替代弗氏佐剂的新选择——QuickAntibody系列免疫佐剂

β-葡萄糖苷酶抗体的制备及比较分析余厚美;张振文【摘要】β-葡萄糖苷酶是一种广泛存在于自然界的水解酶,其含量高低直接关系到水解产物的量.木薯含有大量的生氰糖苷,是β-葡萄糖苷酶的底物之一,被水解后将产生有毒的氰化物,给食品安全带来隐患.为保障食品安全,给木薯及其制品的氰化物含量提供快速检测技术.本研究以A,B,C3种来源的β-葡萄糖苷酶为抗原免疫Balb/C小鼠,并制备单克隆抗体和做出初步评价.结果表明,A抗原免疫的小鼠融合后获得5株杂交瘤细胞株,效价均达到105以上,抗体亚型均为IgG1型,但单克隆抗体与B抗原、C抗原、KLH、BSA均无交叉反应.说明不同来源的β-葡萄糖苷酶免疫小鼠得到的抗体均为特异性抗体.【期刊名称】《热带生物学报》【年(卷),期】2019(010)001【总页数】5页(P89-93)【关键词】β-葡萄糖苷酶;抗体;抗体制备【作者】余厚美;张振文【作者单位】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/国家薯类加工技术研发分中心/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室,海南儋州571737;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/国家薯类加工技术研发分中心/农业部木薯种质资源保护与利用重点实验室,海南儋州571737【正文语种】中文【中图分类】Q-331β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase，EC3.2.1.21)是一种水解酶，也叫β-D-葡萄糖苷水解酶、龙胆二糖酶[1]，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基[2]，相对分子质量一般在40×103～250×103之间。

1837 年， LIEBIG和 WOHLER首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶，其广泛存在于许多古细菌、细菌、真菌、酵母、曲霉、昆虫、动物和植物中[3-5]。

不同来源的β-葡萄糖苷酶的相对分子质量差异较大，这是由其结构和组成的不同导致的。

由于参与生物体的糖代谢，β-葡萄糖苷酶对维持生物体的正常生理功能有着重要作用[2]，已经在哺乳动物的疾病防治和人类的癌症治疗方面广泛开展了应用研究[2,6]；此外，β-葡萄糖苷酶还能将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质，协助纤维素酶降解纤维素等功能[1-2,7-8]，在饲料工业、生物合成和生物燃料等领域，β-葡萄糖苷酶同样有巨大的应用价值[4,9]。

疫苗中铝佐剂的研究进展佐剂，也称为免疫调节剂或免疫增强剂，是疫苗的一种添加剂。

佐剂属于非特异性免疫增强剂，可以增强或改变对抗原的免疫反应类型。

佐剂不仅可以帮助抗原在体内诱导长期有效的特异性免疫反应，从而实现更高的疫苗效力，延长免疫反应的保护时间，还可以减少抗原的使用量、生产成本和免疫次数。

根据其化学性质，佐剂大致可分为以下几类：无机佐剂如含铝佐剂；乳液型佐剂如MF59和AS03；水溶性佐剂如皂苷；靶向模式识别受体的佐剂如CpG；和细胞生成佐剂，如白细胞介素。

佐剂与抗原的结合可以增加抗原的表面积，其生物学效应主要包括：（1）抗原库效应；（2）细胞因子和趋化因子表达的上调，免疫细胞在注射部位的募集；（3）炎症小体的激活；以及（4）载体效应。

一方面，在佐剂作用下，抗原更有可能被抗原递呈细胞有效处理和呈递；另一方面，佐剂可以改变抗原的物理性质，从而导致抗原在体内的释放减慢，并延长抗原与免疫细胞之间的相互作用时间。

