扫描电镜细菌制样方法

扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。

二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

后固定：1% 锇酸固定液，固定1-2小时。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。

＊整个过程，样品不要暴露于空气。

1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。

四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。

五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。

用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。

玻片过大或者过厚影响观察效果。

2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。

3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。

离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。

样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。

4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。

将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。

（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。

5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。

扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。

而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。

因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。

扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。

例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。

我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。

此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。

主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。

此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。

如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。

另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。

对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。

但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。

∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。

∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。

样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。

而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。

但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。

扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。

一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。

细胞扫描电镜制样方法：
1.清洗：某些生物材料表面常附血液、细胞碎片、消化道内的食物残渣、细菌、淋巴
液及粘液等异物，掩盖着要观察的部位，因而，需要在固定之前用生理盐水或等渗缓冲液等把附着物清洗干净。

亦可用5%碳酸钠冲洗或酶消化法去除这些异物。

2.固定：通常采用醛类（主要是戊二醛和多聚甲醛）与四氧化锇双固定，也可用四氧
化锇单固定。

四氧化锇固定不仅可良好地保存组织细胞结构，而且能增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图象的质量。

为增强这种效果，可用四氧化锇-单宁酸或是四氧化锇-珠叉二胼等反复处理材料，使其结合更多的重金属锇，这就是导电染色。

3.干燥：固定后通常采用临界点干燥法。

其原理是：适当选择温度和压力，使液体达
到临界状态(液态和气相间界面消失)，从而避免在干燥过程中由水的表面张力所造成的样品变形。

对含水生物材料直接进行临界点干燥时，水的临界温度和压力不能过高（37.4℃,218帕）。

通常用乙醇或丙酮等使材料脱水，再用一种中间介质，如醋酸戊酯，置换脱水剂，然后在临界点干燥器中用液体或固体二氧化碳、氟利昂13以及一氧化二氮等置换剂置换中间介质，进行临界干燥。

4.喷镀金属：将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然
后放在真空蒸发器中喷镀一层50～300埃厚的金属膜，以提高样品的导电性和二次电子产额，改善图象质量，并且防止样品受热和辐射损伤。

如果采用离子溅射镀膜机喷镀金属，可获得均匀的细颗粒薄金属镀层，提高扫描电子图象的质量。

细菌样品前处理取液体或固体培养基中培养20h左右、旺盛生长的菌体。

（1)收集菌体:①液体培养基中的菌体，可取培养液8000rpm离心3～5min，弃上清,倒入2。

5％戊二醛固定液;②固体培养基上的菌体，可在菌落表面滴几滴戊二醛固定液,轻刮菌落（注意不要刮下培养基)。

将菌液吸入小离心管，离心后换入新鲜戊二醛固定。

(2）固定，脱水按常规方法。

2.5%戊二醛,2～4h→磷酸缓冲液清洗3次→1%锇酸4～6h →缓冲液清洗3次→乙醇梯度脱水，30％,50％,70%,85％，95％各一次,100％乙醇2次,15～20min/次→乙酸异戊酯置换2次,20min/次（注意：每步均需离心,8000rpm，3～5min，弃上清，倒入下一种试剂，滴管来回吸几下,打散菌块）。

（3）临界点干燥：普通定性滤纸裁成35mm×18mm的纸条,将长边35mm平均分成3份，对折成小纸包,用订书钉将一端订牢,成小口袋状.将离心浓缩后的菌液滴入小纸包,立即用钉书器将另一端钉牢。

放入临界点干燥器样品室,进行CO2临界点干燥。

一般每次可同时处理10~20种不同菌样(注意，需用液态CO2置换2～3次）。

(4）离子溅射金：沿两端书钉剪开滤纸包，将干燥后粉末状纯菌体倒入平皿，轻摇尽量分散菌体。

碳导电胶带一面粘在1/4盖玻片上，另一面倒扣轻压在菌体粉末上,翻正后用镊子或牙签将菌体轻轻刮薄铺平。

离子溅射金后,即可进行扫描电镜观察。

细菌样品特殊制备方法；1，固体培养基中的菌体用镊子夹一小块盖玻片，轻轻放在旺盛生长的菌体上，粘附一定的细菌.然后用双面胶将此盖玻片贴在棕色瓶瓶盖内壁，在棕色瓶内加入适量1％锇酸，盖上含有样品的瓶盖,熏蒸固定2h以上。

然后用双面胶将盖玻片粘在样品台上，喷金,进行扫描电镜观察。

2，液体培养基中的菌体取一定的培养液，8000rpm离心3~5min,弃上清液，加入2.5％戊二醛固定2h,pH 7。

2磷酸盐缓冲液清洗，然后加入蒸馏水稀释，充分混合后用滴管取混合液一滴于小块盖玻片上，吸附2min，用滤纸吸去多余溶液。

细菌样品冷冻干燥制样方法
1) 取样：取大量样品离心（转速3000r~4000r），去除上清液，加入适当PH（7.2~7.4）的0.1 M PBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。

