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茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

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植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 579–587, doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.007——————————————————收稿日期: 2009-12-08; 接受日期: 2010-03-30基金项目: 973计划前期项目(No.2007CB116211)、国家自然科学基金(No.30771755和No.30972401)和安徽省自然科学基金(No.09041- 1006)* 通讯作者。

E-mail: xiatao62@; gaolp62@茶树实时荧光定量PCR 分析中内参基因的选择孙美莲1, 王云生2, 杨冬青1, 韦朝领1, 高丽萍2*, 夏涛1*, 单育1, 骆洋21安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室, 合肥 2300362安徽农业大学生命科学学院, 合肥 230036摘要 选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR 分析(qRT-PCR)准确性的先决条件。

该文以茶树(Camellia sinensis )芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料, 应用实时荧光定量PCR 技术, 分析了18S rRNA 、GAPDH 、β-actin 和α-tubulin 4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。

经GeNorm 和NormFinder 软件分析发现, 当利用荧光定量PCR 分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时, 可选择β-actin 作为校正内参基因; 而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时, 可以选择GAPDH 作为校正内参基因。

关键词 茶树, 实时荧光定量PCR, 内参基因孙美莲, 王云生, 杨冬青, 韦朝领, 高丽萍, 夏涛, 单育, 骆洋 (2010). 茶树实时荧光定量PCR 分析中内参基因的选择. 植物学报 45, 579–587.实时荧光定量PCR(real time fluorescence qua- ntitative PCR, qRT-PCR)实现了聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)从定性到定量的飞跃, 具有重复性好、灵敏度高、定量准确、速度快等优点, 已成为分子生物学研究中分析基因表达的重要工具(Heid et al., 1996; Haller et al., 2004; Ransbotyn and Reusch, 2006; Yoo et al., 2009)。

qRT-PCR 技术不仅应用于转基因产品的检测(Libault et al., 2008), 而且在医药等许多领域中也得到广泛应用(Boxus et al., 2005; Chain et al., 2005; Etschmann et al., 2006)。

利用qRT-PCR 方法计算基因相对表达量时, 通常需引入一个表达较为稳定的管家基因作为内参基因(reference gene)(吴文凯等, 2009)。

在植物学研究中, 常用的稳定表达的管家基因有甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos- phate dehydrogenase, GAPDH)基因(Sekalska et al., 2006)、肌动蛋白基因(actin )(Li et al., 2005; Wil-liams et al., 2005; Domoki et al., 2006)、微管蛋白基因(tubulin )(Jeong et al., 2006)和18S rRNA 等(Bustin, 2000)。

理想化的内参基因应在各种类型的组织、细胞和各种实验因素条件下均恒定表达。

然而, 近年来大量的研究结果表明, 并没有表达绝对稳定的基因, 任何一种管家基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下“有范围”的恒定(Andersen et al., 2004; 张艳君等, 2007)。

随着对定量要求的不断提高, 为了得到更可靠的实验结果, 实验中需要选择较为合适的1个或多个内参基因进行 校正。

茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)中含有丰富的次生代谢产物, 如多酚类物质、生物碱、维生素、多糖、挥发油和矿物质(Hertog et al., 1993; Park et al., 2004), 具有抗氧化、抗菌、抗病毒和抗过敏等一系列药理功能(Cabrera et al., 2006; Ho et al., 2009; Ko et al., 2009)。

目前, 利用分子生物学研究手段揭示茶树次生代谢途径及其调控机理已成为研究热点(Zaprometov and Zagoskina, 1987; Matsu-moto et al., 1994; Takeuchi et al., 1994; Park et al., 2004; 夏涛和高丽萍, 2009)。

马春雷(2007)以β-actin 为内参基因对茶树中类黄酮合成相关的7个基因进行了RT-PCR 表达分析。

此外, 利用qRT-PCR 技术开展·技术方法·580 植物学报 45(5) 2010茶树基因的表达水平分析已有报道, 如赵丽萍等(2006)以茶树鲜叶为材料, 对与茶叶香气密切相关的2个基因进行定量表达分析。

但目前有关茶树内参基因选择的研究国内外鲜见报道。

本文以茶树不同组织(芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织)为材料, 利用qRT-PCR技术开展18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin4个内参基因的表达量分析, 并利用GeNorm(Vandesompele et al., 2002)和Norm- Finder(Andersen et a l., 2004)分析软件对4个内参基因在茶树各器官中的表达变化进行比较分析, 以期筛选出表达最稳定的内参基因, 为进一步开展茶树次生代谢的分子生物学研究奠定方法学基础。

1材料与方法1.1 材料本研究以茶树(Camellia sinensis(L.) O. Kuntze)的芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料。