目前，已有数百种天然或合成化合物用于佐剂的研究，但批准用于疫苗的佐剂数量仍然有限。

氢氧化铝（AH）和磷酸铝（AP）仍然主导着人类疫苗制剂的佐剂领域。

然而，尽管含铝佐剂在增强疫苗免疫反应方面已经应用了近几十年，但含铝佐剂的作用分子机制仍未完全了解。

因此，有必要加深我们对这些佐剂的物理、化学和生物特性的理解，为在临床开发阶段尽早确定每种佐剂的质量属性和选择合适的佐剂类型提供理论依据。

铝佐剂的种类目前，获得许可的人类疫苗中包括的两种主要类型的铝佐剂是氢氧化铝和磷酸铝。

疫苗制剂中AH佐剂与AP佐剂的选择在很大程度上取决于抗原的性质和吸附以实现最佳免疫反应的要求。

氢氧化铝佐剂是通过在精心控制的条件下向铝离子溶液中加入氢氧化钠来制备的。

温度、浓度和混合速度是影响所生产佐剂物理化学性质的因素。

电子显微镜显示AH佐剂由形成松散微粒聚集体的纳米颗粒纤维组成。

磷酸铝佐剂是通过在磷酸盐存在下在碱性条件下沉淀铝离子来制备的。

免疫佐剂的作用和发展佐剂（Adjuvants）是先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质，又称免疫佐剂或抗原佐剂。

佐剂可选择性地改变免疫应答的类型，产生体液和\或细胞免疫。

改变体液抗体的种类IgG亚类和抗体的亲和性。

佐剂可改变抗原的构型，使疫苗诱导T辅助细胞和细胞毒T淋巴细胞(CHL)反应。

佐剂可改变免疫反应为MHCⅠ型或MHC Ⅱ型。

佐剂还能改变T辅助细胞(Th1和Th2)的免疫反应。

随着生物技术的发展，新一代疫苗，如合成肽疫苗、基因工程疫苗等的研究已取得了初步成果，但现代疫苗研究过程所遇到的一个关键问题是其免疫原性较弱，往往需要佐剂来克服。

对适合于推广应用的新疫苗的研制，佐剂的研究显得至关重要。

因此，近年来免疫佐剂的研究进展更为迅速。

本文就各种免疫佐剂的研究现状和应用前景进行简要的讨论。

1 矿物质矿物质佐剂是传统佐剂中的一类，包括AL(OH)3和磷酸铝等。

1926年Glenny首先应用铝盐吸附白喉类毒素，至今已有70多年了，但它还是唯一被FDA批准用于人用疫苗的佐剂。

常用佐剂中效果较好的是AL(OH)3和磷酸铝佐剂，其次磷酸钙较常用。

铝佐剂主要诱导体液免疫应答,抗体以IgG1类为主,刺激产生Th2型反应，还可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平,也比较安全,对于胞外繁殖的细菌及寄生虫抗原是良好的疫苗佐剂。

它虽是人医和兽医均获批准的佐剂，广泛应用于兽医疫苗，特别是各种细菌苗，但其仍存在缺点：如有轻度局部反应，可以形成肉芽肿，极个别发生局部无菌性脓肿；铝胶疫苗怕冻；可能对神经系统有影响；不能明显地诱导细胞介导的免疫应答。

