联合应用激光捕获显微切割技术及乙酰化稳定同__记定量技术在结直肠癌蛋白质组学

ｄｏｉ：１０．３９７１／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－８５７８．２０１２．０８．０１０收稿日期：２０１２－０２－２２；修回日期：２０１２－０５－１５基金项目：高等学校博士学科专项科研基金资助项目（２００８００１０００９８）；国家自然科学基金资助项目（８１１７２２７２，８１０７２０１８）作者单位：１．２６６００３山东青岛，青岛大学医学院附属医院普外科；２．北京大学人民医院胃肠外科通信作者：王杉，Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｋｕｗａｎｇｓｈａｎ＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ作者简介：吕亮（１９７５－），男，硕士，主治医师，主要从事胃肠道肿瘤的基础与临床研究联合应用激光捕获显微切割技术及乙酰化稳定同位素标记定量技术在结直肠癌蛋白质组学研究中的价值吕　亮１，张彦斌２，禚洪庆２，张　辉２，姜可伟２，叶颖江２，王　杉２Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　Ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｂｙ　Ｌａｓｅｒ　Ｃａｐｔｕｒｅ　Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈＡｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ　Ｓｔａｂｌｅ　Ｉｓｏｔｏｐｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｉｎ　Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ＣａｎｃｅｒＬｖ　Ｌｉａｎｇ１，Ｚｈａｎｇ　Ｙａｎｂｉｎ２，Ｚｈｕｏ　Ｈｏｎｇｑｉｎｇ２，Ｚｈａｎｇ　Ｈｕｉ　２，Ｊｉａｎｇ　Ｋｅｗｅｉ　２，Ｙｅ　Ｙｉｎｇｊｉａｎｇ２，Ｗａｎｇ　Ｓｈａｎ２１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｔｈｅ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｑｉｎｇｄａｏ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６００３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｅｏｐｌｅ′ｓ　ＨｏｓｐｉｔａｌＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　Ａｕｔｈｏｒ：Ｗａｎｇ　Ｓｈａｎ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｋｕｗａｎｇｓｈａｎ＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒｓ　ｂｙ　ｐｒｏ－ｔｅｏｍｉｃｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｗｅｎｔｙ　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｃｅｌｌ　ｏｆ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ－ｉｎｇ　ｎｏｒｍａｌ　ｍｕｃｏｓａ，２０　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｖｉｌｌｏｕｓ　ａｄｅｎｏｍａ　ａｎｄ　８　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｌａ－ｓｅｒ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｐｒｏ－ｔｅｏｍｉｃ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ　ｓｔａｂｌｅ　ｉｓｏｔｏｐｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｅｉｇｈｔ　ｈｕｎｄｒｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｖｅｎｔｙ－ｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　１３７，１１９　ａｎｄ７７　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎ－ｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｍｕｃｏｓａ　ｏｒ　ｖｉｌｌｏｕｓ　ａｄｅｎｏｍａ　ｏｒ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＣｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃｏｖｅｒｅｄ　ａ　ｗｉｄｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ　ｍａｎｙ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｉｔ　ｍｅａｎｓ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｈａｖｅ　ａ　ｗｉｄｅ　ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｖｅｒａｇｅ　ａｎｄｍａｙ　ｂｅｃｏｍｅ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｓｔｕｄｙ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｎｅｏｐｌｓａｍｓ；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；Ｌａｓｅｒ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ；Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｌａｂｅｌｉｎｇ摘　要：目的　应用蛋白质组学技术，建立结直肠癌蛋白质组差异表达谱，筛选结直肠癌发生发展相关差异蛋白质。

方法　应用激光捕获显微切割技术，获取２０例结直肠腺癌及配对的正常黏膜、２０例绒毛状腺瘤、８例结直肠癌肝转移灶的靶细胞；然后应用基于乙酰化稳定同位素标记的定量蛋白质组学策略寻找差异蛋白。

结果　获得具有定量信息的高可信度蛋白８７３个。

其中腺癌与正常黏膜、腺瘤及肝转移灶之间差异显著的蛋白质（定量比值≥２或≤０．５）分别为１３７、１１９和７７个。

结直肠癌与正常黏膜之间的差异蛋白在定位上几乎分布于细胞的各个部位。

结论　联合应用激光捕获显微切割技术及乙酰化稳定同位素标记定量技术进行结直肠癌蛋白质组学研究，发现的差异蛋白功能上参与多种生物学过程，表明本研究所采取的技术策略有很好的蛋白鉴定覆盖率，可成为研究肿瘤蛋白质组学的有效策略。

关键词：结直肠肿瘤；蛋白质组学；激光捕获显微切割技术；乙酰化标记中图分类号：Ｒ７３５．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８５７８（２０１２）０８－０９２３－０４０　引言关于结直肠癌发生、发展、转移复发相关的机制研究仍处于探索阶段。

将蛋白质组学技术应用于结直肠癌的研究中，可以直接从蛋白质的整体水平入手，通过对比肿瘤组织与正常组织、结肠腺瘤和肝转移病灶的蛋白质组，寻找到相互之间表达差异的蛋白质。

再对这些差异性蛋白进行深入地研究，可为寻找肿瘤的特异性诊断标志物、进一步探究肿瘤的发病机制以及寻找治疗肿瘤的分子靶点奠定一定的研究基础。

１　资料和方法１．１　一般资料连续选取北京大学人民医院２００９年９月—２００９年１０月间经病理证实的结直肠癌原发灶组织及距肿瘤组织边缘５　ｃｍ以上的正常黏膜组织２０·３２９·肿瘤防治研究２０１２年第３９卷第８期对；门诊活检所取的结直肠绒毛状腺瘤组织２０例；结直肠癌肝转移灶组织８例。