其中, 茶树的芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣和种子采自安徽农业大学试验茶园; 茶树愈伤组织为本实验室筛选的“云茎63Y”, 外植体为云南大叶种的嫩茎。

样品采集后液氮速冻, –80°C贮藏备用。

1.2 总RNA的提取利用改良的CTAB法(史成颖等, 2007)提取茶树芽、叶的总RNA; 利用本课题组改进的简易CTAB-LiCl法提取茶树幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织的总RNA。

简易CTAB-LiCl法操作步骤如下: 取适量材料于液氮中研磨成粉末(研磨时加入少量PVPP), 迅速转移至加有0.9 mL CTAB提取液和45 μL β-巯基乙醇的离心管中; 充分混匀, 于65°C水浴30分钟, 间歇颠倒混匀; 4°C、12 000×g离心10分钟; 吸上清液于新的预冷离心管中; 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1, v/v/v), 温和混匀, 于4°C冰箱中放置10分钟, 4°C、12 000 × g离心10分钟, 吸上清液于新的预冷离心管中(注意不能吸取到中间层); 重复上一步; 加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1, v/v), 温和混匀, 4°C、12 000 ×g离心15分钟, 吸取上清液于新的预冷离心管中, 加入1/3体积的8 mol·L–1 LiCl, 再加入占总体积1%的β-巯基乙醇; 混匀, 于–20°C放置过夜; 4°C、13 000 × g离心30分钟, 弃液相, 沉淀用75%乙醇洗涤2次; 干燥后溶于30 μL DEPC-H2O中, –80°C保存备用。

利用核酸定量仪和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。

1.3 反转录合成cDNA第一链按照RevertAid TM First-Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(Fermentas公司)操作方法, 将各样品总RNA 反转录合成cDNA第一链。

获得的cDNA产物直接用于PCR或–20°C贮藏备用。

1.4 PCR引物设计根据定量PCR引物的设计原则, 利用Primer Premier 5.0软件, 分别设计18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin 4个内参基因的定量PCR引物。

引物序列见表1, 由英骏生物技术有限公司合成。

1.5 目的基因片段的普通PCR扩增PCR反应体系中分别加入2.5 μL 10×PCR buffer、1.5 µL 25 mmol·L–1 MgCl2、0.5 μL 10 mmol·L–1 dNTPs、0.5 μL 10 µmol·L–1 forward primer、0.5 μL 10表1 Real-time RT-PCR检测中所用的4个内参基因的引物序列Table 1Primer sequences of four reference genes used in real-time RT-PCR analysisGene name Genesymbol Forward primer (5’–3’) Reverseprimer(5’–3’) Ampliconsize (bp)Ribosomal RNA 18S 18S rRNA CGGCTACCACATCCA-AGGAA GCTGGAAT-TACCGCGGCT191Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase GAPDH TTGGCATCGTTGAGG-GTCTCAGTGGGAACACG-GAAAGC206Beta actin β-actin GCCATCTTTGATTGGAATGG GGTGCCA-CAACCTTGATCTT175Tubulin alpha α-tubulin TCCAAACTAACCTTG-TGCCATAC ACACCCTTGGGTAC-TACATCTCC220孙美莲等:茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择 581µmol·L–1 reverse primer、0.2 μL 5 U·μL–1Taq和1 μL 模板, 加无菌水补至总体积25 μL。

反应条件为: 95°C 预变性3分钟; 95°C变性30秒, 62°C退火30秒, 72°C 延伸30秒, 40个循环; 72°C延伸7分钟。

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实时荧光定量PCR详细操作步骤

实时荧光定量PCR详细操作步骤

实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。

所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。

反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。

反转录反应条件如下。

37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。

1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

全班40人，分为5组，每组做8管。

4管做BDNF，4管做18S rRNA。

4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。

每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。

2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。

PCR进行35个循环。

步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒
95°C 0秒0.1°C/秒。

PCR内参：选还是不选？,PCR内参,RT

PCR内参：选还是不选？,PCR内参,RT

PCR内参：选还是不选？,PCR内参,RT生物帮> 专题> 实验技术> 分子> PCR内参：选还是不选？导读：内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。

常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。

本专题就PCR实验中遇见的有关于内参的一些问题作出总结，以供读者参考。

PCR内参基因介绍GAPDH简介内参基因β-Actin简介实时荧光定量PCR 中内参基因的选择内参基因的概念和作用PCR内参基因介绍基因表达转录分析中内参基因的选择目前基因表达的转录分析多采用单一看家基因作为内参来校正目标基因的表达量.实验中以人肝癌BEL-7402细胞为研究对象，应用[详细]海带配子体18S rRNA 基因作为内参基因的应用通过基因克隆和序列测定,获得了海带( Laminaria japonica) 配子体的18S rRNA 基因序列,其长度为1 716bp ,GenBank 登录号为EU293553。