疫苗中加入磷酸三钙[Ca3(PO4)2]作佐剂，与铝胶一样具有吸附沉淀作用，但使用更加简便。

其缺点是：含盐量高；贮存日久有结晶沉淀。

皮下注射时偶有肿胀或结块,抗原免疫原性弱时,不足以提高其免疫原性,特别是保护性免疫机制要求活性介导的免疫参加时,应使用其他佐剂。

免疫佐剂的作用和发展免疫佐剂（Adjuvant）是指能够增强疫苗免疫效果的物质。

传统意义上的疫苗通常是由抗原构成，而免疫佐剂则用于改善疫苗的免疫原性以及增强免疫反应。

在免疫系统中，免疫佐剂通过激活免疫细胞、增强抗原呈递以及改善免疫记忆等方式来增强免疫效果。

1.增强免疫响应：免疫佐剂可以通过激活免疫细胞，如单核细胞、树突细胞等，促使它们产生更多的细胞因子，增强免疫反应，从而提高疫苗的效果。

2.增加抗原排斥：免疫佐剂可以改善疫苗抗原的呈递能力，提高免疫系统对抗原的感知，从而增强免疫细胞对抗原的处理和反应能力。

3.改善免疫记忆：免疫佐剂可以促进免疫记忆的形成，使得免疫系统对于相同抗原的记忆反应更为迅速和强烈，从而提高抗体和细胞免疫的持久性。

第一阶段是使用无机盐类作为免疫佐剂，如氢氧化铝、氢氧化铝磷灰石等。

这些无机盐类佐剂主要通过形成沉淀、吸附或者离解，来改善抗原的呈递，增强免疫应答。

这些免疫佐剂被广泛应用于多种疫苗中，如百白破、流感等疫苗。

第二阶段是进一步研发了更加有效的佐剂，如MF59（油剂）、AS03（油剂）以及QS-21等佐剂。

这些佐剂主要通过改善抗原的呈递和激活免疫细胞，来增强免疫应答。

例如，MF59是一种油剂，能够激活树突细胞、促使炎症反应，从而增强免疫效果。

第三阶段是利用分子生物学和基因工程技术来研发更加高效、安全的免疫佐剂，如脂质体、抗原保持剂和分子佐剂。

这些佐剂主要通过模拟病原体信号，激活免疫细胞，如树突细胞和飞翼细胞，促进免疫应答。

例如，脂质体被广泛应用于疫苗中，可以通过有效抗原表达和递呈来增强免疫效果。

未来的发展方向包括：1.个性化佐剂：根据个体差异，采用定制化的免疫佐剂，以提高疫苗的接种效果和安全性。

2.紧急响应佐剂：针对突发疫情，开发出能够快速产生免疫应答的佐剂，以便迅速应对疫情并控制传播。

3.基因表达佐剂：利用基因工程技术，将免疫佐剂与特定抗原基因组合表达，从而实现一揽子疫苗的生产。

免疫佐剂是一种辅助免疫系统产生免疫应答的物质，它可以增强疫苗的免疫效果或加强被动免疫。

免疫佐剂的类型多种多样，下面将详细介绍几种常见的免疫佐剂。

1. 佐剂蛋白：佐剂蛋白是一种与疫苗一起使用的蛋白质，它能够激活免疫系统并增强免疫应答。

其中最常用的佐剂蛋白是沙门氏菌外膜蛋白（OMP），它能够增加疫苗的免疫原性并提高抗体水平。

此外，还有革兰氏阴性菌的脂多糖，也是一种常见的佐剂蛋白，它可以刺激免疫系统产生更多的抗体。

2. 短肽佐剂：短肽佐剂是由多个氨基酸组成的简化蛋白结构，它可以模拟疫苗中的抗原部分，从而引发免疫系统的应答。

短肽佐剂可以增强免疫细胞的活性和记忆效应，提高疫苗的免疫原性。

目前，已经有一些疫苗采用了短肽佐剂来增强免疫效果。

3. 脂质佐剂：脂质佐剂是一种由脂质构成的免疫佐剂，它能够促进疫苗在体内的传递和吸收。

脂质佐剂可以形成微粒或液晶结构，将疫苗包裹在其中，从而提高疫苗的稳定性和抗原性。

此外，脂质佐剂还可以刺激免疫系统产生更多的抗体，并加强细胞介导的免疫应答。

4. 细胞佐剂：细胞佐剂是一种通过改变免疫细胞的功能来增强免疫应答的佐剂。

细胞佐剂可以活化树突状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞，从而增强它们对抗原的处理和呈递能力。

常见的细胞佐剂有类脂体、病毒载体等，它们能够激活免疫系统并提高疫苗的免疫原性。

5. 辅助佐剂：辅助佐剂是一种通过改变免疫应答的环境来增强免疫效果的佐剂。

辅助佐剂可以改变炎症反应、调节细胞因子水平等，从而优化免疫应答的方向和强度。

常见的辅助佐剂有铝盐和水合氢氧化铝等，它们能够增强疫苗的免疫效果，并延长免疫应答的持续时间。

总结起来，免疫佐剂的类型包括佐剂蛋白、短肽佐剂、脂质佐剂、细胞佐剂和辅助佐剂等。

这些免疫佐剂可以增强疫苗的免疫效果，提高抗体水平和免疫细胞的活性，从而增强人体对病原体的防御能力。

在疫苗研发和免疫治疗中，选择适合的免疫佐剂是非常重要的，它可以帮助提高疫苗的效力，保护人类免受疾病侵袭。

小鼠免疫程序admin一、抗原的准备1、收到抗原时，首先要了解抗原的种类、性质和浓度，以便采取不同的处理方法。

2、多肽抗原，一般分多肽—偶联KLH和多肽—偶联BSA（或GGG）或裸多肽三种。

多肽—偶联KLH一般用于免疫，而多肽—偶联BSA或裸肽一般用于检测，在免疫时注意区分使用。

3、分装（1）收到抗原后，应及时按免疫需要分装，避免反复冻融。

（2）如抗原是大肠杆菌重组蛋白，可能存在不溶性沉淀，分装前，应用超声粉碎仪粉碎，要注意，在冰浴中进行，超声强度应以溶液不产生泡沫的水平为准，超声强度过大，易产生泡沫导致蛋白变性，超声强度太低效果不佳，每次2-3秒，重复3-4次，超声完毕立即分装。

