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姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
核酶的发现与应用一、核酶的发现1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。
20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。
1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。
1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度镁离子存在下，与留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶相同的催化活性。
1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。
1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。
二、核酶的应用（一）应用于生命起源的研究体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA 剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。
（二）在医学领域中的应用1、通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。
2、免疫源性低，很少引起免疫反应。
3、针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
4、用于RNA的修复，核酶、反义核酸和小分子RNA（snRNA）是RNA修复的常用工具。
核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接。
经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子。
5、核酶抗肝炎病毒的研究：目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。
质粒中hdvr序列
质粒中hdvr序列是指存在于质粒中的丁型肝炎病毒（HDV）的核糖核酸（RNA）序列。
HDV是一种缺陷性RNA病毒，它的感染和病毒颗粒的形成需要依赖于乙型肝炎病毒（HBV）或其他嗜肝性病毒。
在中国，HBV感染是一个普遍的问题，而HDV的重叠感染被认为是乙型肝炎重症化的重要因素之一。
因此，早期明确HDV感染并及时给予临床干预对防止重症肝炎的发生具有重要意义。
为了提高HDV的筛查和检测水平，建立了基于ddPCR方法的HDV RNA精准检测技术，并将其与ELISA检测抗-HDV IgG/IgM方法相结合，对乙肝相关肝病患者进行HDV感染率分析。
质粒中hdvr序列对于HDV的检测和研究具有重要作用，有助于深入了解HDV的感染机制，为HDV的预防和治疗提供了新的思路。
e11-2 发夹状核酶、HDV核酶和GlmS核开关核酶发夹状核酶切割活性所需的最小长度为50个nt，其中15个nt是不变的。
如图e11-2(1)所示，其二级结构由4个螺旋区构成茎（茎A~D）和数个内部环组成。
螺旋A和D的主要功能是与靶序列结合，决定核酶切割部位的特异性。
螺旋C配对碱基及其3′-端的未配对碱基均为切割活性所必需。
图e11-2(1) 发夹状核酶的二级结构与三级结构三级结构分为两个结构域，一个结构域由螺旋A和D以及之间的内部环组成，含有底物和底物识别位点，另一个结构域由螺旋B和C以及之间的内部环组成，含有主要的催化位点A38 。
这两个结构域堆积在一起，形成类似发夹的结构。
这类核酶所催化的反应的基本步骤与锤头状核酶相似，切点也在A和G之间，这是因为在活性中心的这两个相邻的A和G所处的特殊构象，使得A的2′-OH与离去基团（G的5′-O）处于共线排列，特别适合作为亲核试剂进行亲核进攻，发生典型的亲核取代反应。
但与锤头状核酶不同的是，发夹状核酶催化不需要金属离子，而是由活性中心的一个A（A38）作为广义酸碱行使催化。
HDV核酶为人乙型肝炎病毒（HBV）的卫星病毒RNA。
HDV病毒颗粒细小，直径35～37nm，核心含单股负链共价闭合的环状RNA和HDV抗原（HDAg），外面包以HBV的表面抗原（HBsAg）。
