C_反应蛋白对脂肪细胞脂联素表达的影响
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收稿日期:2008-03-31;修回日期:2008-05-10作者简介:黄 鹏(1981-),男,硕士,E 2mailhuangpeng2002-@;通讯作者:高 萍,副教授,博士,硕士生导师,E 2mail:p inggao0441@yahoo 。
基金项目:黑龙江省教育厅科学研究项目(11511242)doi:10.3969/j .issn .1008-9632.2009.01.008C 2反应蛋白对脂肪细胞脂联素表达的影响黄 鹏,孙玉倩,高 萍(哈尔滨医科大学附属二院内分泌科,哈尔滨 150086)摘 要:通过体外培养脂肪细胞,研究C 2反应蛋白(CRP )对大鼠脂肪细胞脂联素蛋白分泌及mRNA 基因表达的影响。
取大鼠附睾脂肪垫培养脂肪细胞。
用0、10、50μg/mL 的CRP 刺激脂肪细胞6h,提取细胞RNA,用实时荧光定量RT 2PCR 技术检测脂联素mRNA 表达的变化;收集细胞培养液,运用W estern bl ot 技术检测脂联素蛋白分泌的变化。
结果显示0、10、50μg/mL 的CRP 对大鼠脂肪细胞脂联素mRNA 表达的影响无差异(P >0105)。
50、10μg /mL 的CRP 均可减少大鼠脂肪细胞培养液中脂联素蛋白的分泌量(P <0105)。
CRP 可呈剂量依赖性的降低脂肪细胞脂联素蛋白分泌的水平。
而各组CRP 未能影响脂肪细胞脂联素mRNA 的表达。
CRP 对脂肪细胞脂联素基因表达和蛋白分泌的研究可以揭示转录后的控制决定了CRP 对脂联素的影响。
关键词:C 2反应蛋白;脂联素;脂肪细胞中图分类号:Q952文献标识码:A文章编号:1008-9632(2009)01-0008-03 脂联素是脂肪细胞特异性分泌蛋白,不仅与肥胖、胰岛素抵抗等密切相关,还在抗动脉粥样硬化的过程中起着重要的作用。
脂联素在炎症时发挥重要的负性调控作用[1]。
目前已证实许多内源性细胞因子可抑制脂联素的表达[2]。
CRP 是目前公认的炎症标记物,其本身还有炎症因子的作用,参与动脉粥样硬化的形成[3]。
在胰岛素抵抗,糖尿病和动脉粥样硬化等慢性炎症相关疾病中都存在低脂联素血症,而CRP 水平较健康人群明显增高[4,5]。
低水平脂联素和高浓度CRP对代谢性疾病发展具有协同作用[6]。
有研究表明高敏CRP 水平和脂联素水平成负相关[7]。
但在脂肪细胞水平上,CRP 对脂联素的影响目前还是未知。
本文将探讨不同浓度CRP 对脂肪细胞脂联素蛋白分泌及mRNA 表达的影响。
1 材料和方法111 试剂 C 2反应蛋白购自美国Calbi ochem 公司;反转录试剂盒购自美国Promega 公司;PCR 引物及探针由上海基康生物技术有限公司合成;脂联素一抗购自美国Chem icon 公司。
112 实验对象 雄性Spargue 2Dawley 大鼠(180～220g ),购买和饲养于哈尔滨医科大学动物实验中心。
113 脂肪细胞培养 根据Rodbell 改进的方法,取S D大鼠附睾脂肪垫,消化45～60m in,经过滤、离心,以10%细胞压积培养在DME M 培养基中。
114 CRP 对脂肪细胞脂联素表达和分泌的作用 将脂肪细胞培养在CRP 浓度为0、10、50μg/mL 的DME M 培养基中,培养6h 后收获细胞用于检测脂联素mRNA 表达,细胞培养液则用于检测脂联素蛋白分泌量。
115 脂联素mRNA 检测(实时荧光定量RT 2PCR 法) 提取脂肪细胞总RNA,根据反转录试剂盒说明书进行逆转录。
S D 大鼠脂联素引物正义:5′2AGG AAACT 2TGTGCAGGTTGG A 23′,反义:5′2ATCTCCTGGGTC AC 2CCTT AGG 23′,探针:FAM 2CCCGGT ATCCCATTG TG A CCAGG AT 2T AMRA 。
定量PCR 检测:50℃2m in,95℃10m in 后,95℃30s ,60℃30s ,40个循环。
用Beta 2actin 作内参。
116 脂联素蛋白检测(W estern blot ) 收集培养6h 后的细胞培养液,用BCA 法定量。
蛋白质经电泳后转移到P VDF 膜上,用稀释度为1∶2000的小鼠抗大鼠脂联素单克隆抗体作为一抗,比例1∶1000作为马抗小鼠二抗稀释度,碱性磷酸酶法显色,曝光。
