碱性磷酸酶比活力测定
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碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠:低渗破膜低浓度乙酸镁:保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇:沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇:溶解AKP50%丙酮、60%乙醇:沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度,是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定:*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数,V max为最大反应速度*如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]*吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标,以底物浓度的倒数作横坐标,按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。
碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一:酶促反应动力学实验报告 酶促反应动力学实验报告14301050154 杨恩原实验目的:1. 观察底物浓度对酶促反应速度的影响2. 观察抑制剂对酶促反应速度的影响3. 掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理:一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下,底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下,当底物浓度很低时,酶促反应的速度随底物浓度[S]的增加而迅速增加,但当底物浓度继续增加时,反应速度的增加率就比较小,当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示即:式中Vmax为最大反应速度,Km 为米氏常数,[S]为底物浓度当v=Vmax/2时,则Km=[S],Km 是酶的特征性常数,测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下,根据实验结果绘制成的是直角双曲线,难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程,则此方程为直角方程,即:以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线,在横轴截距为-1/Km,据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例,测定不同浓度底物时的酶活性,再根据1/v和1/[S]的倒数作图,计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性,甚至使酶完全丧失活性的物质,成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大,但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合,故其Km值不变,然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物,确定其抑制作用属于哪种类型。
实验步骤:实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1. 取试管9支,将/L基质液稀释成下列不同浓度:管号试剂2. 另取9支试管编号,做酶促反应:管号试剂3. 混匀,37 ℃水浴保温5分钟左右。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP/ALP)活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶,在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中,以肝脏为主。
测定原理:在碱性环境中,AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚;酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物,在510nm有特征光吸收;通过测定510 nm吸光度增加速率,来计算AKP活性。
自备仪器和用品:可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制:试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体×1瓶,4℃避光保存。
试剂四:液体×1瓶,4℃避光保存,未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品:液体×1支(EP管中),2 μ mol/mL酚标准液,4℃保存。
粗酶液提取:1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆,4℃、8000g离心10min,取上清液待测。
2. 细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定,或者适当稀释后测定。
测定步骤:1. 分光光度计预热30min,调节波长到510 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管:取EP管,加入20μL蒸馏水,200μL试剂二,200μL试剂三,混匀后置于37℃水浴中保温15min;加入试剂四600μL,混匀后于510 nm测定吸光度,记为A空白管。