HDV必须在HBV或其他嗜肝DNA病毒的辅助下，才能通过“滚环机制”进行RNA 指导的RNA 复制，产生多个拷贝。
然后，HDV 核酶在特定的位点，将复制产生的多拷贝的长链RNA在特定的位点，自剪切成单位长度。
与其他已知的自我剪切的病毒RNA一样，其催化的反应依赖于相邻位置的2′-OH对剪切点的亲核进攻。
图e11-2(2) HDV核酶的二级结构和三级结构HDV核酶是第一种被发现使用广义酸碱催化的核酶，这与核糖核酸酶A相似。
核糖核酸酶A在催化RNA剪切反应时，用两个His来激活亲核基团和稳定离去基团（参看第十章酶的催化机理图10-8），原因是His的pKa为6.8，接近生理pH，因此特别适合这样的催化。
基于反向遗传学操作技术新城疫病毒载体的研究进展林初文;谢金文;王善辉;苗立中;沈志强【摘要】新城疫病毒是严重危害养禽业的重要疫病——新城疫的病原微生物.随着反向遗传学操作技术的快速发展,重组新城疫病毒载体已成为新城疫研究的重点,也是当今病毒载体系统研究的热点之一.笔者在简要综述了新城疫病毒的基因组结构和反向遗传载体的构建等的基础上,重点阐述了新城疫病毒载体在外源基因表达方面的研究概况.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)035【总页数】4页(P17146-17149)【关键词】反向遗传学;新城疫病毒;载体【作者】林初文;谢金文;王善辉;苗立中;沈志强【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州256600;山东绿都生物科技有限公司,山东滨州256600【正文语种】中文【中图分类】G813.1新城疫(Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV）引起的多种禽类易感的一种急性、高度接触性、毁灭性传染病，也是目前严重危害我国养禽业的重要疫病之一。
反向遗传学(Reverse genetics）是相对于经典遗传学而言的。
经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律，而反向遗传学与经典遗传学的研究思路正好相反，是直接从生物遗传物质入手，通过对遗传物质进行加工和修饰来研究基因突变后产生的生物体的特性(表型和性状等），从而确定生物体基因组的结构与功能以及这些突变可能对生物体特性的影响。
与之相关的各种研究技术统称为反向遗传学技术(Reverse genetics manipulation technique）［1－3］，主要包括 RNA 干扰 (RNA interference，RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是DNA重组技术应用范围的扩展与延伸。
HDV核酶研究近况国外医学分子生物学分册1999年第21卷第5朔1一{l}fHDV核酶研究近况于乐成毛青综述顾长海李奇芬审阅__,.—～,_.一第三军医大学西南医院全军传染病中心(重庆,400038)了7摘要HDV核酶为HDV双滚环复制所必需,最小序列约85枝苷酸(n’)左右,呈独特的假结样结掏,其结构和功能的关系已得到深入探索反式HDV核酶可能会成为一种新型有效的抗病毒药物键词HDV;核酶;结构和功能;应用丁衔韵研关键词核酶;结构和功能;应用jI竹田0’】/—一-—一J丁型肝炎病毒(HDV)基因组为单负股环状RNA,通过双滚环机制(doublerollingcirclemechanism)进行复制.该过程必须经过病毒前体RNA的自我催化裂解,即必须经过基因组核酶(genomeribozyme,gRz)和抗基因组核酶(antigenomeribozyme.ag. Rz,即复制中间体)的自裂.这一过程与一些植物致病病毒RNA复制特点相似.HDV复制过程中RNA的延伸,由宿主细胞RNA聚合酶II催化;自裂产物连接成环状,可能由宿主细胞RNA连接酶催化”.1HDV核酶的自裂位点及最小序列1988年,Sharmeen等用B『物延伸法证明ag.Rz的自裂位点在C904～G903之间.不久.Kuo等报道gRz的自裂位点在U688~G689之间.gRz36~100(自裂位点端和3’端分别含36nt和1.0nt)活性较高.后来.Perrotta等通过体外试验发现g. Rzl84和ag.Rzl84(j端分别为u和c)能保持较高自裂活性,其序列分别对应于HDV 基因组第688～772nt和抗基因组第904～820nt,提示HDV核酶的最小序列约85lit左右.g.Rzl一82和ag.Rzl一79虽能充分自*国家自然科学基金资助课题裂,但速率大大减慢.Thill等将g.RzI84的5端延长至5nt,去除3端第jl～68nt,得到g.Rz5—66(g.Rz71)仍能自裂,但同等条件下速率明显下降.2HDV核酶切割反应的机理及产物虽然.HDV核酶的结构与锤头状,发夹状核酶等明显不同,但催化反应发生的机理相似.