碱性磷酸酶比活力测定
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碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠:低渗破膜低浓度乙酸镁:保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇:沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇:溶解AKP50%丙酮、60%乙醇:沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度,是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定:*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数,V max为最大反应速度*如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]*吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标,以底物浓度的倒数作横坐标,按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。
碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一:酶促反应动力学实验报告 酶促反应动力学实验报告14301050154 杨恩原实验目的:1. 观察底物浓度对酶促反应速度的影响2. 观察抑制剂对酶促反应速度的影响3. 掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理:一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下,底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下,当底物浓度很低时,酶促反应的速度随底物浓度[S]的增加而迅速增加,但当底物浓度继续增加时,反应速度的增加率就比较小,当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示即:式中Vmax为最大反应速度,Km 为米氏常数,[S]为底物浓度当v=Vmax/2时,则Km=[S],Km 是酶的特征性常数,测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下,根据实验结果绘制成的是直角双曲线,难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程,则此方程为直角方程,即:以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线,在横轴截距为-1/Km,据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例,测定不同浓度底物时的酶活性,再根据1/v和1/[S]的倒数作图,计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性,甚至使酶完全丧失活性的物质,成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大,但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合,故其Km值不变,然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物,确定其抑制作用属于哪种类型。
实验步骤:实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1. 取试管9支,将/L基质液稀释成下列不同浓度:管号试剂2. 另取9支试管编号,做酶促反应:管号试剂3. 混匀,37 ℃水浴保温5分钟左右。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP/ALP)活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶,在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中,以肝脏为主。
测定原理:在碱性环境中,AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚;酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物,在510nm有特征光吸收;通过测定510 nm吸光度增加速率,来计算AKP活性。
自备仪器和用品:可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制:试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体×1瓶,4℃避光保存。
试剂四:液体×1瓶,4℃避光保存,未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品:液体×1支(EP管中),2 μ mol/mL酚标准液,4℃保存。
粗酶液提取:1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆,4℃、8000g离心10min,取上清液待测。
2. 细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定,或者适当稀释后测定。
测定步骤:1. 分光光度计预热30min,调节波长到510 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管:取EP管,加入20μL蒸馏水,200μL试剂二,200μL试剂三,混匀后置于37℃水浴中保温15min;加入试剂四600μL,混匀后于510 nm测定吸光度,记为A空白管。
8碱性磷酸酶比活力测定概述碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是一种广泛存在于动植物组织和微生物中的酶,其主要功能是催化磷酸盐基团的水解反应。
ALP的活性主要由酸碱度、温度、金属离子浓度等因素所影响。
ALP比活力测定可以用于快速筛选和检测酶的活性及其活性变化等。
本实验采用8碱性磷酸酶作为模型酶,采用间接比色法测定其比活力。
材料和试剂试剂:1. 空白对照:含有ALP缓冲液的管2. 标准对照:10μg/mL碱性磷酸酶溶液3. 涂板洗涤缓冲液:PBS液,pH 7.44. 反应底物:pNPP溶液5. 停止液:2mol/L NaOH溶液6. ALP缓冲液:0.1mol/L甘氨酸缓冲液,pH 9.6,含有1mmol/L MgCl2仪器:1. 组合式洗板机2. 酶标仪3. 加热器4. 温度计方法注意事项:1. 所有的样品和标准溶液都应在同一天制备,并测量前混匀。
2. 所有的试剂和材料都要神经否则可能影响实验结果。
实验操作:1. 取100μL标准对照和100μL空白对照,分别加入洗涤缓冲液中,洗涤3次。
2. 加入100μL标准对照和待测样品至96孔板中。
每个样品平行加入两个孔。
3. 加入50μL反应底物至每个孔中,将板密封,加热反应30min。
4. 加入50μL停止液,将板洗涤5次。
5. 测定吸光度值,波长为405nm。
数据处理1. 记录96孔板中每个孔的吸光度值。
2. 以标准对照为基准,计算每个孔的相对吸光度值。
3. 以样品组的平均相对吸光度值为y,以标准对照相对吸光度值为x,绘制标准曲线,计算标准曲线的斜率。
4. 计算样品的ALP比活力。
样品ALP比活力= (样品相对吸光度值/y) x 斜率。