2) 固定：2.5%戊二醛固定3h（此步时间非绝对，1~12h都可），用PBS清洗两遍，每遍10min。

再用纯水清洗两遍。

3) 梯度脱水：用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水，每步15min，之后在100%乙醇的水溶液中脱水15min×2 次；再将样品置于乙醇和叔丁醇1:1混合液中15min；最后置样品于叔丁醇中15min×2次。

（此步也可以尝试不做）4) 冷冻干燥：滴加处理好的样品于5*5 mm的盖玻片上，置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。

5) 电镜观察：样品充分干燥后，进行扫描电镜观察。

2.5%戊二醛：
Step 1:
0.2M磷酸缓冲液的配制：（0.1M的就是稀释2倍）取50mL定容100mL
---------------------
磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克
双蒸馏水加至500毫升
pH调至7.4
Step 2:
戊二醛固定液的配制：
---------------------
25% 戊二醛1ml
双蒸馏水4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液5ml
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4。

扫描电镜S E M制样步骤-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN扫描电镜观察制样步骤固定：1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中,2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时3、置于 4℃冰箱中固定12小时。

冲洗：用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。

每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。

Or 离心脱水：分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟，干燥：将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。

粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上预处理好的样品放入干净离心管中待检。

SEM上机测样--测定条件参数设置分子克隆实验指南第三版，1568页：25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制；先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需：0.1mol/L K2HPO4，80.2ml0.1mol/L KH2PO4，19.8ml混合即是，不用酸碱调PH。

参考文献：DOI:?10.1021/es902165yMicrobial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilmSelecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterizationA severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer2。

扫描电子显微镜样品制备技术韩玉泽扫描电子显微镜样品制备技术扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子,一般扫描电镜图象均为二次电子图象.由于扫描电镜具有高分辨率,景深长等特点,故其图象层次丰富,立体感强,可显示细胞和组织的三维结构形貌,故广泛应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察.近年来,扫描电镜所取得的迅速发展表明,仪器本身性能如分辨力和多功能等的不断提高固然重要,但样品制备技术的改良和日趋完善,对扫描电镜的应用与发展确实起到了积极促进作用,因此样品制备的质量,是直接决定扫描电镜能否发挥最佳性能并排除理想图片的关键所在.所以,自1966 年第一台商品扫描电镜诞生以来,扫描电镜样品制备技术问题,一直是电镜工作者们苦心钻研,不断创新的一个重要领域扫描电镜生物样品制备的基本要求生物样品与金属﹑矿物材料不同,它具有质地柔软,容易变形﹑导电性能差﹑二次电子发射率底以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点.因此,在对于高真空状态下的生物针对生物样品的特殊性,在进行扫描电镜样品制备时,一般要掌握以下原则:(一)每一操作过程,都应注意防止对样品的污染和损伤,使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构.(二)去除样品内水份,以利于维持扫描电镜的真空度和防止对镜(三)降低样品表面的电阻率,增加样品的导电性能,以提高二次电子发射率,建立适当的反差和减少样品的充放电效应.(四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造,都应注意确认和保护样品的观察面.二、SEM生物样品制备的基本操作程序在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品）需要采用某些特殊制备技术者（如管道铸型扫描、低电压观察法等）以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。

SEM生物样品制备的基本程序（一）取材SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。

扫描电镜样品制备方法一、取材组织块小于3立方毫米（单细胞培养或收集展片于盖玻片或滤膜上）。

二、固定前固定：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间。

用0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液漂洗三次，每次10分钟。

三、脱水＊脱水在4度冰箱内进行，所有脱水步骤建议在专用的冷冻干燥杯中进行，冷冻干燥杯请于实验前一天到电镜室领取。

＊整个过程，样品不要暴露于空气。

1.乙醇脱水，每一级10-20分钟：30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇；2.然后从乙醇逐步过渡到叔丁醇，纯叔丁醇每次10分钟，3次以上；此系列操作均在25度环境中进行；3.纯叔丁醇4度冰箱过夜，样品结晶。

