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碱性磷酸酶比活力测定

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生物化学实验-小牛肠碱性磷酸酶的提纯及比活力测定-精选文档

生物化学实验-小牛肠碱性磷酸酶的提纯及比活力测定-精选文档

分段盐析
不同蛋白分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以 及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也 不同，因此调节盐浓度，可使不同的蛋白质分别沉淀，如： 血清
(NH4)2SO4 50%饱和度
球蛋白
析出
完全饱和
清蛋白
析出
常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶 解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。盐 析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。
思考题
1、小牛肠碱性磷酸酶的分子量是多少？等电点是多少？ 分子量为145000，等电点为5.7 2、何谓酶活力（单位）？ 在最适反应条件（25℃）下，每分钟内催化1mol底物转化 为产物所需的酶量为一个酶活力单位，即1U=1mol/min。 3、何谓盐析？盐溶？ 蛋白质溶液中加入大量的中性盐[(NH4)2SO4，Na2SO4]， 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。 蛋白质溶液中加入少量的中性盐[(NH4)2SO4，Na2SO4]，会 增加蛋白质与水分子的作用，从而使蛋白质在水中的溶解度增大， 这种现象称为盐溶。
实验六 小牛肠碱性磷酸酶的提纯及
比活力测定
实验目的
• 掌握小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活力测 定的原理和方法
基本知识
• 酶活力： 在最适反应条件（25℃）下，每分钟内催化1mol底物转化 为产物所需的酶量为一个酶活力单位，即1U=1mol/min。
• 酶的比活力： 代表酶的纯度，用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示。 比活力=活力（U）/蛋白（mg）=总活力（U）/总蛋白（mg） • 酶活力的测定方法：
结 束！
ΔA：405nm波长下吸光度的变化 t：时间，；VR：反应液的体积，1.5ml； D：稀释倍数；E405：405nm波长下对硝基苯酚的摩尔吸收系数，18.3； VE：所加酶液体积；c：酶液浓度；L，比色皿光程，0.5。

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。

*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。

*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。

2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。

*每毫升样品中的蛋白质毫克数。

3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。

以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。

二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。

碱性磷酸酶活力测定

碱性磷酸酶活力测定
②骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的释放进入血液中，引起血清活性 增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。 2．血清活性降低比较少见： 主要见于呆小病、重症慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。另有 一种遗传性低症，因成骨细胞中缺乏，引起骨中的矿物质严重缺乏，易发生骨折。
诊断常用血清酶
血清酶
鸟氨酸氨基甲酰转移酶 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 谷氨酸脱氢酶 山梨醇脱氢酶 丙氨酸氨基转移酶 异柠檬酸脱氢酶
-谷氨酰转肽酶 5ˊ-核苷酸酶 单胺氧化酶 天门冬氨酸氨基转移酶 肌酸激酶 乳酸脱氢酶 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 淀粉酶 脂肪酶
符号 5ˊ
来源
肝 肝 肝
肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。
酶活性的测定方法
• 固定时间法： （终点法） • 通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底
物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。 • 连续监测法： （速率法） • 连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量
•
在血浆中发挥特定催化作用的酶。如凝血酶、胆碱酯酶（）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶
等。
•
它们大多数在肝内合成，在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度。有的可以作为肝功
能试验的一部分。
•
血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。
（二）非血浆特异酶
•
在血浆中浓度很低，且无功能，分为两种。
• • 临床上测定活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊断。
• 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍 ，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。