１．２　免疫组织化学染色、激光捕获显微切割待切组织标本从－８０℃冰箱取出后，于－２０℃冰冻切片机中连续切片，厚度１０μｍ，贴于专用薄膜载片进行ＨＥ染色，同时每例标本留一张切片进行普通ＨＥ染色用于切割靶细胞的定位。

将制备好的冰冻切片放于激光切割仪的显微镜下，按最大捕获效率设定参数：激光束能量（ｂｅａｍ　ｐｏｗｅｒ）９０　ｍＷ；激光束直径（ｂｅａｍ　ｄｉａｍｅｔｅｒ）６０μｍ，激光脉冲时间（ｐｕｌｓｅ　ｄｕｒａｔｉｏｎ）为１．６　ｍｓ。

对照ＨＥ染色结果选定需切割区域进行激光切割，见图１。

切割时间控制在３０　ｍｉｎ内以防蛋白降解。

每个样本获取（１～２）×１０５个细胞，将不同的样品按对应组别等量混合（正常黏膜、腺癌、绒毛状腺瘤及肝转移灶组），置于－８０℃冻存。

Ａ１～Ａ３：ｎｏｒｍａｌ　ｍｕｃｏｓａ；Ｂ１～Ｂ３：ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｃ１～Ｃ３：ｖｉｌｌｏｕｓ　ａｄｅｎｏｍａｓ；１：ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ；２：ｂｅｆｏｒｅ　ＬＣＭ；３：ａｆｔｅｒＬＣＭ；ＬＣＭ：ｌａｓｅｒ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ图１　拟行ＬＣＭ的结直肠黏膜、腺癌及绒毛状腺瘤ＨＥ染色图（×１００）Ｆｉｇｕｒｅ　１　ＨＥ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｏｆ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｍｕｃｏｓａ，ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ａｎｄ　ｖｉｌｌｏｕｓ　ａｄｅｎｏｍａ　ｒｅａｄｙ　ｆｏｒ　ＬＣＭ（×１００）１．３　蛋白提取乙酰化稳定同位素标记样品蛋白提取及Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质浓度；然后按Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司提供的方案配置１２％分离胶和５％积层胶，常规灌胶、凝固、加热，腺癌分成３份分别与正常黏膜、绒毛状腺瘤及肝转移灶配对平行电泳，见图２。

每孔上样２０μｇ总蛋白，２００　Ｖ稳压，６０　ｍｉｎ；提取蛋白质胶内酶切肽段，然后将肽段行加入胍基化和乙酰化修饰，以不同稳定同位素标记，腺癌样品肽段溶液加ｄ０－乙酸酐，其他样品的肽段溶液加ｄ６－乙酸酐，然后按对应条带混合，共三组（腺癌／正常，腺癌／腺瘤，腺癌／肝转移灶）３０个样品，１Ｍ　ＮａＯＨ去除酯键，脱盐离心干燥。

Ｔ：ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（ｃｏｎｓｕｌｔ）；Ｎ：ｎｏｒｍａｌ　ｍｕｃｏｓａ；Ａ：ａｄｅｎｏｍａ；Ｍ：ｌｉｖｅｒ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ图２　ＬＣＭ获取样品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离（胶浓度１２％，上样量２０μｇ）Ｆｉｇｕｒｅ　２　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｓａｍｐｌｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ＬＣＭ（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｇｅｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１２％，ｓａｍｐｌｅ　ｖｏｌｕｍｅ　２０μｇ）１．４　液相色谱分离及质谱分析Ａｇｉｌｌｅｎｔ　１１００纳升级一维反相毛细管液相色谱分离：由自动上样器上样，上样体积为３０μｌ，上样流速为１０μｌ／ｍｉｎ；色谱洗脱在二元泵系统上进行，洗脱下来的组分经过ＥＳＩ离子源直接进入质谱，液相色谱条件为：流动相Ａ：０．１％ＦＡ～９８％水溶液；流动相Ｂ：０．１％ＦＡ～８０％ＡＣＮ溶液。

洗脱条件：５０　ｍｉｎ，流动相比例由１０％Ｂ线性升至５０％Ｂ；１０·４２９·肿瘤防治研究２０１２年第３９卷第８期ｍｉｎ，流动相比例由４０％Ｂ线性升至１００％Ｂ；维持５ｍｉｎ后，以１００％流动相Ａ平衡色谱柱１０　ｍｉｎ。

流动相流速为３００　ｎｌ／ｍｉｎ。

质谱分析：傅立叶变换离子回旋共振质谱仪ＦＴ用来进行数据采集。

１．５　数据检索采集的原始Ｒａｗ文件首先通过ＢｉｏＷｏｒｋｅｒｓ３．２软件转换为ｄｔａ文件，然后通过脚本程序ｍｅｒｇｅ．ｐｌ将ｄｔａ文件合并成ｍｇｆ文件。

使用Ｍａｓ－ｃｏｔ（版本１．９）检索合并好的ｍｇｆ文件，检索数据库为人ＩＰＩ　３．２３，检索肽段可靠度设置为９５％，检索参数：氢代乙酰化（＋４２．０１０６　Ｄａ）和氘代乙酰化（＋４５．０２９４　Ｄａ）设置为固定修饰，赖氨酸的胍基化修饰（＋４２．０２１８　Ｄａ）和半胱氨酸的烷基化修饰（＋５７．０２１４　Ｄａ）设置为固定修饰。

蛋白酶为胰蛋白酶，酶切方式为全酶切，最大漏切位点为２个，一级母离子误差１０　ｐｐｍ，二级碎片离子误差１．２　Ｄａ。