8117 统计学处理 资料分析采用SPSS1310软件系统,结果表达为均数±标准差,正态分布资料应用随机区组设计资料的方差分析及其两两比较,分析不同浓度的CRP 处理体外培养的脂肪细胞脂联素分泌及表达变化的差异。
2 结果211 CRP 对脂肪细胞脂联素基因表达的影响用实时定量RT 2PCR 法比较0、10、50μg/mL CRP 处理脂肪细胞6h 后,脂肪细胞脂联素基因表达的变化。
以Beta 2actin 作为内参,用脂联素基因的拷贝数平均值除以该样品内参基因的拷贝数平均值,得到脂联素基因的相对含量。
样品中模板的拷贝数,可由S DS 软件通过所得到的Ct 值从标准曲线上计算得到。
结果显示低剂量组和高剂量组与对照组之间,脂联素mRNA 表达量并不存在统计学差异,如表1所示。
表1 CRP 对脂肪细胞脂联素基因mRNA 表达的影响Table 1Effect of CRP on adi ponectin gene exp ressi on in adi pocytes组别n CRP 剂量(mg/mL )脂联素(/β2actin )对照组501148±0130低剂量组5101160±01263高剂量组5501140±01423 10、50μg /mL CRP 组与对照组相比并未影响脂联素mRNA 的表达,结果表达为均数±标准差;3表示与对照组相比,P >0105。
212 CRP 对大鼠脂肪细胞脂联素蛋白分泌的影响如图1所示,用0、10、50μg/mL CRP 处理脂肪细胞6h,发现10、50μg/mL CRP 可抑制脂联素蛋白分泌水平,并有统计学差别。
与对照组相比50μg/mL CRP 可抑制脂联素蛋白分泌达4112%,10μg/M l CRP 可抑制脂联素蛋白分泌3017%。
图1 CRP 对脂联素蛋白分泌的影响Fig 1Effect of CRP on adi ponectin secreti on in adi pocytes 10、50μg /mL CRP 可明显抑制脂联素蛋白分泌,并呈剂量依赖性,有统计学意义,对照组结果表示为100%,其余各组为与对照组的相对百分比,结果经3次独立的重复实验得到证实,3表示与对照组相比,P <01053 讨论本文在脂肪细胞水平上,探讨了CRP 对脂联素基因表达及其蛋白分泌的调节。
临床上,低血清脂联素水平同增高的炎症因子水平如CRP 密切相关[8]。
并且CRP 和脂联素水平在血浆与脂肪组织中都成反比。
慢性系统性炎症时期,这种高水平CRP 伴随低脂联素血症的现象机制未明,是否是由CRP 通过下调脂肪组织脂联素的表达分泌而使血浆脂联素水平下降目前还不清楚,需要进一步证实。
本研究发现不同浓度的CRP 处理脂肪细胞6h 后,脂联素mRNA 的表达无明显差异。
而与此同时分泌到培养基中的脂联素蛋白是随着CRP 浓度的增高而减低的。
脂联素蛋白水平的高低受到复杂调控系统的控制,它包括对脂联素基因的转录和降解,mRNA 的翻译,蛋白在细胞内的转运和分泌等多方面的调控。
有研究表明脂联素蛋白合成后的转运过程可被抑制,这种作用是否与CRP 对脂联素的影响类似还不得而知[9]。
本研究说明在体外实验时CRP 对脂联素基因的表达没有影响。
当然这与人体内的情况不一定相同,它缺乏各种细胞因子之间的相互影响。
本实验结果与Guoyue Yuan 等在3T32L1脂肪细胞中所发现的CRP 可抑制脂肪细胞脂联素基因的表达的实验结果不同[10]。
这可能是由于细胞来源不同所造成的。
在炎症期,炎症因子之间的相互调节应该对炎症的发展起到一定的调控作用。
CRP 是重要的炎症因子,它可明显提高肿瘤坏死因子2α和白细胞介素26的水平。
有研究表明,白细胞介素26和脂联素间可能通过旁分泌和自分泌方式相互作用;另外,局部脂肪组织产生的白细胞介素26和肿瘤坏死因子2α可直接抑制局部脂联素的产生[11]。
推测CRP 也有可能通过提高白细胞介素26和肿瘤坏死因子2α的水平而间接的抑制脂联素的分泌。
综上所述,在炎症的级联反应中CRP 可能通过直接或间接作用影响脂联素的分泌。
本实验首次证实了CRP 对大鼠脂肪细胞脂联素分泌抑制作用。
脂联素作为一种成熟脂肪细胞分泌的特异性蛋白质,参与动脉粥样硬化形成的各个环节,通过多种作用机制抑制炎症反应阻断动脉粥样硬化的形成。
CRP 可介导心血管损伤,是与动脉粥样硬化发生、发展、治疗有关的促炎因子,并可强烈预测未来心血管事件的危险。
随着对脂联素和CRP 的相互影响机制的不断深入研究,将为心、脑血管及周围血管疾病的防治提供理论参考。
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