实验五碱磷酶的纯化和比活性的测定

实验五碱磷酶的纯化和比活性的测定

管号
不同酶液
O -
S -
1(AE) 2(BE) 3(CE) 4(DE) 0.1 0.1 0.1 0.1
0.1mg/ml标准酚液
0.1 3
0.1
3
3
3
3
3
0.01mol/LpH8.8Tris
预温37℃复合基质液
考马斯亮蓝法测定蛋白含量
游离状态的考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中 呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，蛋白质 含量与颜色深浅成正比 595nm测定吸光度，做标准曲线，求出蛋白 质浓度
实验结果
分离阶段 蛋白质 (mg/ml) 酶活性 （U/ml） 比活性 (U/mg) 纯化倍数 得率
Summary of porcine platelet-derived growth factor purification protocol
Step Total protein (mg/ml) 39 800 237.32 45.83 6.25 4.35 0.17 Total activity (z/U) 1.8×106 9.2×105 6.1×105 8.4×104 6.9×104 5.8×104 Specific Fold activity Recovery purificat (%) ［(z/B)/U*mgion 1］ 45 3 876 13 310 13 440 15 862 341 176 1 86 296 299 352 7 582 100 51 34 5 4 3
取D液0.1mL置于编号为DE的试管中,供测酶活性 取D液0.1mL置于编号为Dp的试管中，供测蛋白 质含量

磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性
根据产物红色的深浅测定酚的含量
酶活性单位：37℃下15 min生成1mg酚为1个酶活性单位 每mL样品中 = 酶活性单位

碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定

碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定

2. 操作方法 2.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取 (1) 每组称取25 g牡蛎（蒸水洗净），加入50 mL
预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5， 含0.1 mol/L NaCl），（两组一起）于高速组织 捣碎机匀浆1 min，于冰箱4℃放置1 h左右进行抽 提。
45
32
65
99
134 171 210 250 339 431
实验 碱性磷酸酶的分离提取
目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术
1.原理
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase)广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。
上清液
（留3 mL上清液，待测酶的比活力。）
缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h左右。 室温离心，4000 r/m 10 min，收集离心上清液，并量体积。 （留
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点：
(1) 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。
(2) 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的 活力和比活力。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有 的酶活力单位数。唯有比活力提高较大，提纯步骤 才有效。

碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1

碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1

试剂（ml）
生理盐水 标准蛋白溶液 样品 考马斯亮蓝试剂
空白管
0.1标Biblioteka 管ABC0.1 A2液0.1 5.0 5.0 5.0 B2液0.1 5.0 C2液0.1 5.0
室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量=A样品/A标准×C标准×稀释倍数
目录
3. 结果处理与分析
结果处理表
酶活性计算 体积 (ml) A 值
目录
检测酶提取纯化的指标
1. 酶的纯度： 用比活性代表（单位重量蛋白质样品中 的活性单位） 2. 酶的回收效率 所含酶
※在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的回收率
目录
实验内容

酶的提取及比活性测定
目录
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 的分离纯化及比活性测定
[目的] 1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注 意事项 2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。
25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液）
A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性
A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度
+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （3000rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃）
蛋白含量计算 酶的总 活性 （ U） A 值
稀 释 倍 数
酶活性 (U/ml)
稀 释 倍 数
比活 酶的 性 蛋白浓度 得率 (U/mg) (mg/ml)
A 液 B液
4 2.2
100%
C液
2
目录

碱性磷酸酶km值测定实验报告

碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告 酶促反应动力学实验报告14301050154 杨恩原实验目的：1. 观察底物浓度对酶促反应速度的影响2. 观察抑制剂对酶促反应速度的影响3. 掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。

在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值。

底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示即：式中Vmax为最大反应速度，Km 为米氏常数，[S]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km 是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。

但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。

若将米氏方程变形为双倒数方程，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。

将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。

二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。

酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。

可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。

竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。

非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。

本实验选取Na2HPO4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。

实验步骤：实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响1. 取试管9支，将/L基质液稀释成下列不同浓度：管号试剂2. 另取9支试管编号，做酶促反应：管号试剂3. 混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。

碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。

AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。

测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。

自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。

标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。

粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。

2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。

测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。

3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。

8碱性磷酸酶比活力测定


（3）消得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
酶液（mL）
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
各管加入1.0 mL
各管加入0.2 mL
各0.50mL
混匀，37℃，5分钟
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
各管加入2.0 mL
0.1mL
蛋白浓度测定
1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值； 2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。
蛋白浓度测定前处理
1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）
12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照
管号 5 mM pNPP(mL)
空白（01-04） 1-1 2-2 各0.2mL
3-3 4-4
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）

