实验八、转基因生物的GUS检测

GUS报告基因范文GUS报告基因是一种用于筛选转基因植物的报告基因。

它在植物细胞内表达的酵素β-葡萄糖苷酶（β-Glucuronidase，GUS），能够将葡萄糖醛酸（X-Gluc）转化为蓝色产物。

通过观察和分析植物组织的GUS活性，可以判断是否发生了基因转化。

下面将详细介绍GUS报告基因的特点、应用以及实验方法。

1.GUS报告基因的特点（1）GUS基因来自于大肠杆菌，它很少在真核生物中表达，因此不会对植物正常生长发育产生影响。

（2）GUS基因编码的酵素活性能够方便、快速地用染色剂标记出来，实验结果直观可见。

（3）转GUS基因的步骤相对简单，转化率较高，且不需要使用昂贵的设备。

2.GUS报告基因的应用（1）植物转基因筛选：通过观察和分析转基因植物的GUS活性，可以确定哪些植株成功地转化了外源基因。

（2）基因调控研究：GUS报告基因可以用来研究目的基因的表达调控机制，例如在转基因植物中瞬时表达GUS基因，观察其在各种组织和发育阶段的表达情况，可以推测目的基因的启动子活性。

（3）信号传导途径研究：通过构建GUS基因的操纵，可以研究植物信号传导途径中特定基因的表达情况，进而了解信号传导途径的效率和调节机制。

3.实验方法以下是GUS报告基因实验的一般步骤：（1）构建GUS载体：将GUS基因与适合的植物表达载体进行连接，形成GUS转化载体。

（2）遗传转化：将GUS转化载体导入要进行转基因植物研究的植物细胞中，使用适当的生物技术方法（如冲击法、农杆菌介导法）实现遗传转化。

（3）植物筛选：选择经过转化的植株进行分析，通常可以通过PCR、Southern blot、Western blot等技术检测GUS基因的存在。

（4）组织切片染色：收集不同部位的植物组织，例如叶片、根、花等，制作切片。

使用X-Gluc作为底物加入切片中，观察蓝色染色产物的形成。

（5）定量分析：通过测定GUS活性，使用亲合素、含有底物的液体培养基等方法，可以 quantitatively 地测定GUS酶活性。

gus 基因PCR 反应程序： 94℃预变性5 min 94℃变性1 min58℃退火1 min 30个循环 72℃延伸2min 72℃延伸7 mingus 基因引物序列为：5’GCTATACGCCTTTGAAGCC 3’和5’TTGACTGCCTCTTCGCTGTA 3’GUS 染色母液:X-Gluc 由DMSO 溶解，贮存浓度为l0mg/mL,于-20°C 保存。

GUS 染液:500mg/L X-Gluc, 0.1mol/L K3Fe(CN)6，0.lmol/L K4Fe(CN)6，0.0lmol/L ，的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml●这是1ml的配方体系：终浓度药品分子量体积0.5M Na2EDTA 20ulTritonX-100 1ul1M 磷酸钠缓冲液（PH7.0） 100ul0.1M K3Fe(CN)6 5ul0.1M K4Fe(CN)6 5ul10mg/ml X-Gulc 200ul去离子水或无菌水669ul染液配方0.05M磷酸缓冲液 4.48ml 5mM铁氰化钾0.05ml, 5mM亚铁氰化钾0.05ml，Triton-100 0.01ml，水4.64ml，X-Gluc先溶于0.05ml DMF中，终浓度为0.5mg/ml37度染色过夜1.2染色步骤1)染色：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。

2)漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。

3)脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。

4)记录：在体视显微镜下拍照记录。

2．GUS报导基因的定量检测GUS能与底物MUG（分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide）反应产生荧光物质MU（分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone）。

转基因植株的GUS染色1、X-Gluc 母液：100 mg X-Gluc溶于5 ml DMF中；2、基液：50 mM PBS pH7.0(NaH2PO450 mM 0.78 g/100 ml, Na2HPO450 mM 1.791 g/100 ml)溶解EDTA·2Na(10 mM, 372 mg), Triton-100(0.1％,100 μl), 铁氢化钾(0.5 mM, 16.5 mg)，亚铁氢化钾(0.5 mM, 21.1 mg)定容至100 ml；3、X-Gluc使用液：50 μl母液＋950 μl基液，混匀备用，可存放于－20℃。