以蓝[详细]白纹伊蚊β2肌动蛋白基因片段作为基因表达内参目的获取白纹伊蚊β2肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用。

方法根据昆虫β2肌动蛋白核苷酸序列[详细]常用的内参基因及其使用范围包括GAPDH 、β- actin(BETA-actin) 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。

[详细]常用的β-actin 引物序列常用的β-actin 引物序列[详细]RT-PCR常用引物序列引物应该用TE稀释。

oligo在酸性条件下是不稳定的，容易降解，如果用水溶解引物，无法保证pH值，如果合成引物纯化不好，造[详细]PCR内参常见问题汇总内参能跑出来但为何我的cDNA总是不稳定？我要做荧光定量试验，师姐做的定性，我能共用RT-PCR电泳照片有问题qPCR 目的基因与内参是不是要在同样体系里扩增斑马鱼的内参基因组怎么选择啊绝对定量需要用到内参基因吗选择内参基因的原则PCR内参常见问题汇总RT-PCR内参基因选择：除了β-actin还能用什么？实时定量PCR试验中，内参对于实验具有重要意义。

茶树WRKY19_基因的克隆及其抗寒功能研究

茶树WRKY19_基因的克隆及其抗寒功能研究

茶叶学报 2024，65 （1）：20−27Acta Tea SinicaDOI：10.20045/ki.issn.2096-0220.2024.01.003引文格式：郭珺珺，伊亮辉，肖清，等. 茶树WRKY19基因的克隆及其抗寒功能研究［J］. 茶叶学报，2024，65（1）：20−27.茶树WRKY19基因的克隆及其抗寒功能研究郭珺珺†，伊亮辉†，肖　清，夏恩华，童　伟*（安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽　合肥　230036）摘　要：【目的】茶树作为一种喜温畏寒植物，低温严重制约茶产业的发展。

茶树WRKY19基因的克隆及抗寒功能研究为其抗逆工程育种提供重要理论依据。

【方法】基于前期对茶树WRKY基因家族的鉴定，本研究筛选并克隆得到一个受低温诱导显著上调表达的WRKY转录因子，将其命名为CsWRKY19。

对CsWRKY19进行序列特征分析并结合基因表达抑制试验初步研究其在茶树抗寒中的功能。

【结果】CsWRKY19基因 CDS全长为1 680 bp，编码559个氨基酸；包含2个典型的WRKYGQK保守基序；定量PCR分析表明CsWRKY19表达具有组织特异性，在根和幼嫩芽叶中高表达并受冷驯化诱导显著上调表达；经反义寡核苷酸抑制CsWRKY19表达后，茶树叶片在低温下的损伤程度显著加剧、丙二醛含量显著增加、超氧化物歧化酶活性降低，初步证明CsWRKY19在茶树应答低温胁迫中可能具有重要作用。

【结论】本研究鉴定了一个茶树转录因子CsWRKY19，并初步验证了其在茶树应对低温胁迫中的潜在功能。

关键词：茶树；CsWRKY19；低温胁迫；表达分析；功能研究中图分类号：文献标志码：A文章编号：2096−0220（2024）01−0020−08Identification of CsWRKY19 Involving Cold Tolerance of Tea PlantsGUO Jun-jun† , YI Liang-hui† , XIAO Qing , XIA En-hua , TONG Wei*(State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036, China) Abstract：【Objective】CsWRKY19 in Camellia sinensis was cloned to study its relationship with the adaptation and survival of the normally cold sensitive plant exposed to low temperatures. 【Method】Based upon previously identified WRKY family in tea plants, CsWRKY19showing significant upregulation by low temperatures was screened and cloned.Sequence and expressions of the gene in different tissues under cold stress were determined. By suppressing the expression, the ability of a tea plant to tolerate low temperatures was examined for verification. 【Result】CsWRKY19 had a full CDS of 1,680 bp encoding 559 amino acids and containing 2 typical WRKYGQK conserved motifs. The tissue-specific expression of the gene was relatively high in the buds, young leaves, and roots of a plant. Exposing the plant to low temperatures significantly upregulated the gene expression, and if the expression was suppressed at the same time, worse damage on the leaves resulted. Meanwhile, as the surrounding temperature was lowered, the malondialdehyde content rose significantly and the superoxide dismutase activity declined in the plant. 【Conclusion】The transcription收稿日期：2024−01−03初稿；2024−02−20修改稿基金项目：安徽农业大学大学生创新创业训练计划项目（X202210364672）；安徽省高等学校科学研究项目（自然科学类）重点项目（2022AH050867）。

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介

实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。

但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。

因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。

如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threhhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=a某+b，某代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。

传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。

下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。