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TUNEL法检测细胞凋亡

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针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）：
基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。

工作原理：简单说就是——TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是；生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）：
1. 充分脱蜡和水化。

脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；
2. 把握好细胞通透的时间。

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3. 适当延长TUNEL反应液的时间。

一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。

4. DAB显色条件的选择。

一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。

的充分清洗。

我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。

对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？
1. 蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加膜通透性，使rTDT酶、抗体易透过细胞膜进入细胞反应；
2. 蛋白酶K一般工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制1~10mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100mM Tris HCl +50mM EDTA）；
3. 蛋白酶K反应时间一般为10~30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4um左右的片子可以用10 min，但30 um左右的可用30 min，最终通过摸索最佳时间。

过长易脱片、过短起不到通透效果。

1. 抗原修复的原因是标本在甲醛等固定过程中，因发生蛋白交联和甲醛的封闭作用使抗原性降低，可以通过抗原修复使抗原决定族充分暴露出来；
2. 免疫组化中经常使用抗原修复，因为它的原理主要是抗原和抗体反应，通过抗原修复使更多的抗原与抗体结合，避免假阴性结果；
3. 而TUNEL的原理是dUTP与断裂的DNA上的3‘OH结合，故不需抗原修复；
4. 第一次TUNEL反应只需37度反应1h，或者延长时间即可
1. PROMEGA公司去年是40t要3300元（按100ul/片，实际可根据切片大小，加到30ul/pian）；而roche公司一般10t国内分装1300元（同样也是100/pian）；
2. 两个公司试剂盒内均没有PBS试剂，也不含DNase（以制作标准对照片）；
3. 我一般用4%PFA多聚甲醛，至少浸泡24 h后进行石蜡包埋、制片。

此外，Promega公司在操作步骤中加了两步4%PFA以固定组织，试剂盒内无PFA，但提供了配制方法。

再次请教：
1.我做TUNEL复染用苏木素几秒钟，请问还用不用1％盐酸究酒精分化了？
2.我想用罗氏的TUNEL试剂盒做荧光显像，请问用什么封片，配方？
针对你的问题，我分析如下：
1. 盐酸酒精分化的目的：一方面是分色；另一方面是减弱过强的苏木素核染色。

所以你若把握好苏木素着色，也可不分化。

2. 分化时间不能过长，否则阳性着色也褪色。

3. 一般荧光成像后可用高纯度甘油封片即可，若需长期保存，也可用无色指甲油片周围封固（必要性不大）。

这是我的操作步骤（Promega公司），看完后就知道了：
1. 脱蜡：用二甲苯浸洗5 min×2次；
2. 水化：用梯度乙醇（100％×5 min、100％×3 min、95％×3 min、85％×3 min、70％×3 min、50％×3 min）；
3. 浸洗：％NaCl×5 min→PBS洗5 min；
4. 固定：浸入4％多聚甲醛15 min；
5. 浸洗：PBS 5 min×2次；
6. 细胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15（10~30） min RT；
7. 浸洗：PBS洗5 min；
8. 固定: 浸入4％多聚甲醛5 min；
9. 浸洗：PBS 5 min×2次；
10. 平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡10（5～10） min；
11. 制备TUNEL反应混合液：处理组用1 μl rTdT＋1 μl 生物素标记的dUTP＋98 ul 平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓
冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。

12. 标记反应：加100 μl T UNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h。

13. 终止反应：浸入2×SSC 15 min；
14. 浸洗：PBS 5 min×3次；
15. 封闭POD：浸入％H2O2 15 min；
16. 浸洗：PBS 5 min×3次；
17. 酶标反应：加100 ul streptavidin标记HRP（按1:500 PBS稀释）30 min；
18. 浸洗：PBS 5 min×3次；
19. DAB显色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液＋50 ul H2O220×＋950 ul三蒸水）10 min左右，镜下出现浅棕色背景时。