都是转酯化反应.由自裂位点3端的2’-OH或氧原子对自裂位点处的磷原子实施亲核攻击,产物是23环化磷酸二酯和5一OH.倘缺乏2一OH或自裂位点5端为一脱氧核苷酸,则不能发生自裂.3体外HDV核酶切割反应的条件体外HDV核酶切割反应的条件为:①Mg_等二价金属阳离子为切割反应所必需. 其矶理之一可能是中和核酶RNA结构间的阴性斥力.使易于折叠成活性结构.Ca,Mn可替代Mg,有的研究甚至观察到Ca增加反式切割的效率远高于Mgis,v]. Sr”_,CA,Ba,Co,Pb,Zn对某些诱变株的自裂有较弱的辅助作用②一般在65C范围内随温度升高核酶活性增加.温度过高则因破坏HDV核酶的二级结构而使其丧失活性.⑧有的研究观察到HDV核酶裂国外医学分子生物学分册1999’年第2l卷第j期解底物的速率对数在pH4～6范围内呈线性上升,而另有研究发现某些HDV核酶的切割速率在pH5～9.1范围内并无明显变化,但大多数研究均提示pH7.0～7.5时核酶活性最高.①变性剂:G魁-CⅢb2-:’5ol群cJq/一G’1i:i4HDV核酶的结构模型及其结构域g,Rz和ag.Rz二级结构相似,但与锤头状核酶,发夹状核酶及链孢属Vs核酶不同.迄今主要提出3种模型,即假结样结街(pseudoknorstructure),斧头样结构(ax headstructure),三叶草形结构(cloverleaf structure)等模型.诱变分析,光交联,化学修饰等研究证实假结样结构(附图)最为可能’Ⅲ,可划分为9个结构域仅含lnt足可发生自裂,该nt可为U,C,A,但不能为GE]3].4.2Stem皿Lee等[.将g.Rzl0—66此延长2倍,不妨碍核酶折叠+但能增加核酶对甲酰胺的抵抗性,使活性有所增强+而减少lbp就会明显降低自裂活性此区的碱基配对所形成的双螺旋堆集结构主要起稳定核酶活性的作用,不参与构成活性中心,其序列有较大灵活性4.3Stemnl由3bp构成,5侧与stemI51侧共轴,3侧与stemI相邻.破坏其碱基配对或改变其序列均会导致活性下降+某些序列甚至完全无活性.所以此区结构和序列均很重要.4.4L3.与stemⅡ共同构成一个发夹环结构(hairpin—loopstructure).g.Rz和ag.Rz此区序列基本相同,富含嘧啶,唯g.Rz多1个U27.L3有较高的序列特异性+可能参与构或活性中心其5端,特别是CZllZ4附近区域可能靠近裂解位点的磷原子以发挥催化作用.4.5StemⅣ和L4两者共同构成另一个发夹环结构体外试验证明此区可减至4bp而对活性影响不大.但稳定的stmⅣ结构确实有利于活性提高,尤其是其根部的CG配对起着连接儿/4和J4/2的桥梁作用4.6J1/2连接stem【和stemI,对体外自裂反应意义不大,设计反式核酶时可被切断或删去但ag.Rz此区的8nt较保守,可能与核酶活性调节有关.4.7Jl/4连接stem【与stemⅣ,其中的3个G对核酶活性发挥很重要,若G38/40被A,C,u取代,则核酶活性明显下降.此区的G40/国外医学分子生物学分册l999年第21卷第5期42与位于J4/2区的G74/75的同型配对可使核酶结构扭曲,分别使C75/76靠近切割位点4.8J4/2连接stemN与stemI.对此区中G74/75,C75/76,A77/78,A78/79的碱基修饰显着降低核酶活性,C75/76的改变会导致核酶活性完全丧失光交联研究也显示ag.Rz的C76靠近切割位点.因此C75/76很可能直接参与了催化作用.4.9应用x线衍射技术发现g.RzJ1/~区的G38G39可与L3区的C22,C21形成短双链区P1.1.从而使g.Rz呈复杂的巢式双假结样(nesteddouble pseudoknot)高级结构.多种方法研究显示:L3,J1/4,J4/2可能共同参与构成催化中心.进一步研究尚发现: 若在两类HDV核酶间互换L3和J4/2+则活性均下降;但若只互换Jl/4,则活性均有不同程度升高”5反式HDV核酶的设计及意义核酶的自裂是一种分子内切割反应.称为顺式切割(cis—cleavage),核酶对底物的分子间切割则称为反式切割(trans—cleavage). HDV核酶是迄今发现的唯一可通过病毒自然感染而进入哺乳动物细胞中的核酶.所以研究其反式作用的重大意义在于利用它可能优于其它核酶的抗哺乳动物致病病毒作用. Branch等曾以斧头型结构为基础.