四、冷冻干燥＊需事先预约冷冻干燥时间；第二天上午八点半讲冷冻结冰的样品用冰盒送至电镜室进行冷冻干燥。

五、喷金附件1：细菌类样品的前处理方法1.盖玻片泡酸，清洗，烘干。

用剪刀剪碎，挑出5mm*5mm大小玻片备用。

玻片过大或者过厚影响观察效果。

2.菌液或样品悬液离心，需要可进行清洗，加入固定液，吹散固定，于4度冰箱固定2小时左右。

3.固定结束后，去固定液，加入PBS浸泡清洗，10分钟。

离心去PBS，固体沉淀根据量多少，加入适量PBS，制成浓度较高的悬液（目测较混浊）。

样品浓度对后期吸附有较大影响，浓度过低可能吸附量会很少。

4.取鸡蛋清，稀释3-5倍（一定要稀释！蛋清过浓会包裹样品），之前准备好的玻片放入液体内蘸一下，取出晾干至触摸感觉有点黏的状态（快干的状态）。

将第3步取得的悬液滴在玻片上，吸附30秒到1分钟，用滤纸吸去多余液体。

（样品悬液在玻片上停留时间过长将导致样品被蛋清完全包裹而无法观察）。

5.在玻片上滴加固定液，固定10分钟，固定后用PBS浸泡清洗10分钟，放入干燥杯开始进行脱水。

磷酸盐缓冲液(PBS)a.磷酸盐缓冲液（0.2M）甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液Na2HPO42H2O 35.61g (Na2HPO47H2O) 53.65g (Na2HPO412H2O) 71.64g NaH2PO4H2O 27.60g ( NaH2PO42H2O) 31.21g加蒸馏水溶解成1000ml 加蒸馏水溶解成1000ml按下表混合甲、乙两液既得所需pH的0.2M缓冲液0.2M磷酸盐缓冲液的配制将溶液用蒸馏水1：1稀释，则配得0.1M的缓冲液。

扫描电镜制样步骤
生物样品（如动植物、细胞）需进行1-7步骤的操作（耗时长）
干燥的非导电样品（如花粉、制剂粉末、塑料等）无需进行1-5步骤操作而粘于样品台喷金再于电镜观察即可
导电样品（如金属样品）直接粘于样品台电镜观察，无需1-7步
注：取材时所需2.5%戊二醛溶液、0.1M PH7.0磷酸盐缓冲液需自行配置，配方详见《电镜固定液、缓冲液、染液配方》
送样前请先与我们联系以安排时间在我处制样。

生物样品制样耗时，请安排好个人时间
生物样品（小于1cm3）于2.5%戊二醛溶液4℃固定过夜，再按下列步骤操作：
1、漂洗：弃去戊二醛固定液，用0.1M PH7.0磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次15min
2、1%饿酸固定1-2h（通风厨操作）
3、漂洗：弃去饿酸固定液，用0.1M PH7.0磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次15min
4、梯度洗脱：50%、70%、80%、90%、95%系列浓度的乙醇溶液梯度脱水各15min，
再用100%的乙醇脱水2次每次20min
注：样品较大延长脱水时间
5、乙醇：醋酸异戊酯=1:1（V:V）处理30min，再用纯醋酸异戊酯处理1-2h
注：通风厨操作
相容性较差，需用醋酸异戊酯置换
乙醇、丙酮等脱水剂与CO
2
6、自然干燥/临界点干燥（英国EMTIECH K850）
7、日立E1010型离子溅射仪喷金30s，利用导电碳胶将样品固定于样品台，调节样品台高度，
8、日立S-3000N扫描电镜观察。

以大肠杆菌为例：1.固定及脱水生物样品的精细结构易遭破坏，因此在进行制样处理和进行电镜观察前必需进行固定，以使其能最大限度地保持其生活时的形态。

而采用水溶性、低表面张力的有机溶液如乙醇等对样品进行梯度脱水，也是为了在对样品进行干燥处理时尽量减少由表面张力引起的其自然形态的变化。

将处理好的、干净的盖玻片，切割成4~6 mm2的小块，将待检的较浓的大肠杆菌悬浮液滴加其上，或将菌苔直接涂上，也可用盖玻片小块粘贴菌落表面，自然干燥后置光学显微镜镜检，以菌体较密，但又不堆在一起为宜；标记盖玻片小块有样品的一面；将上述样品置于1%~2%戊二醛磷酸缓冲液（pH7.2左右）中，于4℃冰箱中固定过夜。

次日以0.15%的同一缓冲液冲洗，用40%、70%、90%和100%的乙醇分别依次脱水，每次15 min。

脱水后，用醋酸戊脂置换乙醇。

另一种与之类似的样品制备方法是采用离心洗涤的手段将菌体依次固定及脱水，最后涂布到玻片上。

其优点是：①在固定及脱水过程中可完全避免菌体与空气接触，从而可最大程度地减少因自然干燥而引起的菌体变形；②可保证最后制成的样品中有足够的菌体浓度，因为涂在玻片上的菌体在固定及干燥过程中有时会从玻片上脱落；③确保玻片上有样品的一面不会弄错。

2.干燥将上述制备的样品置于临界点干燥器中，浸泡于液态二氧化碳中，加热到临界点温度（31.40，72.8个大气压）以上，使之气化进行干燥。

样品经脱水后，有机溶剂排挤了水分，侵占了原来水的位置。

水是脱掉了，但样品还是浸润在溶剂中，还必需在表面张力尽可能小的情况下将这些溶剂“请”出去，使样品真正得到干燥。

目前采用最多、效果最好的方法是临界点干燥法。

其原理是在一装有溶液的密闭容器中，随着温度的升高，蒸发速率加快，气相密度增加，液相密度下降。

当温度增加到某一定值时，气、液二相密度相等，界面消失，表面张力也就不存在了。

此时的温度及压力即称为临界点。

将生物样品用临界点较低的物质置换出内部的脱水剂进行干燥，可以完全消除表面张力对样品结构的破坏。