取合适大小的转基因苗浸入GUS染液中，37℃染色1-24小时直到染出理想效果；吸去反应液，乙醇梯度脱色。

体视镜观察并拍照。

这是转基因植株的染色，我想也可以用来做愈伤的染色。

GUS染色protocols2007-06-11 05:25Tissue for GUS staining was gently fixed by incubation in 90% acetone, on ice, for 15 to 20 min and then rinsed in 50 mM NaPO4, pH7.2, 0.5 mM K3Fe(CN)6, and 0.5 mM K4Fe(CN)6. The tissue was then placed in staining solution (50 mM NaPO4, pH 7.2, 2 mM X-gluc[Gold Biotechnology, St. Louis, MO], 0.5 mM K3Fe[CN]6, and 0.5 mMK4Fe[CN]6), vacuum infiltrated, and incubated at 37°C overnight. After staining, the tissue was processed through an ethanol series (30, 50, 70, 85, 95, 100, and 100%), with the 50% step of the series replaced by a 1 -hr formaldehyde-acetic acid fixation (50% ethanol, 5% acetic acid, and 3.7% formaldehyde). To prepare tissue for histological analysis, we passed tissue through a xylene series and embedded it in Paraplast (Sigma). Sections (10 μm) were cut from the embedded tissue, wax was removed by a brief incubation in xylene, and sections were mounted in Paraplast. Sections were visualized using dark-field illumination. (Leslie E. Sieburth et al Plant Cell, 1997, 9, 355-365)1. 染色材料在90％的丙酮中固定15－20min2. 漂洗后，加入GUS染液，抽气，37度过夜3. 乙醇脱色（30，50，70, 95, 100％的依次梯度）后，加入FAA固定液4. 包埋，按石蜡切片步骤进行二、GUS histochemical stainingStock50mM K3Fe(CN)6 0.82315 g/50 ml50mM K4Fe(CN)6 1.056 g/50 ml1M Na2HPO4 7.1 g/50 ml1M KH2PO4 6.8 g/50 ml0.5M Na2EDTA 18.612 g/ 100ml(直接加入 NaOH crystal，調pH = 8.0 )10﹪Triton X-100 1ml/10mlStaining solution（有毒，請戴手套操作）Stock final conc. 1M Na2HPO4 100mM phosphate buffer 0.64ml1M KH2PO4 0.36ml0.5M Na2EDTA 10mM 0.2ml50mM K3Fe(CN)6 0.5mM 0.1ml50mM K4Fe(CN)6 0.5mM 0.1ml10﹪Triton X-100 0.1﹪ 0.1mlMeOH（有毒） 10﹪ 1mlx-gluc 0.3﹪ 30mg以250μl DMSO（有機溶劑）溶解，加水至1mlTotal volume 10ml1. 剪取sample，將 staining solution 加入至可淹沒sample 為止2. 抽氣5min，37℃ incubate O/N3. 以70﹪ EtOH 洗掉葉綠素。

GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。

2．实验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3．药品试剂1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100µL，保存于-20℃。

2) 底物溶液（染色液）：3) 1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM ED TA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-1004．实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器5．实验步骤1) 将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2) 37℃培养箱中温育1小时至过夜；3) 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。

6．结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。

先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+TRIT ION X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML/plsc/labs/sherrierlab/Methods_pdf/microscopy/Protocol%2 0for%20Fluorescent%20GUS%20Staining%20of%20Root%20Nodules.pdf /stockingerlab/Protocols/GUS-HistochemicalS taining.pdf/langdalelab/protocols/misc/Dex_induc_GUS_stain.p dfGus staining1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassium phosphate buffer (pH7.0) for 3 times.2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g --->200mlKH2PO4: 27.2g---->200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4----> 300ml 1M potassium phosphate b uffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide82mg0.5mMPotassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use. Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）0.2mol/L Na3PO4缓冲液(62mL0.2mol/L Na2HPO4;38mL0.2 mol/L NaH2PO4)，pH7.0；0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.1000mlx-gluc 1000mg （20ml dmso）Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11K3［Fe(CN)6:1000*0.01*M=329．26*0.01=3.3K4［Fe(CN)6]:1000*0.01*M=422．39（3H2O）*0.01=4.2Triton 1MLNa2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=371. 取5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中.2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4·H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH7.0).3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20℃冰箱内.100ml x-gluc染液配制x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso1ml triton 100Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5mlK4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1mlNaH2PO4 (0.2M) 100mM 1.9mlX-Gluc 0.1% 10ul。