（3）分装管应用不粘附蛋白的样品管，要用二种不同颜色的标签明确区分免疫用抗原和检测用抗原，并写明分装日期，抗原名，浓度和剂量。

A 免疫用抗原：一般50ug/每只小鼠×5只=250ug/1个分装管，备做首次免疫用。

另分装2个100ug/1管，备做融合前加强免疫用，再分装25ug/只/×5=125ug/1个分装管，共分装4-5管，备加强免疫用。

B 检测用抗原：100ug/每管，分装共3管。

C 分装好的抗原除马上免疫用管外，其余均装入小塑料袋中，写好抗原名标签，马上存入-700C。

剩余抗原交保管员存-700C，并填好交接班表格。

二、免疫程序1、多肽类抗原（包括MAP型多肽），第一次用福氏完全佐剂，每只50-100ug ,腹腔注射，总剂量0.5ml/只，第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为25-50ug/0.5ml/只，间隔3周，第三次注射后10天测血（ELISA法），如滴度未达到1:104, OD1.0以上，则继续免疫，如ELISA已达滴度，则可取血清送WB或ICC检测。

2、蛋白类抗原：所用抗原的剂量等与多肽类相同，但进程有差异，首次免疫21天后，第二次免疫后，每次间隔为10天。

三、抗原的乳化抗原乳化前，应检查抗原管有否颗粒状沉淀，如有沉淀，应超声粉碎后，立即溶解在0.01M PH7.2 PBS中（PBS应为无菌液），每只小鼠腹腔注射总量0.5ml，用2-5ml注射器，取1.25ml含抗原的PBS，另一支注射器取（等体积）福氏完全佐剂或不完全佐剂，用不锈钢连接接头连接，反复推拉混合约10-30分钟，平放静置30分钟，如水乳相不再分离，即可注射小鼠。

单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。

抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。

上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。

PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。

2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。

3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。

二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。

（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。

拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。

无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。

将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min 离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。

然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。

（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。

用酒精棉球擦拭腹膜消毒。

用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。

100Chinese Veterinary Public Health Association，CAA V兽用疫苗常用免疫佐剂的概况和发展趋势李茂1，刘天强1，肖丹1，史子学2（1.通威股份有限公司动物保健研究所，成都 610041；2.中国农科院上海兽医研究所，上海200241)摘要：免疫佐剂也称佐剂或抗原佐剂，是一类单独使用时一般无免疫原性，但与抗原物质合并使用时能增强抗原物质免疫原性，增强机体免疫应答，或改变机体免疫应答类型的物质。

佐剂种类很多，如铝盐佐剂、油乳佐剂、微生物佐剂、中草药类佐剂、细胞因子、化学合成类和其他佐剂等。

本文介绍了各种佐剂的研究应用概况，以期为开发研制高效、低毒和结构新颖的免疫佐剂提供参考。

关键词：免疫佐剂；免疫应答THE PROGRESS AND DEVELOPMENT TREND OF THE COMMONLY USED IMMUNE ADJUVANT IN VETERINARY VACCINESLI Mao1，LIU Tian-qiang1，XIAO Dan1，SHI Zi-xue2（1.Animal Health Research Institute of Tongwei Co.,LTD,Chengdu 610041，China；2.Shanghai VeterinaryResearch Institute, CAAS, Shanghai 200241, China）Abstract: Immune adjuvant，also known as adjuvant or antigen adjuvant, immunogenicity generally alone,but when combine with antigenic material can enhance the antigen substance immunogenicity ,enhance immune response, or alter the immune response type substances. Many different types of adjuvant, such as aluminum adjuvant, oil emulsion adjuvant, Chinese herbal medicine,cytokines,chemical synthesis and other adjuvants. This article describes the research and application of a variety of adjuvants,in order to provide a reference for the development of efficient, low toxicity and structure of the novel adjuvants.Key words: Immune adjuvant; Immune response1 非油乳佐剂1.1 铝盐佐剂铝盐佐剂是传统佐剂中的一类，包括氢氧化铝胶和磷酸铝等，一直广泛用于人用和兽用疫苗的制备。