乳及乳制品的质量的测定

乳及乳制品中蛋白质的测定——常量凯式定氮法1原理试样、浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而试样中的有机氮转化为氮，并与硫酸结合成硫酸铵。

然后加碱蒸馏，使氨逸出，用硼酸溶液吸收出，再以标准盐酸溶液滴定。

根据消耗的标准盐酸溶液滴定。

根据消耗的标准盐酸溶液的体积可计算蛋白质的含量。

根据试样的测试步骤，包括以下几个方面。

1.消化将试样与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而试样中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。

在消化过程，利用浓硫酸的脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。

反应式为NH2CH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3同时浓硫酸又具有氧化性，使炭化候后的碳进一步氧化为二氧化碳，硫酸同时被还原成二氧化硫，反应式为2H2SO4+C→CO2+2SO2+2H2O最后二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中:2NH3+H2SO4→(NH4)2SO42.蒸馏在消化完全的试样消化液中加入碱液（浓氢氧化钠）使之碱化，消化液中的氨被游离出来，通过加热蒸馏释放出氨气，反应方程式如下：（NH4）2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH33.吸收与滴定蒸馏所释放出来的氨，用弱酸溶液（如硼酸）进行吸收，与氨形成强碱弱酸盐，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定。

吸收及滴定反应方程式如下：2NH3+4H2BO3→(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O →2NH4Cl+4H3BO3本测定中滴定指示剂是用按一定比例配成的甲基红-溴甲酚绿混合指示剂。

甲基红PH4.2~6.3变色，由红变为黄，终点为橙色，溴甲酚绿在PH3.8~5.4变色，由黄变蓝，终点为绿色。

当两种指示剂按适当比例混合时，在PH5以上呈绿色，在PH5一下为橙红色，在PH5时因互补色关系呈紫灰色，因此滴定终点十分明显，易于掌握。

凯氏定氮法可适用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定。

凯氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，经长期改进已演变成常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定氮仪法等多种方法。

因为测定样式中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、以及含氮色素等含氮化合物，故测定结果中的氮不能完全代表蛋白质中的氮，故测定结果为粗蛋白质的含量。

1.1.1试验样品：乳制品1.1.2试验药品和试剂所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水。

硫酸铜；硫酸钾；浓硫酸（密度为1.8419g/L）；40％氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；4％硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至lOOmL；0．1mol／L盐酸标准滴定溶液；混合指示液：甲基红次甲基蓝混合指示液：将1份次甲基蓝乙醇溶液(1g／L)与2份甲基红乙醇溶液(1g／L)按1：2体积比混合。

1.1.3仪器和设备：实验室常规仪器及下列各项：凯氏烧瓶：500mL；可调式电炉；铰肉机：篦孔径不超过4nm；组织捣碎机；粉碎机；研钵：玻璃或瓷质；化学消化器；凯氏定氮仪；空气滤过器；容量瓶；锥形瓶50ML，量筒10ML；1、2、10ML刻度吸量管；凯氏定氮消化、蒸馏装置；1.试验方法全量凯氏定氮法全量凯氏定氮法的原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。

然后取消化液的全部加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。

根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

包括消化、蒸馏、吸收、滴定四个步骤2．分析过程试样制备：固体样品：取有代表性的样品至少200g，用研钵捣碎、研细；不易捣碎、研细的样品应切(剪)成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎；液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g。

粉状样品：取有代表性的样品至少200g(如粉粒较大也应用研钵研细)，混合均匀；糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀；固液体样品：按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，混合均匀；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g，用铰肉机至少铰两次，混合均匀。

上述试样应放入密闭玻璃容器中，于4°C冰箱内贮存备用，尽快测定。

3.操作方法（1）消化精密称取0.2~2.0g均匀固体试样或2~5g均匀半固体试样或吸取10~20ml液体试样，（约相当于氮30~40mg），移入干燥的100ML或500ML凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜、10g硫酸钾及20ML硫酸，按图安装消化装置，轻轻摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的电炉石棉网上。

在通风橱内小心加热，先用慢火待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，再加强火力，保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。