结果与分析以标准曲线计算每个样品的ALP比活力,根据结果可以判断样品中ALP酶的比活力。
若ALP比活力高,说明该样品中ALP酶活性较强;若低,则说明其活性相对较弱。
总结。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定项目名称碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定xinpingzhao@实验目的1. 了解酶提取纯化的基本实验技术;2. 掌握碱性磷酸酶酶活力及比活力的测定方法实验材料新鲜兔肝或兔肾主要仪器设备匀浆器,冷冻离心机,分光光度计,电子天平等.实验原理碱性磷酸酶(简称AKP)在磷酸盐代谢中起重要作用。
核酸序列分析、DNA重组技术、酶标免疫检测技术以及临床检验中都需要利用此酶。
本实验取材于兔肝,经匀浆、正丁醇抽提、硫酸胺分段盐析或者有机溶剂沉淀,获得碱性磷酸酶制品。
本实验采用对硝基苯磷酸二钠(p-NPP)为底物的方法测定酶活。
对硝基苯磷酸二钠在碱性磷酸酶的作用下被水解为游离磷酸及对硝基苯酚,对硝基苯酚在强碱性条件下显示亮黄色,在405nm处有强烈的吸收峰。
因此可以测定405nm处的吸收值A405nm来计算产物的生成量,从而计算出酶活力,然后通过各级纯化步骤产物蛋白含量的测定,从而计算出酶的比活力.第一部分: 碱性磷酸酶的提取以下操作均在4℃进行。
方案一:1. 称取新鲜兔肝2g,剪碎后,置于玻璃匀浆器中,按1:2(m/v)加入预冷的0.05mol/LTris-HCl (pH9.0)缓冲液,匀浆后4℃抽提20 min;4℃,8000r/min离心10min;取上清;此为A 液。
另取1支试管编号为A,取0.1mLA 液,加1.9mLTris缓冲液(pH 8.8),混匀,供测酶活性用。
2.上清液中加入1/5体积预冷正丁醇脱脂20min;8000r/min离心10min,取上清;此为B液。
吸取0.1m1B 液,置于编号为B 的试管中,加入1.9m1Tris 缓冲液(pH 8.8),供测酶活用。
3.加入硫酸铵至35%饱和度;4℃30 min;8000r/min离心10min,弃沉淀;取上清;此为C 液。
吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中,加入1.8m1Tris 缓冲液(PH 8.8),供测酶活性用4.然后在上清液中加入硫酸铵至75%饱和度,4℃静置30 min后8000r/min离心10min,得沉淀..用0.05mol/LTris-HCl(pH9.0)缓冲液溶解沉淀;此为D 液。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶,能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应,在多种生理过程中发挥重要作用。
其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。
一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中,加入磷酸盐缓冲液(pH 7.4),用高速离心离心3-5分钟,去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液,在实验台上加入玻璃珠或石英砂,放入冰箱冷冻器中。
2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液(pH 7.4),放入研钵中,加入冰冷甲醇,研磨5-10分钟。
将打磨液离心分离,上清液用分液漏斗收集,加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液,静置20分钟,收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。
3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂,轻微摇动,分离出沉淀,将上清液倒入烧瓶中,并用氯仿洗涤,收集洗涤液后将其合并,加入甲醇进行沉淀,离心分离,去除上清液,加入2-3倍体积的丙酮,静置反复冲洗多次。
将沉淀中加入适量的溶解液,摇混均匀,转移至离心管中,并用离心机转速2800r/min/5 min。
二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中,包括10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等,总体积为2ml。
2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品,并制备好标准品不同浓度的稀释液。
将稀释后的酶样品取1ml,加入酶活性试验体系中,并在无酶样品控制下,以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液,如α-萘酚磷酸钠。
注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生,以免误诊。
3、反应终止在反应末期,可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应,并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控,并测定比活力。
综上所述,选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。
碱性磷酸酶比活性测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶(ALP)的比活性,了解其在生物体内的作用和活性水平。
通过实验,掌握碱性磷酸酶比活性测定的基本原理和方法,培养实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶,能够催化磷酸酯的水解反应。
在本实验中,以对硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物,在碱性条件下,碱性磷酸酶能够将 pNPP 水解生成对硝基苯酚(pNP)和磷酸。
pNP 在碱性溶液中呈黄色,其在 405nm 波长处有最大光吸收。
通过测定反应体系在405nm 处的吸光度变化,可以计算出碱性磷酸酶的活性。
比活性是指每毫克蛋白质所含的酶活性单位数,通过测定蛋白质含量和酶活性,即可计算出碱性磷酸酶的比活性。
三、实验材料与仪器1、实验材料碱性磷酸酶标准品对硝基苯磷酸二钠(pNPP)碳酸钠碳酸氢钠缓冲液(pH 100)氢氧化钠溶液(1mol/L)考马斯亮蓝 G-250 试剂牛血清白蛋白标准品待测样品(组织提取液或细胞培养液)2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器容量瓶试管四、实验步骤1、标准曲线的绘制配制不同浓度的对硝基苯酚(pNP)标准溶液:分别吸取 0、01、02、03、04、05ml 的 1mmol/L pNP 标准溶液,加入到 10ml 容量瓶中,用碳酸钠碳酸氢钠缓冲液定容至刻度,得到浓度为 0、10、20、30、40、50μmol/L 的标准溶液。
长处测定各标准溶液的吸光度。
绘制标准曲线:以 pNP 浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
2、蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法)配制考马斯亮蓝 G-250 试剂:将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶解于50ml 90%乙醇中,加入100ml 85%磷酸,最后用蒸馏水定容至1000ml。
配制牛血清白蛋白标准溶液:将牛血清白蛋白标准品用蒸馏水配制成 0、01、02、03、04、05mg/ml 的标准溶液。