从相应cDNA上分别转录出相当于”酶和”底物”的RNA分子,在适当条件下将两者混合,确实出现了”酶对”底物”的反式切割.假结样结构最接近实际结构,以它为基础的反式作用体系可分为3类:①”底物”和”酶”通过stemI的碱基配对结合,”底物”相当于stemI5侧序列;②”底物”和”酶”通过stem口,stemⅣ的碱基配对结合,酶由stemⅡ3侧,J4/2,stem～3侧组成;③”底国外医学分子生物学分册1999年第2l卷第5期物”和”酶通过stemI,stemⅡ,stemⅣ的碱基配对结合,”酶”由steml5侧,stemⅡ,L3,stemI3侧,J1/4及stemIV5侧构成,如Lai等设计的RNA73/RNA37(底物/酶)体系口,1个RNA37分子可切割多个RNA73分子,显示了”酶”的特点.后两类体系固核酶”对底物”序列要求过严,几无应用意义.第一类体系中+底物”与”酶”结合只需7nt,且在一定程度上可改变stemI3侧序列以适应底物序列+因此具有用来切割异源RNA分子的潜在价值.6HDV核酶活性的调节目前对HDV核酶活性的调节有这样几点认识:①基于HDV—RNA分子内约7O 碱基互补的事实,Lazinski等0认为互补序列的某些部分可充当”衰减子(attenuator)”的角色,通过碱基配对,使核酶及时失活②丁型肝炎病毒抗原(HDV Ag)虽非HDV核酶自裂所必需,但确能加快自裂和拼接反应1.Razas等1”发现未感染细胞内存在一种HDV Ag类似物,能影响HDV—RNA复制,并具有和HDV Ag相互作用的潜在能力.③新近Perrotta等通过体外试验发现ag.Rz 的第86～89nt(5,GCCA3)可与J1/z区的第10～13nt(5UGGC3)形成一双螺旋区P2a,对ag.Rz具有Na依赖性调节活性:低浓度Na(3mmol/L以下)时可显着抑制ag.Rz活性,但若先用高浓度Na一(100 mmol/L以上)与ag.Rz适当温育后再加入Mg,则使切割活性明显升高;HDV Ag对HDV桉酶活性的调节可能类似这一机制.应当指出,加强对临床分离株序列变异的研究+可更多了解HDV桉酶在体内的结构和功能变化+获取悻外实验研究所不能获取的重要信息,两者结合起来,对深入了解HDV核酶结构,性质,功能具有重要意义. 参考文献LaiMM.AnnuRevBiochem,1995;64:259 SharmeenLeta1.JVjroI,1988;62?2674 KuoMYPa1.JVirol,1988;62:4439 PerrottaATeta1.Nature,1991{350:434 BeenMDeta1.EurJBiochem,1997;247:741 PuttarajuEMeta1.NucleicAcidsRes一1993: 214253SakamotoTeta1.JBioehemTokyo,1997{l21:11238FauziHela1.NucleicAcidsRes,1997;25: 31249LeeCBeta1.Biochemistry,1996;35:12303 10DuhameIJeta1.NucleicAcidsRes,1996:24: 391111JengKSela1.NucleicAcidsRes,1996;70: 240312PerrottaATela1.NucleicAcldsRes.1996: 24:131413PerrotlaATeta1.Biochemistry,1992~31:16 14BravoCa1.NucleicAcidsRes,1996;24: 1351’15BeenMDeta1.RNA,19g5;1:106l16Ferre—D’AmareARa1.Nature,1998,395: 56717WadkinsTSela1.NucleicAcidsRes,1997; 25:408518BranchADa1.ProcNatIAcadScjUSA, 1991;88:1016319KawakamiJeta1.FEBSIe(t,1996{394:l32 20NishikawaFetEurJBicohem,1996:237: 71221LaLYCa1.Biochemistry,1996:35:12422LazinskDWel,a1.JVirol,l995{69:l】90 23JengKSeta1.JVirol一1996:7O:429524RazasR”a1.Science,1996;274:9025PerrottaATeta1.JMotBioI,1998;279:361 (1998一l1—10收稿)。