20. 用去离子水冲洗几次；
21. 用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。

梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100％各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。

1、蛋白酶k的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。

但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与TritonX100等细胞通透剂。

2、蛋白酶K浓度配成贮存液浓度1mg/ ml是可以的，好像工作液浓度是20ug/ml吧，然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20度保存1个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少半年以上（我试过的）。

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tunel细胞凋亡率计算

tunel细胞凋亡率计算

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）是一种常用于检测凋亡细胞的方法。

TUNEL检测法通过标记凋亡细胞DNA末端的dUTP，可以检测出凋亡细胞的数量和分布。

TUNEL细胞凋亡率的计算方法如下：
1. 计算TUNEL阳性细胞数：在显微镜下观察到的凋亡细胞，通过染色后在光学显微镜下进行计数。

2. 计算总细胞数：通过显微镜下观察，在与TUNEL阳性细胞所在的组织切片中，对所有细胞进行计数。

3. 计算凋亡细胞率：凋亡细胞率= TUNEL阳性细胞数÷总细胞数×100%。

例如，如果在一个组织切片中，TUNEL阳性细胞数为100个，总细胞数为1000个，则凋亡细胞率为：
凋亡细胞率= 100 ÷1000 ×100% = 10%
需要注意的是，TUNEL法只能检测凋亡细胞的存在，不能区分凋亡细胞的类型（如程序性细胞凋亡或坏死），也不能确定凋亡细胞的数量。

因此，在使用TUNEL法进行凋亡细胞检测时，需要结合其他方法和技术进行综合分析。

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法

检测晚期凋亡.基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让和标记地进入细胞内，在地辅助下与核断裂地’结合，再用标记地链霉亲和素与上结合（每个链霉亲和素至少可以再结合个分子），最后用、过氧化氢与上地辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中阳性细胞地比例来判断细胞凋亡发生情况.罗氏试剂盒一、试剂、酶浓缩溶液×μ——末端脱氧核糖核酸转移酶（×）试剂、标记溶液×μ——含有核苷酸混合液地反应液（×）试剂、转化剂——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后℃保存）二、所需地溶液和仪器（）、配制、、饭盒、吹风机、甲醇溶液、、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）, 充分脱蜡和水化.脱蜡可以先度，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗次共、、、、乙醇浸洗×；②过氧化氢甲醇中浸洗，抑制内源性过氧化氢酶.③用蛋白酶（μ溶于中，）室温孵育分钟.④洗约*次，擦干样品周围地水.此阶段配制反应混合物——从试剂中取出μ标记溶液作为两个阴性对照；将试剂中取μ试剂中μ标记液中，配成μ 反应混合物混匀（即配即用，℃避光！）⑤标记反应：滴加μ地反应混合液，在湿盒中℃孵育分钟（为防蒸发和保证反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果.⑥信号转化和分析：擦干样品周围地水分，加入转化剂，湿盒中℃孵育分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次⑦加入μ 底物溶液，室温（℃）孵育，洗*次.（苏木素染秒，以免视野全染，需要摸索条件）⑧中性树胶或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果.•稳定性：反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好地此液体必须将放入冰浴中.个人收集整理勿做商业用途、转化剂（即用型）：一旦融化此液体，需在℃保存（最多保存个月），并且不能反复冻存. 蛋白酶一般工作液浓度为,但浓缩液可配制，可用配制，也可用蛋白酶缓冲液（）；注意：)蛋白酶可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（）,所以要最优化孵育时间长短.时间一般为，左右地片子可以用，但左右地可用，最终通过摸索最佳时间.过长易脱片、过短起不到通透效果.)对于比较困难地组织，可以选用地枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），需修复)对照：阴性对照：经过固定和通透地细胞样品加入μ试剂以代替反应混合物，从标记步骤以下同上.阳性对照：经过固定和通透地细胞样品用细球菌地核酸酶或使之产生链缺口，从标记步骤以下同上.)操作流程：常规脱蜡、脱水处理——冲洗样品——滴加反应混合物，℃孵育分钟——冲洗样品——选择：荧光镜下观察分析——滴加转化剂，℃孵育分钟——洗样品——滴加底物溶液，室温孵育分钟——光镜下分析结果)假阳性多地原因有很多：封闭不全、显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强浸洗)显色时间:（）显色时间不是固定地，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深地棕褐色，这很可能说明你地抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你地抗体孵育时间；（）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面地封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你地抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗度过夜）；另一方面就是封闭时间过长.)脱片产生地原因和如何防止脱片:（）多聚赖氨酸玻片质量地问题.我原先是买地，迈新按说也是不错地，可是都脱成什么样子了.后面补做第二批时用地病理科老师自己做地片子，要好一点.（）组织切地不好，切片机地问题例如比较老地旧地机器切地厚或者不均匀，或者切片者手法不好等.（）组织地问题，越是有坏死之类越容易脱.（）没烤好，时间短温度不够之类.（）操作地时候甩地太猛了，有脱片嫌疑地片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水.（）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用地时候尽量用泡地，不要冲.个人收集整理勿做商业用途。