取出放置冷却至室温，向瓶中小心加200ML水。

同时做一试剂空白。

（2）蒸馏消化液放冷后，将凯氏瓶或蒸馏瓶（加入数粒玻璃珠）按常量凯氏定氮消化、蒸馏装置图连接蒸馏装置，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下，吸收瓶内装入4%硼酸溶液及混合指示剂2~3滴。

通过漏斗向凯氏瓶中加入50%氢氧化钠溶液80ML；当瓶内溶液变为深蓝色或产生黑色沉淀，加入100ML蒸馏水（由小漏斗加入），夹紧夹子，加热至凯氏瓶内溅液减少到1/3时（馏液约250ML即可），将冷凝管下端提出馏出液液面并用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min。

要检查氨是否完全蒸馏出来，用PH试纸检查馏出液是否为碱性，若为碱性，即可停止加热。

（3）吸收和滴定将收到的蒸馏液用0.1000mol/L盐酸溶液滴定至溶液由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸用量。

（4）空白试验取与处理试样相同量的硫酸铜、硫酸钾及硫酸按同一方法做试剂空白试验，记录消耗盐酸用量，进行计算。

5.结果计算C (V2—V1) *0.014蛋白质= ———————*F*100m式中V1——滴定试样馏出液所消耗盐酸标准溶液的体积，ML；V2——滴定空白馏出液所消耗盐酸标准溶液的体积，ML；C ——标准盐酸溶液的浓度；0.014——1mol/L盐酸标准溶液1mL相当于氮的质量，g；F——氮的蛋白质换算系数；m——试样的质量，g。

6.说明及注意事项①确保所用试剂溶液用无氨蒸馏水配制。

②在消化过程中硫酸钾硫酸铜的作用。

硫酸钾：在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度，加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可以提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。

另一方面随着消化过程硫酸不断地被分解，水分逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。

加速了有机物的分解。

因此应该注意硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。

实验中除使用硫酸钾外，也可用硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但使用效果不如硫酸钾。

硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。

凯氏定氮法中除使用硫酸铜外，还可以用氧化汞、贡硒粉等作为催化剂，但考虑到效果、实验成本及环境污染等多种因素，实验中应用最广泛的是硫酸铜，使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物的氧化分解。

实验过程中待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜生成时，溶液就呈现清澈的二价铜的蓝绿色。

故硫酸铜除起催化作用外，还可以指示消化终点的到达，以及在消化液蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

③凯氏烧瓶和取样量。

操作时取样要均匀。

如果称1g以上的试样，就需要凯氏烧瓶最小500mL，800~1000mL的更好。

这样的凯氏烧瓶对于缩短氨化时间，同时对加热的均匀性和完全氨化效果最好。

④消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，同时注意不断转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。

⑤试样中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；或者加入少量辛醇溶液或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。

⑥当试样消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2~3mL后再继续加热消化。

⑦若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量，试样中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。

⑧一般消化至消化液呈透明后，继续消化30min即可。

但对于含有特别难以氨化的氮化合物的试样，如含有赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等试样时，需适当延长消化时间。

有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，消化液呈较深绿色。

⑨蒸馏过程的装置不能漏气，否则造成氨的泄漏，增加误差。

⑩蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。

蒸馏时加50%氢氧化钠，如果NaOH量加的不够会产生H2S,H2S是强酸，是指示剂颜色变红。

硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。

蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，在蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。

乳与乳制品中蛋白质的测定——紫外分光光度法1．原理蛋白质与其降解产物（脲，胨，肽和氨基酸）的芳香环残基在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。

在波长280nm下，光吸收程度与蛋白质浓度（3~8mg/ml）呈直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样索做的标准曲线，即可求出试样蛋白质含量。

2．试用范围紫外吸收法简便，灵敏，快速，不消耗试样，测定后仍能回收使用。

低浓度的盐，例如生化制备中的常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。

特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需检测蛋白质浓度的变化，而不需要知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。

故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

若试样中含有嘌呤，嘧啶及核酸等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。

核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。

但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存着一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因ph的改变而有变化，因此要注意溶液的ph值，测定试样时的ph要与测定标准曲线的ph相一致。

芳香族氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸）在280nm（肽键190nm）有吸收峰。

在280nm下，光吸收程度与蛋白质浓度（3~8mg/ml）成直线关系（但有干扰）。