实验七 GUS报告基因的检测
一、实验目的
学习转基因植物中报告基因的定性检测方法和技术。

二、实验原理
GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性的研究GUS的表达水平和表达模式，而且GUS染色的稳定性好，组织定位精确，在植物转基因过程中可作为报告基因来反映质粒侵染的情况。

三、实验仪器、药品、材料与试剂
1．仪器：37℃保温箱、电子天平、移液器、体式显微镜
2．药品与材料：Na2HPO4、Triton X-100、铁氰化钾、亚铁氰化钾、EDTA、X-Gluc、O
ddH
2
3、试剂：磷酸缓冲液
四、实验内容与步骤
1．按表1配制GUS染色的底物。

2．染色步骤
1)染色：加入适量配制好的GUS染液于24孔板的孔中，将待测样品浸到GUS
染液中，将24孔板置于37℃保温箱中放置6h。

2)漂洗：先后用50%，70%，100%的乙醇漂洗样品，每次浸泡5分钟。

3)脱色：加入100%乙醇浸泡直至完全脱色。

4)记录：在体式显微镜下拍照记录。

五、观察记载内容与实验报告
1、观察并记录转基因甜瓜/烟草愈伤组织染色情况。

2、记录转化率。

转化率=蓝色愈伤组织数/总接种愈伤组织数 *100%
表1. GUS染色底物的配制
* 0.5M Na2HPO4配制方法：将17.907g Na2HPO4溶于水，定容至100ml。

0.5M NaH2PO4的配制方法：将7.800g NaH2PO4溶于水，定容至100ml。

荧光光度计定量分析转化植株GUS基因稳定表达活性一、试剂准备：1.GUS提取缓冲液：●50mmol 磷酸钠(PH7.0)●10mmol EDTA●0.1% Triton X-100●0.1% Sarcosyl●10mmol/l β-巯基乙醇2.1mmol/L 4-MU(4-甲基伞形酮)：称取19．82mg4-MU钠盐，用1ml乙醇溶解，dH2O定容至100ml。

4℃暗处可以贮存一个月。

贮存中有可能发生结晶。

3.反应缓冲液：GUS提取缓冲液中加入1mmol/l MUG（100ml 加入35.23mg），4℃可以保存2周。

4.考马新亮旒G250溶液：lOOmg考马斯亮蓝G250溶于50m1 95％乙醇中，加lOOml磷酸，dH2O定容至1L过滤后于4℃贮存。

二、操作步骤：新鲜的植物组织6US蛋白的提取：A.取0.1g叶片样品，用液氮研磨成粉。

B.2．加入3倍体积的提取缓冲液，研成匀浆。

C.3．4000rpm离心lOmin，收集上清液，于-20℃冰箱中保存备用。

GUS蛋白提取液蛋白含量测定：1.制作标准曲线：BSA母液（ml）H2O（ml）BSA浓度（ug/ml）0.25 4.75 1.250.5 4.5 2.51.0 4.0 5.01.5 3.5 7.52.03.0 10.02.5 2.5 12.55.0 0.0 25.0配制25ug／ml BSA母液：称取2.5mgBSA，加入0.5ml提取缓冲液，用H2O定容至lOOml。

按上表制作BSA梯度液。

从中取4ml加入lml考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温下放置2min，测定595nm 的吸收值。

吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。

取植物材料GUS蛋白提取液20ul，加H2O至4ml，加入lml考马斯亮蓝，混匀，室温下放置2min。

测定595nm光吸收值根据标准曲线计算蛋白质含量。

GUS酶活反应：1. 将反应缓冲液于37℃预热。

2．取6支1.5ml离心管，各加入900ul反应终止液，编号。