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)说明书

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)说明书

TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)产品编号 产品名称包装 C1098TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(显色法)50次产品简介：碧云天生产的显色法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。

对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB 显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA 。

细胞凋亡时抽提DNA 进行电泳检测，可以发现180-200bp 的DNA ladder 。

基因组DNA 断裂时，暴露的3'-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP 的催化下通过DAB 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

本试剂盒有如下优点。

(1) 高灵敏度：背景染色极低，阳性染色强，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA 断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

(2) 特异性好：TUNEL 检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

(3) 快速：仅需约2-3个小时即可完成。

(4) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

(5) 实测效果好：参考图1。

图1. 本试剂盒的检测效果图。

A. HeLa 细胞未处理或用DNase I 室温孵育10分钟后的检测效果图。

细胞凋亡的六种检查方法

细胞凋亡的六种检查方法

细胞凋亡的六种检查方法一、引言细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在生物体的正常发育和疾病的发生中都起到了重要作用。

因此，对于细胞凋亡的检测方法也成为了科学家们关注的焦点之一。

本文将介绍六种常见的细胞凋亡检测方法。

二、TUNEL法TUNEL法是一种常见的检测DNA断裂和凋亡细胞数量的方法。

它利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记DNA断裂末端，并通过荧光或酶标记来检测。

操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 用缓冲液进行处理，使得DNA断裂末端暴露出来；3. 加入TdT和dUTP标记物，使得dUTP与DNA断裂末端连接；4. 洗涤样品，并加入抗dUTP抗体标记物；5. 洗涤样品，并观察荧光或颜色变化。

三、Annexin V染色法Annexin V染色法可以同时检测早期和晚期凋亡细胞。

它利用细胞表面磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的变化，通过Annexin V结合检测细胞凋亡。

操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Annexin V标记物，使得其与PIP2结合；3. 加入PI染色剂，使得细胞核染色；4. 观察荧光或颜色变化。

四、Caspase活性检测法Caspase活性检测法可以检测细胞内Caspase的活性水平，从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下：1. 取出样品，并将其固定在载玻片上；2. 加入Caspase底物和缓冲液，使得Caspase底物被水解；3. 观察荧光或颜色变化。

五、DNA Ladder分析法DNA Ladder分析法可以检测DNA的断裂情况，从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下：1. 取出样品，并提取其中的DNA；2. 用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，并观察条带形态。

六、电子显微镜观察法电子显微镜观察法可以直接观察细胞的形态和结构变化，从而判断凋亡的程度。

操作步骤如下：1. 取出样品，并进行适当处理；2. 用电子显微镜观察细胞形态和结构变化。

七、总结以上六种方法是常见的细胞凋亡检测方法，每种方法都有其特点和优缺点。