实验六 鸡肝脏碱性磷酸酶活力测定


2
0.4(0.8) 0.4(0.8) 1.0 1.0 1.0(0.9)(0) 1.0(0.1) 0.1 0.1 37℃水浴中保温5分钟
样品
0.10
--
(2) 加入样品后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37℃水浴 中准确保温10分钟。 (3) 保温结束，立即加碱性溶液1.0mL终止反应，随后在2号补加样品液。 (4) 各管分别加入4-氨基安替比林1.0 mL，铁氰化钾2.0mL，充分混匀， 放置10分钟，以2号空白管作对照，于510nm波长处比色测定，根据酚 标准曲线计算酶活性。
2. 酚标准曲线的绘制
取洁净干燥试管6支，按下表依次加入试剂。
试剂（mL） 酚标准(1 µmol/mL) 蒸馏水 1 2 3 0 0.05 0.1 2.0 1.95 1.9 室温5min 碱性溶液（0.1M NaOH） 1 1 1 4-氨基安替比林（0.3%） 1 1 1 铁氰化钾（0.5%） 2 2 2 4 5 6 0.2 0.3 0.4 1.8 1.7 1.6 1 1 2 1 1 2 1 1 2 7 8 0.5 0.6 1.5 1.4 1 1 2 1 1 2
放置10分钟，以1号空白管作对照，于510nm波长处比色测定。
3、酶促反应。
（1）取3支EP管，作好标记。按下表操作。 样品1为鸡肝脏提取物。 样品溶液在加入到反应管也保温5分钟。 试剂（mL） 1 0.04mol/L 磷酸苯二钠液 pH10，0.1mol/L碳酸盐缓冲液 蒸馏水 100mmol/L Mg2+Cl2
实验六
1、实验原理
碱性磷酸酶比活力的测定
在最佳温度、pH时，酶催化底物发生化学反应。可以 通过测定单位时间内反应物的减少或者产物生成的多 少来判定酶的活力和比活力。
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（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）
3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系 （Lambert--Beer定律）：
当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D） 与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度 （I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这 就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定 律。
4. 待测溶液浓度的计算：
蛋白浓度按下式计算：
100g / mL牛血清白蛋白 ＝ C未知
OD280
OD280
数据处理
单位时间0.1mL酶液催化产物量计算： 克分子消光系数法
PNP 1 mol / L(1cm光程)＝C未知
OD40（5 8.8 103）
OD即Βιβλιοθήκη C未知＝OD/(8.8103)
计算：
酶活力(U/mL) = B t V1
（3）消光系数法：
1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
（1）标准管法：
在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D） 值，然后计算：
C未知 =（D未知/D标准）×C标准
（2）标准曲线法：
分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列 浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。 在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D） 之间呈直线关系。以各管D为纵坐标，C为横坐标，绘 制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。
酶液（mL）
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
各管加入1.0 mL
各管加入0.2 mL
各0.50mL
混匀，37℃，5分钟
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
各管加入2.0 mL
0.1mL
蛋白浓度测定
1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值； 2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。
蛋白浓度测定前处理
1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）
12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照
管号 5 mM pNPP(mL)
空白（01-04） 1-1 2-2 各0.2mL
3-3 4-4
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
A
蛋白浓度(mg/mL)= C A V2
式中：A为稀释倍数，B为由消光系数法计算得的 pNP mol数，t为反应时间，C为测得的蛋白mg数， V1为测定酶活力所用的酶量(mL数) V2为测定酶活力 所用的酶量(mL数)
酶的比活力（U/mg）＝ 酶活力(U/mL)/ 蛋白浓度(mg/mL)
纯化倍数=各步比活力/第一步比活力 得率%=各步总活力 100/第一步总活力
碱性磷酸酶比活力的测定
一、目的要求
1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.掌握碱性磷酸酶比活测定的方法
二、原理
（一）、比色分析法
1. 物质的颜色和波长： 可见光：波长（λ）400—760nm 紫外光：λ小于400nm 红外光：λ大于760nm
光的互补示意图
2. 溶液的颜色和光吸收的关系：
溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜 色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相 互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。