带有目的基因的细胞才会出现蓝斑。

通过蓝白斑筛选，研究人员可以快速、高效地筛选出携带目的基因的细胞克隆。

这种方法的应用范围很广，包括但不限于以下几个方面：1. 基因克隆：蓝白斑筛选能够帮助研究人员快速鉴定克隆中是否含有目的基因，并确定目的基因的定位以及克隆的纯度。

2. 蛋白质表达：通过蓝白斑筛选，可以筛选出表达目的蛋白的细胞克隆，从而方便研究人员进行蛋白质的表达和纯化。

3. 基因表达调控：蓝白斑筛选可以帮助研究人员研究目的基因的表达调控机制，以及筛选出调控因子。

4. 化学物质筛选：通过蓝白斑筛选，研究人员可以筛选出具有特定功能的化学物质，从而研究其对细胞生物学过程的影响。

总之，蓝白斑筛选是一种重要的遗传工程技术，通过利用β-半乳糖苷酶对含有目的基因的细胞进行筛选，为基因克隆、蛋白质表达、基因表达调控等多个领域提供了高效、可靠的方法。

蓝白斑筛选原理
蓝白斑筛选是一种常用的分子生物学技术，用于筛选携带特定基因的细菌克隆。

该技术基于质粒上插入的目的基因与筛选标记基因之间的相互作用。

通常，筛选标记基因在质粒中与目的基因连在一起，形成一个复合基因，使细菌具备了特定的性状。

在蓝白斑筛选中，常用的筛选标记基因是β-galactosidase。

β-galactosidase是一种酶，能够将导致细菌产生蓝色染色的X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside）底物水解为无色产物。

在蓝白斑筛选中，质粒中的复合基因突变后，丧失了β-galactosidase的功能。

当细菌菌落生长于含有X-gal
的琼脂培养基上时，只有质粒中含有复合基因的细菌形成蓝色斑块，而质粒中突变的细菌形成白色斑块。

通过观察菌落的颜色，可以判断细菌是否携带了目的基因并成功插入质粒中。

蓝色斑块表示细菌携带了复合基因，而白色斑块表示细菌未携带复合基因。

通过这种方法，可以筛选出想要的细菌克隆，进一步研究目的基因的功能和表达。

蓝白斑筛选原理(入门级)蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。

野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。

有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。

设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。

这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。

用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。

MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。

虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。

操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。

以上是携带空载体的菌株产生的表型。

当外源DNA（即目的片断）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。

实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。

含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。

蓝白斑筛选法
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的细菌重组子的筛选方法。

其原理是利用野生型埃希氏大肠杆菌（E.Coli）产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。

5-溴-4-靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化。

在经人工插入外源基因后，突变型大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。

蓝白斑筛选在指示培养基上，未转化质粒的菌落因无抗生素抗性而不能生长，重组质粒的菌落是白色的，非重组质粒的菌落是蓝色的，以颜色不同为依据直接筛选重组克隆的方法。

这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

如需更多关于“蓝白斑筛选法”的相关信息，建议查阅基因工程学相关书籍。

蓝白斑挑选的原理及方法载体 pGEMZ在β-半乳糖苷酶（ lacZ）的α-肽编码区内拥有多克隆地区。

在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上经过颜色挑选鉴识。

不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附带体上缺失去lacZM15 基因，致使内源α-肽失活。

载体 pGEMZ或其余含 lacZ基因的α-肽互补细菌，拥有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal 转变为有颜色的产物，获得蓝色菌落。

在载体pGEMZ的多克隆地区，克隆上插入片段致使α-肽编码区的损坏，使β-半乳糖苷酶失活，获得白色菌落。

α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶不过部分失活。

重组质粒转变到适合的菌株中（ JM109， DH5α），而后涂布到含 , 40ug/mlX-Gal指示平板上。

可将 50ul 的 X-Gal和 100 ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在 37oC 保温 30 分钟使液体扩散。

IPTG溶于水中，贮液浓度为 100mM ，X- Gal溶于 DMF，贮液浓度为 50mg/ml 。

IPTG和 X- Gal需分装后保留在 -20 oC，可保留 2-4 个月。

◆IPTG即 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，也称 Isopropyl β-D-thiogalactoside，中文名为异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷。

分子式为 C9H18O5S ，分子量为， CAS Number 367-93-1，Ultra Pure， dioxane free，纯度 >%。

我企业提供 Merck 企业该产品。

◆本产品为靠近白色的粉末常用分子生物学试剂，常用于蓝白斑挑选及 IPTG引诱的细菌内的蛋白表达等。

IPTG是β–半乳糖苷酶的活性引诱物质。

鉴于这个特征，当 pUC系列的载体 DNA（或其余带有 lacZ 基因载体 DNA）以 lacZ 缺失细胞为宿主进行转变时、或用 M13 噬菌体的载体 DNA 进行转染时，假如在平板培育基中加入 X–Gal 和 IPTG，因为β–半乳糖苷酶的α–互补性，能够依据能否体现白色菌落 (或噬菌斑 )而方便地精选出基因重组体。